食品微生物检验技术笔记.doc

食品微生物检验 是应用微生物学及其相关学科的理论和方法，研究外界环境和食品中微生物的种类、数量、性质、活动规律、对人和动物健康的影响及其检测方法与指标的一门学科。食品微生物检验的意义1、是衡量食品卫生质量的重要指标，也是判定被检食品能否食用的科学依据。2、可以判断食品加工环境及食品卫生的情况，为卫生管理工作提供科学依据.。3、可以有效地防止或减少食物中毒和人畜共患病的发生。4、保证产品的质量，避免不必要的损失。食品微生物检验是食品质量监测的重要组成部分。食品微生物检验的范围1、生产环境的检验 ：车间用水、空气、地面、墙壁等中的微生物检验。2、原辅料的检验 ：包括食用动物、谷物、添加剂等一切原辅材料的检验。3、食品加工、储藏、销售环节的检验：包括食品从业人员的卫生状况检验、加工工具、运输车辆、包装材料的检验等。 4、食品成品的检验：要的是对出厂食品、可疑食品及食物中毒食品的检验。菌落总数的概念：食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每mL(g)检样中形成的微生物菌落总数。（菌落总数(total colony number)：通过平板菌落计数的方法，对被检样品单位重量、容积、面积的活菌在普通营养琼脂平板上形成的菌落进行计数，所得到的所有嗜中温的、需氧和兼性厌氧的细菌菌落总数。是活的细胞总数。）食品中菌落总数检验的意义:1、判定食品被细菌污染的程度及卫生质量。2、预测食品耐存放的程度和期限。3、及时反映食品加工过程是否符合卫生要求，为被检食品卫生学评价提供依据。4、通常认为，食品中细菌数量越多，则可考虑致病菌污染的可能性越大，菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。 菌落总数测定的卫生学意义：1、食品本身的新鲜程度2、加工、贮存运输过程中是否受到污染卫生质量3、卫生学指标：必须配合大肠菌群的检验和其他病原菌项目的检验，才能作出比较全面准确的评定大肠菌群是指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是根据卫生学方面的要求，提出的与粪便污染有关的细菌，即作为食品、水体等是否受过人畜粪便污染的指示菌。包括大肠艾希氏菌属（俗称大肠杆菌）、弗氏柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属等食品中大肠菌群检验的意义：作为粪便污染食品的指标菌，同时大肠菌群数的高低，表明粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。 作为肠道致病菌污染食品的指标菌。食品污染大肠杆菌的数目是采 用相当于100g或100ml食品中的近似值来表示，称大肠菌群近似值(Maximun Probable N umber,MPN)。食品卫生标准规定，任何食品中均不得检出致病菌。食品中微生物的污染和途径内源性：外源性：一、通过水污染 二、通过空气污染 三、通过人及动物污染 四、通过用具及杂物污染食品中微生物的消长：加工前、加工过程中和加工后三个阶段食品微生物污染的控制1、加热杀菌：常压杀菌、加压杀菌、超高温瞬时杀菌、微波杀菌、红外线杀菌、欧姆杀菌2、非加热杀菌：辐照杀菌、超声波杀菌、高压放电杀菌、高压杀菌食品检验样品采集的原则：1、所采样品应具有代表性每批食品应随机抽取一定数量的样品，再生产过程中，再不同时间内各取少量样品予以混合。固体或半固体的食品应从表层、中层和底层、中间和四周等不同部位取样。2、采样必须符合无菌操作的要求，防止一切外来污染一件用具只能用于一个样品，防止交叉污染。3、再保存和运送过程中应保证样品中微生物的状态不发生变化采集的非冷冻食品一般在05度冷藏，不能冷藏的食品立即检验。一般在36h内进行检验。4、采样标签应完整、清楚每件样品的标签须标记清楚，尽可能提供详尽的资料。在食品的检验中，所采集的样品必须具有代表性，即所取样品能够代表食物的所有部分。如果采集的样品没有代表性，即使一系列检验工作非常精密、准确，其结果也毫无价值，甚至会出现错误的结论。采用什么样的取样方案主要取决于检验的目的，目的不同，取样的方案也不同。小样又称为检样，一般以25g/25ml为准，用于检验分析。样品的采集与处理方法1、液体食品的采样 将样品充分混匀，用无菌操作开启包装，用100mL无菌注射器抽取，注入无菌盛样容器。2、半固体食品的采样 用无菌操作拆开样品包装，用无菌勺子从几个部位挖取样品，注入无菌盛样容器。