代谢物的结构测定

代谢物的分离和结构测定,体内药分第五专题,代谢物的分离和结构测定,药物代谢（drug metabolites） = 生物转化（biotransformation） 任何药物在体内都有其发挥疗效的时效期，因为大部分药物在体内都会被代谢而失去活性，代谢可以使脂溶性药物转变为水溶性化合物，从而加速药物从体内的排泄。,代谢物的分离和结构测定,药物代谢研究在新药研发中的作用：,代谢研究与创新药物的开发和筛选药物代谢与药物的毒性评价药物代谢研究与代谢相互作用,代谢物的分离和结构测定,体内代谢的一般规律制备代谢物的生物转化方法代谢物的识别与结构鉴定,主要内容：,代谢物的分离和结构测定,肝脏代谢肝外药物代谢药物代谢酶的调节影响药物代谢的因素,代谢的一般规律：,代谢物的分离和结构测定,药物的消除,排泄,原型排泄,代谢,代谢物,代谢的一般规律：,一相代谢（phase）或生物转化，它是指在药物的分子上引入新的基团或除去原有的小基团的官能团反应； 生成可与二相反应的官能团：-OH,-COOH,-NH2,-SH等 二相代谢（phase）或称结合反应，在这相反应中，一些内源性小分子和药物或一相代谢产物结合，生成的结合物极性增加，脂溶性降低，加速药物从体内的排泄。,药物的代谢一般分为两相：,代谢的一般规律：,相代谢反应主要为结合反应，相代谢物是药物排出体内的主要形式。,相代谢,相反应是药物在体内代谢转化的关键性步骤，因为这一步反应常常是药物从体内消除的限速步骤，它可以影响到药物的许多重要的药动学特性，如药物的半衰期、清除率和生物利用度等。,相代谢,肝脏代谢,微粒体酶系主要存在于肝细胞或其他（如小肠黏膜、肾、肾上腺皮质细胞等）的内质网的亲脂膜上。其中最重要的一族存在于肝脏中的氧化酶被称为肝微粒体混合功能氧化酶系统或称单加氧酶。,按细胞分布划分：,微粒体药物代谢酶系,肝脏代谢,非微粒体酶在肝内和血浆、胎盘、肾、肠黏膜及其他组织中均有存在，在体内除与葡萄糖醛酸结合外的其他缩合，以及某些氧化、还原及水解(除酰胺键外)反应均为该酶系所催化。通常凡是结构类似于体内正常物质、脂溶性较小、水溶性较大的药物都由这组酶系代谢。1）细胞浆可溶部分的酶系。2）线粒体中的酶系3）血浆中酶系。,非微粒体酶系,肝脏代谢,肝脏代谢,肝脏是药物的主要代谢部位，代谢也可发生在血浆，胃肠道，肾脏，肺等组织细胞中。药物代谢反应是酶催化反应。代谢酶位于微粒体，内质网，胞液，溶酶体或核膜和胞浆膜中。肝脏是动物体内含代谢酶最丰富的部位。,肝脏代谢,肝细胞的组成示意图,代谢酶主要存在于肝微粒体中，其次是溶酶体及线粒体中,相代谢,一相代谢主要包括的反应类型有氧化，还原和水解。,按常见催化反应类型划分，,相代谢,氧化反应,P450依赖的混合功能氧化酶系,P450依赖的混合功能氧化酶系(MFO)酶的分类酶的结构酶催化的代谢反应,P450依赖的混合功能氧化酶系,CYP后面跟一个数字，表示一个家族，然后是一个字母表示亚族的字母，最后的数字表示基因。,酶的分类：, Guidance ：新药报批时要求酶实验,P450依赖的混合功能氧化酶系,P450依赖的混合功能氧化酶系,1.P450酶是一个多功能的酶系.2.P450酶对底物的结构特异性不强.3.P450酶存在有明显的种属、性别和年龄的差异.4.P450酶具有多型性和多态性.5.P450酶具有可诱导和可抑制性.,P450酶的生物学特性,P450依赖的混合功能氧化酶系,1.CYP450酶的aa一级序列变化多端，但是它们的空间折叠结构在进化过程中始终保持不变，都包含特定的功能域。