高效液相色谱法测定食品中的食用合成色素——日落黄.docx

高效液相色谱法测定食品中的食用合成色素日落黄一 实验部分一 实验原理食品中人工合成着色素经聚酰胺吸附法，制备成水溶液，注入高效液相色谱仪，经过反相色谱分离，根据保留时间定性及峰面积比较进行定量。二 实验主要仪器和试剂1. 仪器高效液相色谱仪，带紫外检测器、 0.45um滤膜(1张)、0.5um滤膜（1）、分析天平、量筒1oml(1),250ml(1)、烧杯1000ml(1),300ml(3)、容量瓶250ml(5),5ml(1),100ml(1)、移液管5ml(1)、研钵(1)、温度计100（1）、滴管（1）、电磁炉（1）、G3垂融漏斗（孔径60ml）、PH试纸（114）试剂瓶1000ml(2)2药品乙酸（分析纯）、甲醇（色谱纯经0.5um滤膜过滤）、聚酰胺粉（尼龙6过200目筛）、氨水（分析纯）、甲酸（分析纯）、柠檬酸（分析纯）、无水乙醇（分析纯）、饱和硫酸钠、无离子水、0.2%硫酸钠、乙酸铵（分析纯）、合成着色标准溶液：日落黄 三 仪器工作条件高效液相色谱的工作条件：一般可在室温下进行，采用颗粒极细的固定相，柱内压降很大，流动相黏度很高，需采用高入口压，维持一定的流动相线速。色谱柱：不锈钢柱流动相：甲醇+0.02 mol/L 乙酸铵溶液, 梯度洗脱: 甲醇+0.02 mol/L 乙酸铵溶液 :甲醇20%，乙酸铵80%，05min; 甲醇35%，乙酸铵65%，511min:甲醇98%，乙酸铵2%，1116min；甲醇98%，乙酸铵2%，1617min；甲醇20%，乙酸铵80%，甲醇20%，乙酸铵80%，1730min流速: 1.0 mL/min进样量：10ul紫外吸收检测器：适用于梯度洗脱，对流动相速度变化不敏感，流动相组成的变化对检测其响应几乎无影响，但是只有检测其所提供的波长下有较大吸收的分子才能进行检测，流动相的选择受一定限制，既具有一定紫外吸收的溶剂不能做流动相。每种溶剂都有紫外的截止波长，当小于该截止波长的紫外光通过溶剂时，溶剂的透光率降至百分之十以下，因此监测器的工作波长不能小于溶剂的紫外戒子波长。四 样品的处理1 鲜橙多量取20ml,倒入100ml烧杯中，如含二氧化碳应加热去除2蜜饯类、玉米糖称取10.00g粉碎试样，放入100ml烧杯中，加水30ml，温热溶解，若试样溶液PH较高，用柠檬酸溶液调PH到6左右4色素提取聚酰胺吸附法：试样溶液用柠檬酸水调ph值到6左右。加热至60，用1g聚酰胺粉加水调成粥状，倒入溶液搅拌片刻，用G3垂融漏斗抽滤，用60的ph为4-5的水洗涤3-5次，用甲醇甲酸混合液洗涤3-5次，用水洗至中性，再用乙醇氨水水(7+2+1)混合液解吸3-5次，解吸步骤:每次5ml，合并所有解析滤液与25ml的烧杯中，加热至溶液近干，用乙酸中和后，加高纯水溶解定容至5ml，摇匀，用0.45um滤膜过滤,取10ul进高效液相色谱仪测定。五 溶液的配制1标准溶液的配制合成着色剂标准溶液：准确称取按其纯度折算为日落黄0.100g，倒入烧杯中用PH为6的蒸馏水溶解后，置于100ml容量瓶中，加PH为6的水至刻度，配置成浓度为1.00mg/ml的着色剂水溶液合成着色剂标准使用液：使用前，将上述溶液加蒸馏水稀释20倍，经0.45um滤膜过滤，配成合成色素剂浓度为50.0ug/ml的标准使用液2其他溶液的配制10.02mol/l乙酸铵溶液：称取1.54g乙酸铵加水稀释至1000ml经0.45um滤膜过滤2.氨水：量取氨水2ml加水至100ml混匀3.0.02mol/l氨水乙酸铵溶液：取氨水0.5ml加0.02mol/l乙酸铵溶液至1000ml4.甲醇甲酸溶液：量取甲醇溶液60ml、甲酸溶液40ml混匀5.柠檬酸溶液：称取20g柠檬酸，加水至100ml溶解混均6.无水乙醇氨水水溶液：量取无水乙醇70ml，氨水20ml，水10ml混匀备用7.ph=6的水：无离子水加柠檬酸溶液调ph为6二 结果与讨论一 检测波长的选择在本实验溶剂体系条件下, 经UVD检测器采集的日落黄光谱图可得日落黄的最大吸收波长，则选择max=480mm波长为检测波长二 流动相的选择为确保目标组分与其它组分良好分离的前提条件下, 充分考虑了流动相的成本、毒性和后处理方便等因素选择了甲醇-乙酸（PH为4.0,0.02mol/l）胺为本方法的流动相体系.三 工作曲线绘制标准曲线：取10 L 合成色素标准使用液进行HPLC 分析,测量保留时间和峰面积, 每种浓度测定3 次, 取平均值, 用峰面积和各色素浓度作图, 绘制标准曲线。合成色素日落黄色谱图四 精密度实验精密吸取各试样溶液10ul, 重复进样3次, 记,录各峰的面积五 稳定性试验取各样品溶液, 分别在0、3、6、9 h测定, 记录日落黄的峰面积, 观察样品在9 h内稳定性.六 加标回收试验取处理好的鲜橙多试液4份，其中两份分组准确加入含量为1.00mg/ml:的着色剂