3、固体样品的采样 大块整体食品应用无菌刀具和镊子从不同部位割取，割取时应兼顾表面与深度，注意样品的代表性；小块大包装食品应从不同部位的小块上切取样品，注入无菌盛样容器。样品是固体粉末，应边取边混合。4、冷冻食品的采样 大包装小块冷冻食品的采样按小块个体采取；大块冷冻食品可以用无菌刀从不同部位削取样品或用无菌小手锯从冰块上锯取样品，也可以用无菌钻头钻取碎样品，注入无菌盛样容器。 固体样品和冷冻食品取样还应注意检验目的，若需检验食品污染情况，可取表层样品；若需检验其品质情况，应再取深部样品。5、生产工序检测采样 车间用水自来水样从车间各水龙头上采取冷却水，汤料从车间容器不同部位用100mL无菌注射器抽取。 车间台面、用具及加工人员手的卫生检测用板孔5cm2 的无菌采样板及5支无菌棉签擦拭25cm2面积。若所采表面干燥，则用无菌稀释液湿润棉签后擦拭，若表面有水，则用干棉签擦拭，擦拭立即将棉签头用无菌剪刀剪入盛样容器。（、食物中毒微生物检验的取样当怀疑发生食物中毒时，应及时收集可以中毒源食品或餐具等，同时收集病人的呕吐物、粪便或血液等、人畜共患病原微生物检验的取样当怀疑某一动物产品可能带来人畜共患病病原体时，应结合畜禽传染病学的基础知识，采取病原体最集中、最易检出的组织或体液送检验室检验。)采样的标签：采样前后应立即贴上标签，每件样品必须标记清楚（如编号、样品名称、生产单位、生产日期、产品批号、产品数量、存放条件、采样时间、采样人姓名、现场情况）。样品送检的要求：1、要快速运送，不要超过3小时。2、若路途遥远，不需冷冻的样品可15低温下运送；如需保持冷冻状态可放在泡沫塑料隔热箱内。3、要注意防污染、防散漏、防变质。ICMSF采样原则：把所有食品分成三种危害程度：类危害指老人和婴幼儿食品及食用前可能会增加危害的食品。类危害指可立即食用的食品，在食用前危害基本不变。类危害指食用前加热处理，危害减小的食品n 是从一批被检查食品中抽取样品的数量，即取样数。C 是样品检测值超过指标值m的最大可接受抽样单位数，如果超过该值，则拒绝接受该批产品。m是每克样品中相关细菌的合格菌数限量，即指标值。M是附加指标值，用于区分可接受的临界值和不可接受的值。二级抽样方案：设定取样数n，指标值m，超过m值的样品数为c，只要c0则为不合格品。检查检样是否有超过m值的，来判定该批是否合格。以生食海产品鱼为例：n=5，c=0，m=102，n=5即抽样5个，c=0即意味着在该批检样中，未见到有超过m值的检样，此批货物为合格品。三级抽样方案：设定取样数n，指标值m,还有一个额外的参数附加指标值M，以及介于m与M的样品数c，用于区分可接受的临界值和不可接受的值。在任何一个样品中，大于或等于M的值都是不可接受的根据被检测到的微生物的浓度，三级抽样方案将食品分成三级若计数小于m，则可接受。若计数大于m，小于M ，则处于可接受的临界处。若计数大于M ，则不可接受。设有微生物标准m及M值两个限量如同二级法，超过m值的检样，即算为不合格品。其中以m值到M值的范围内的检样数，作为c值，如果在此范围内，即为附加条件合格，超过M值者，则为不合格。例如，检测大肠菌群的抽样方案可以是： n=5, c=2，m=10， M=100意味着有5个样品中有2个样品的大肠菌群含量在10-100之间是可接受的。但是如果有3个样品中大肠菌群的含量在10-100之间则不可接受；或者仅有一个样品的含量超过了100，那么该批次食品不可接受。平板菌落计数的选择1）从培养箱内取出平皿进行菌落计数时，应分别观察同一稀释度的两个平皿和不同稀释度的几个平皿内平板上菌落生长情况。 平行试验的2个平板之间其菌落数应该接近，不同稀释度的几个平板上菌落数则应与检样稀释倍数成反比，即检样稀释倍数越大，菌落数越低，稀释倍数越小，菌落数越高。2）计数菌落时，选取菌落数在30CFU-300CFU之间无蔓延生长的平板进行计数。1个稀释度使用两个平板，应采用两个平板的平均数；如其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘2以代表全皿菌落数；如在一个稀释度的两个平板中，一个平板的菌落数在30一300之间，另一个大于300或小于30时，则以菌落数在30300间的平板作为计数的标准。3）菌落计数所得结果，可分别按以下几种不同情况作报告。(1)若只有1个稀释度的平均菌落数在30300之间，则将该菌落数乘其稀释倍数报告之，如书表71中例1，报告为164102=16400，或1.6104。 (2)若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30300 CFU之间， 按公式计算。 (3)若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之，如书表56中例4，报告为：313108=313000或3.1105。(4)若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告，如表例5，报告为：2710=270或2.7102。(5)若所有稀释度及样品原液均无菌落生长，则以小于l乘以最低稀释倍数报告之，如表56中例6，报告为：l10，或l0。(6)若所有稀释度的平均菌落数均不在30300之间，其中一部分大于300或小于30时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之，如表56中例7，报告为：30510=305或3.1104。菌落总数的报告：菌落数小于100 CFU 时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。菌落数大于或等于100 CFU 时，第3 位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2 位数字，后面用0 代替位数；也可用10 的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。称重取样以CFU/g 为单位报告，体积取样以CFU/mL 为单位报告。注意事项1、如果稀释度大的平板上菌落数反比稀释度小的平板上菌落数高，则系检验工作中发生的差错，属实验室事故。此外，也可能因抑菌剂混入样品中所致，均不可用作检样计数报告的依据。2、必须做空白对照：监测培养基、平皿、稀释液的无菌程度。同时，应在工作台内打开一块空白PCA（其暴露时间应与检样时间相当），以了解样品在检验过程中有无受到来自环境的污染。3、水浴和倾注温度：4614、培养条件：一般样品361/48h2h，水产品（指原生态、未加工水301/72h3h5、如样品（干调、面粉、脱水蔬菜）中可能含有在琼脂表面蔓延生长的菌落，可在凝固后的琼脂表面再覆盖一层（4mL）培养基。6、样品稀释液有时会带有细碎的食物颗粒（如奶粉、坚果），为避免这些颗粒与菌落发生混淆，可将样品稀释液与PCA混合，单做培养，置于4放置同样时间，以便在计数时作为对照。菌落总数测定的几点说明：由于检样中采用30/35有氧条件下培养，因而并不是样品中实际的总活菌数，一些特殊营养要求的细菌、厌氧菌、微需氧菌、以及非嗜中温细菌，均难以反映出来。鉴于食品检样中的细菌细胞是以单个、成双、链状、葡萄状或成堆的形式存在，因而在平板上出现的菌落可以来源于细胞块，也可以来源于单个细胞，因而平板上所得菌落的数字不应报告菌数，而应以单位重量、容积或表面积内的菌落数或菌落形成单位（colony forming units，CFU）报告。问题：1、什么是菌落总数？ 2、测定食品、饮料等产品的菌落总数有 什么意义？ 3、画出平板倾注法测定菌落总数的示意图。 4、在测定菌落总数时，如何选择菌落进行计数？ 5、在菌落总数的检验中，要注意哪些事项？ 6、在菌落总数的检验中，如何根据样品的特性选择培养温度和时间？ 大肠菌群的定义：一群在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。意义该菌主要来源于人畜粪便，作为粪便污染指标评价食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能。这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。根据进一步的生化鉴定试验，可将大肠菌群细分为大肠埃希氏菌（俗称大肠杆菌）、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。大肠菌群的生物学特性：1、形态与染色：革兰氏染色阴性，无芽胞杆菌。 2、发酵乳糖：产酸产气 3、培养特性：在琼脂上的典型菌落呈深紫黑色或中心深紫色，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，常有金属光泽； 在麦康凯琼脂上的典型菌落呈桃红色或中心桃红、圆形，扁平，光滑湿润。麦康凯平板的原理：利用胆盐来抑制革兰阳性细菌的生长，利用乳糖发酵，中性红的颜色可把分解乳糖和不分解乳糖的细菌区别开沙门菌及志贺菌呈无色菌落，大肠埃希菌呈桃红色菌落供肠道致病菌的分离培养和非发酵细菌鉴别用。 糖发酵实验原理： 多糖 单糖 丙酮酸 酸性产物(或产酸产气) pH 指示剂呈酸性变色(若产气者有气泡出现)培养基：糖发酵管、半固体发酵管、微量发酵管指示剂：酚红、溴甲酚紫等结果：培养基呈酸性变色应用：观察细菌对糖度的 分解情况，常用于肠道杆菌的鉴定原理：细菌分解糖类是依靠细菌细胞所产生的各种酶类的作用，细菌产生的分解糖类的酶，随细菌种类不同而异，可以此来鉴别细菌。