2.所有CYP450酶中都具有血红蛋白结合位点。3.CYP450酶是血红素-硫醇盐蛋白，最保守的区域与酶的催化功能，和与血红蛋白结合有关。这个区域位于蛋白质的核心.4.超变区通常是aa的膜定位序列或底物识别位点，它的有效的变化可以适应催化反应的进行。5.在所有情况下，底物结构与CYP450核心对形成氢键连接非常重要。,酶的结构,CYP450假定的功能域,P450依赖的混合功能氧化酶系,对应于外界的,反应通式： 1.RH代表可氧化的药物底物，ROH代表羟化代谢物。 2.CYP450是一种耦合脂质盐。耦合状态下，CYP450发挥水解酶的功能；去耦合状态下CYP450发挥高能氧化作用。药物如果在微粒体脂质体的作用下改变了CYP450的耦合-去耦合平衡，就会改变自身的代谢途径和代谢产物,P450依赖的混合功能氧化酶系,酶催化的氧化反应,P450依赖的混合功能氧化酶系,微粒体,P450依赖的混合功能氧化酶系,（二）CYP450催化循环的作用机制,药物在微粒体中氧化的示意图,e-,e-,Drug,P450依赖的混合功能氧化酶系,1.羟化反应,还有如保泰松、卡马西平、布诺芬等药物，羟化位置为苯环的对位上。一般选择在较活泼的位置上。,M.F.O.系统催化的氧化反应,P450依赖的混合功能氧化酶系,2.环氧化反应,P450依赖的混合功能氧化酶系,4.氧化脱氨基反应5.脱卤素反应,P450依赖的混合功能氧化酶系,6.N-氧化反应7.S-氧化反应,丙咪嗪的N-氧化代谢反应,P450依赖的混合功能氧化酶系,M.F.O.系统催化的还原反应,1.偶氮和硝基化合物的还原反应由细胞色素P450催化（或被NADPH-细胞色素C还原酶催化），偶氮化合物的还原反应导致了磺胺类的发现。硝基化合物的还原反应在发生时是分部进行的。,-,P450依赖的混合功能氧化酶系,2.还原化合物能还原成母体有机物。一些氮杂环化合物通过还原会开环，产生不稳定的产物，再进一步重排或水解，产生终产物。,非微粒体混合功能氧化酶系催化的氧化反应,人体内许多与混合功能氧化酶系无关的酶也能氧化药物，这些酶有醇脱氢酶、醛脱氢酶、黄嘌呤氧化酶、胺氧化酶、芳香化酶和烷基肼氧化酶等，它们主要参与内源性物质的代谢。,非微粒体混合功能氧化酶系催化的氧化反应,1.其他氧化酶2.酯酶（参与酯类、酰胺类、肼类和氨基甲酸盐类的水解）3.过氧化物水解酶,醇脱氢酶催化醛氧化的酶 微粒体黄素单氧化酶系（唯一哺乳 动物中的黄素蛋白羟化酶）前列腺素合成酶芳氧化酶烷基肼氧化酶髓过氧化物酶,非微粒体混合功能氧化酶系催化的氧化反应,1.醇脱氢反应2.醛的氧化反应,非微粒体混合功能氧化酶系催化的氧化反应,3.黄嘌呤氧化反应,非微粒体混合功能氧化酶系催化的氧化反应,4.胺氧化反应,非微粒体混合功能氧化酶系催化的氧化反应,5.芳香化反应,还原反应,2.还原反应,还原反应主要针对药物结构中的羰基、羟基、硝基和偶氮基等功能基团进行反应。 通常脂肪族硝基化合物不能被还原，只能脱硝基生成亚硝酸类。,还原反应,水解反应,3.水解反应,一相反应的另一种代谢方式是酯类、酰氨类、肼类和氨基甲酸盐类的水解。它们在正常条件下不水解，缓冲液中也能保持一定的稳定性，只在特点的酶作用下水解。