乳糖是双糖，细菌分解双糖的酶大多是胞外酶。乳糖被乳糖酶水解成葡萄糖和半乳糖，葡萄糖可直接被细菌利用，而半乳糖则需在细胞内转化为葡萄糖后再被利用。糖发酵试验主要是测定细菌分解糖类以后所产生的酸，以培基基pH降低(指示剂变色)作为观察结果的指标。 MPN检索表： MPN 为最大可能数(Most Probable Number)的简称。这种方法，对样品进行连续系列稀释，加入培养基进行培养，从规定的反应呈阳性管数的出现率，用概率论来推算样品中菌数最近似的数值。MPN检索表只给了三个稀释度，如改用不同的稀释度，则表内数字应相应降低或增加10倍。3 、平板菌落数的选择选取菌落数在15 CFU150 CFU 之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5 mm 或更大。4、 证实试验从VRBA 平板上挑取10 个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB 肉汤管内，36 1 培养24 h48 h，观察产气情况。凡BGLB 肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。5、大肠菌群平板计数的报告经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以3、中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g （mL）样品中大肠菌群数。例：10-4样品稀释液1 mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：1006/10104/g（mL）=6.0105CFU/g（mL）。MPN测定法：适用于检测认为带有大量竞争菌的食品及其原料和未经处理的食品中的少量金黄色葡萄球菌。1、选三个连续稀释度，从每个稀释度分别取1mL稀释样品液，接种3管含10氯化钠胰蛋白胨大豆肉汤培养基。样品的最高稀释度必须达到能获得阴性终点，置361培养48h。2、用3mm接种环，从有细菌生长的各管中移取1环，划线接种于有面干燥的Baird-Parker琼脂平板，置361培养4548h。3、从有细菌生长的每一平板上至少挑取1个可疑金黄色葡萄球菌菌落见附录B（参考件），移种到肉汤培养基中，置361培养2024h。4、取肉汤培养物0.3mL同0.5mL凝固酶试验兔血浆于8mm100mm试管内充分混合，置361培养，定时观察是否有凝块形成，至少观察6h，以内容物完全凝固，使试管倒置或倾斜时不流动者为阳性。试验中需同时做已知阳性和阴性对照。对可疑结果，应进行革兰氏染色、镜检和其他辅助试验如耐热核酸酶试验见附录C（补充件）等加以证实。5、报告结果根据凝固酶试验结果查最近似值（MPN）表，报告金黄色葡萄球菌的MPNg（mL）。思考题1：金黄色葡萄球菌可产生哪些毒素和酶？2：金黄色葡萄球菌在B-P平板上的菌落特征如何，说明其原理。3：金黄色葡萄球菌在血平板上的菌落特征如何，说明其原理。4：确认葡萄球菌为金黄色葡萄球菌的依据至少应包括哪几个试验？5：金黄色葡萄球菌的形态与染色、培养特征如何？沙门氏菌属（Salmonella）是一大群寄生于人类和动物肠道内生化反应和抗原构造相似的革兰氏阴性杆菌统称为沙门氏杆菌。鉴别培养基（麦康凯、SS、伊红美兰）：一般呈无色菌落三糖铁琼脂斜面：斜面为红色，底部变黑并产气。生化特性：1、发酵葡萄糖、麦芽糖、甘露醇，山梨醇产酸产气（伤寒鸡伤寒沙门氏菌少数不产气）。 2、不发酵乳糖，蔗糖，侧金黄花醇。 3、多数产生H2S（+），不产靛基质（吲哚）（-），不分解尿素（-），V-P试验（-）。4、能还原硝酸盐为亚硝酸盐（+）。 5、在KCN培养基中生长呈（-），苯丙氨酸脱氨酶为（-）。靛基质试剂：1、 柯凡克试剂：将5 g 对二甲氨基甲醛溶解于75 mL 戊醇中,然后缓慢加入浓盐酸25 mL。2 、欧-波试剂：将1 g 对二甲氨基苯甲醛溶解于95 mL95乙醇内。然后缓慢加入浓盐酸20mL。3 、试验方法挑取小量培养物接种,在36 1 培养1 d2 d，必要时可培养4 d5 d。加入柯凡克试剂约0.5 mL，轻摇试管,阳性者于试剂层呈深红色；或加入欧-波试剂约0.5 mL，沿管壁流下，覆盖于培养液表面,阳性者于液面接触处呈玫瑰红色。注：蛋白胨中应含有丰富的色氯酸。每批蛋白胨买来后，应先用已知菌种鉴定后方可使用。