,水解反应,1）酰胺水解反应,非那西丁水解为对乙氧基苯胺,水解反应,2）酯的水解,水解反应,3）肼类和氨基甲酸类的水解,与药物代谢酶相关的内源性物质代谢,1.药物代谢酶具有催化多种不同反应的功能，除了对药物进行生物转化以外，大多数药物代谢酶也参与内源性物质的代谢。类固醇甾体生物合成及代谢在很大程度上依赖于混合功能氧化酶系。 2.尤其注意的是，混合功能氧化酶的活性是由外源化合物刺激的频率和强度决定的，这在一定程度上会影响内源性物质的代谢转化率。因此,化学药物的代谢会引起混合功能氧化酶系统的改变，从而引发高血脂和心血管等疾病。,与药物代谢酶相关的内源性物质代谢,相代谢,第二步称为相代谢反应，药物在这一相反应中与一些内源性的物质（如葡萄糖醛酸、甘氨酸、硫酸等）结合或经甲基化、乙酰化后排出体外。 通常认为一相反应使药物产生或去掉一个基团，从而使二相反应得以发生，因此，二相反应应该是真正的解毒途径。有许多药物可同时发生一相和二相代谢，而不同代谢途径的反应可能会竞争同一底物。另外，也有些药物会经过代谢而被激活。,相代谢,相代谢,相代谢,参与这类反应的酶被称为尿苷-5-二磷酸葡萄糖醛酸转移酶（UTGs）,药物的二相反应及酶系,（一）葡萄糖醛酸结合反应,（一）葡萄糖醛酸结合反应,1.发生部位： ROH，ArOH，RNH2，RNRR, RCONH2，RSH2.结果： 1）极性增大 2） are ionized at physiologic pH (pKa 4) 3）分子量增加176,进一步确证：对代谢物进行处理，使其水解。,（一）葡萄糖醛酸结合反应,具有-OH基团的化合物是最常见的葡萄糖醛酸结合反应的底物，醇、酚、羧酸都可以生成O-葡萄糖醛酸苷，值得注意的是，反应前的-葡萄糖醛酸在结合反应会后变成-葡萄糖醛酸苷。,醚式葡萄糖醛酸苷(稳定)酰基葡萄糖醛酸苷（不稳定）,1.O-葡萄糖醛酸苷,（一）葡萄糖醛酸结合反应,1.酚类,2.醇类,（一）葡萄糖醛酸结合反应,3.羧酸类,（一）葡萄糖醛酸结合反应,芳伯胺、酰胺、叔胺、磺胺等药物生成N-葡萄糖醛酸苷。根据所产生的葡萄糖醛酸结合物的化学结构，N-葡萄糖醛酸结合物的底物可分为形成非季氮化合物的化合物和形成季氮化合物的化合物。 伯胺和许多仲胺的N-葡萄糖醛酸苷不稳定，在温和的酸性条件下就会分解成母体胺和葡萄糖醛酸。 而叔胺形成的季胺葡萄糖醛酸苷容易在温和的碱性条件下水解。,2.N-葡萄糖醛酸苷,（一）葡萄糖醛酸结合反应,1)形成非季氮结合物2)形成季氮结合物,（一）葡萄糖醛酸结合反应,3.S-葡萄糖醛酸苷 巯基在UGTs催化下可与UDPGA形成S-葡萄糖醛酸苷。,葡萄糖醛酸结合物分析方法,正离子模式下中性丢失176 Da,负离子模式下m/z175113裂解途径,相代谢,与葡萄糖醛酸结合反应类似，在该反应，UDP-葡萄糖代替UDP-葡萄糖醛酸，形成O-，N-，S-葡糖苷，但该反应在脊椎动物中较有限。另外，在某些情况下，UDPGA与UDP-木糖苷元或UDP-核糖苷元也可反应生成相应的木糖苷或核糖苷，N-核糖苷最为常见，可不需要酶的催化而形成。,其他糖类结合反应,（二）硫酸化反应,1.在各种外源物质和内源物质，如药物、食品添加剂、甾体、激素、神经递质等的生物转化过程中，是一种重要的结合反应。2.这些反应所形成的硫酸化结合反应产物一般导致其生物活性的下降以及肾排泄能力的提高。在某些情况下，硫酸化也导致活性代谢物的形成，生成具有反应性的亲电子形式或具有治疗活性的形式。3.