三糖铁（TSI）琼脂试验：试验方法：以接种针挑取待试菌可疑菌落或纯培养物，穿刺接种并涂布于斜面，置361培养1824h，观察结果。本试验可同时观察乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气（变黄）；产生硫化氢（变黑）。葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍保持黄色。硫化氢（H2S）试验有些细菌可分解培养基中含硫氨基酸或含硫化合物，而产生硫化氢气体，硫化氢遇铅盐或低铁盐可生成黑色沉淀物。试验方法：在含有硫代硫酸钠等指示剂的培养基中，沿管壁穿刺接种，于361培养2428h，培养基呈黑色为阳性。阴性应继续培养至6天。 （致病性：首先沙门氏菌经口进入人体以后，在肠道内大量繁殖，经淋巴系统进入血液，造成菌血症，即感染过程。随后，沙门氏菌在肠道和血液中受到机体的抵抗而被裂解、破坏，释放大量内毒素，使人体中毒，出现中毒症状。）沙门氏菌检验基本步骤 检样前增菌增菌分离培养生化试验初步鉴定血清学反应最后鉴定报告 操作步骤1、前增菌（目的：使处于濒死状态的M恢复活力）称取25 g（mL）样品放入盛有225 mL BPW 的无菌均质杯中，以8 000 r/min10 000 r/min 均质1 min2 min，或置于盛有225 mL BPW 的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min2 min。若样品为液态，不需要均质，振荡混匀。如需测定pH 值，用1 mol/mL 无菌NaOH 或HCl 调pH 至6.80.2。无菌操作将样品转至500 mL 锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于36 1 培养8 h-18h。如为冷冻产品,应在45 以下不超过15 min,或2 5 不超过18 h 解冻。2、 增菌（目的：使沙门氏菌优势繁殖，其它细菌受到抑制。） 轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1 mL，转种于10 mL TTB 内，于42 1 培养18 h24h。同时，另取1 mL，转种于10 mL SC 内，于36 1 培养18 h24 h。思考题： 1、典型沙门氏菌的五项生化试验结果如何？ 2、沙门氏菌的形态特征，培养特性是什么？ 3、沙门氏菌检验时为什么要进行前增菌和增菌？ 4、沙门氏菌有哪些抗原？各有何特点？O、H抗原如何表示，AF群沙门氏菌中，代表每群O特异性抗原的独特因子是什么？ 5、沙门氏菌哪几个菌型具有Vi抗原，Vi抗原对O抗原血清涟试验有何影响，对含Vi抗原菌，如何做O抗原血清学试验。 6、沙门氏菌在SS平板，TSI培养基上生长的现象如何，说明其原理。 7、分离纯化后怎样选用最少的生化试验方法初步鉴定检验菌是否是沙门氏菌属的细菌。 8、如何进行沙门氏菌的血清学试验。霉菌直接镜检计数法操作步骤1、检样的制备：取定量检样,加蒸馏水稀释至折光指数为1.34471.3460（即浓度为7.9%8.8%），备用。2、显微镜标准视野的校正：将显微镜按放大率90125 倍调节标准视野，使其直径为1.382 mm。3、涂片：洗净郝氏计测玻片，将制好的标准液，用玻璃棒均匀的摊布于计测室，以备观察。4 、观测：将制好之载玻片放于显微镜标准视野下进行霉菌观测，一般每一检样观察50 个视野，同一检样应由两人进行观察。 5、 结果与计算：在标准视野下，发现有霉菌菌丝其长度超过标准视野（1.382mm)的1/6或三根菌丝总长度超过标准视野的1/6（即测微器的一格）时即为阳性（+），否则为阴性（-），按100个视野计，其中发现有霉菌菌丝体存在的视野数，即为霉菌的视野百分数。霉菌和酵母的危害霉菌和酵母广泛分布于自然界并可作为食品中正常菌相的一部分。长期以来，人们利用某些霉菌和酵母加工一些食品，如用霉菌加工干酪和肉，使其味道鲜美；还可利用霉菌和酵母酿酒、制酱；食品、化学、医药等工业都少不了霉菌和酵母。但在某些情况下，霉菌和酵母也可造成食品腐败变质。由于它们生长缓慢和竞争能力不强，故常常在不适于细菌生长的食品中出现，这些食品是pH低、湿度低、含盐和含糖高的食品、低温贮藏的食品，含有抗菌素的食品等 。 由于霉菌和酵母能抵抗热、冷冻，以及抗菌素和辐照等贮藏及保藏技术，它们能转换某些不利于细菌的物质，而促进致病细菌的生长。有些霉菌能够合成有毒代谢产物霉菌毒素。霉菌和酵母往往使食品表面失去色、香、味。例如，酵母在新鲜的和加工的食品中繁殖，可使食品发生难闻的异味，