硫酸化反应需要一个高能的供体3-磷酰苷-5-磷酸硫酸盐（PAPS）药物与PAPS在硫酸转移酶（STs）的同工酶催化下发生硫酸化反应。,（二）硫酸化反应,（二）硫酸化反应,硫酸结合的基团主要是COH, NOH, and NH ，反应易产生饱和现象。与羟基结合的称为硫酸酯，与氨基结合的称为氨基磺酸酯。1）羟基反应2）氨基反应,（二）硫酸化反应,（二）硫酸化反应,硫酸根是良好的离去基团，有时硫酸根结合物为活性代谢物。大多数药物和内源性化合物，能发生葡萄糖醛酸化反应的也能发生硫酸化反应，这就导致了底物在这两种代谢途径上的竞争。由于两个反应的动力学过程及在细胞中PAPS量少于UDPGA，因此一般认为硫酸化在底物低浓度下其主导作用，而葡萄糖醛酸结合在高底物浓度时占主导地位。,1）极性增大 2）分子量增加80,硫酸化反应结果：,硫酸结合物的检测(p-OH-Methamphatamine),Detection of sulfonated conjugates with mass spectrometry. Adoptedfrom Shima et al., J Chromatog B Analyt Technol Biomed life Sci 2005 Oct 28,epub.,（三）甲基化反应,1.甲基化反应主要是与内源性化合物（如组胺和儿茶酚神经递质去甲肾上腺素等）有关，但一些结构与内源性物质相似的外源性化合物也可发生此反应。2.甲基结合物的形成需要一种高能中间体S-腺苷甲硫胺（SAM）作辅因子，甲基基团与带正电荷的硫结合，从而将甲基转移至底物的O、S、N原子上。,（三）甲基化反应,（三）甲基化反应,1.N-甲基化2.O-甲基化,（三）甲基化反应,甲基化反应与其他结合反应不同，它形成了极性较弱的产物，因而是阻碍了药物清除的反应。,3.S-甲基化,（四）乙酰化反应,1.药物中氨基的乙酰化反应最多，其中芳胺基最易发生，脂肪族氨基、羟胺类、肼基、磺酰氨基也能被乙酰化。催化该反应的酶是乙酰转移酶（acetylase），它位于肝的可溶性部分，也见于其他组织中，包括胃肠黏膜组织。 2.反应主要发生在肝的Kupffer细胞而非肝细胞中。反应需要高能分子乙酰辅酶A（AcCoA）作为乙酰基供体。该反应在体内能修饰蛋白质，调节生理功能。,（四）乙酰化反应,（四）乙酰化反应,乙酰化后，药物的水溶性往往降低，如磺胺类药物在乙酰化后，容易在肾析出结晶，引起肾结石，其中尤以磺胺噻唑最明显。,1.羧酸类药物特别是芳香族羧酸能在体内形成辅酶A衍生物，然后再与内源性胺（如氨基酸）形成结合物。因此氨基酸结合反应是N-乙酰化的一种特殊形式。2.可参与氨基酸结合反应的氨基酸有甘氨酸、谷氨酰胺、鸟氨酸、牛磺酸及精氨酸。,（五）氨基酸结合反应,（五）氨基酸结合反应,（六）谷胱甘肽(GSH)结合反应,1.能与谷胱甘肽结合的是一些亲电性化合物包括环氧化物、卤烷、硝基烷、烯烃以及卤代或硝基芳烃。催化谷胱甘肽结合反应的酶为谷胱甘肽-S-转移酶（GSTs），位于肝、肾、肠以及其他组织的细胞液中。2. 谷胱甘肽被看作是机体内的保护性物质，可以清除体内潜在的毒性亲电性化合物。但谷胱甘肽不仅可以解毒，也可以活化药物，甚至可能产生引起毒性的活性物质，如对苯二酚和溴苯，结合后会产生中毒性肾损害。,（六）谷胱甘肽(GSH)结合反应,（六）谷胱甘肽(GSH)结合反应,GSH可与亲电子成分结合形成巯基尿酸结合物，分子量大，具亲水、亲脂两重性，所以从胆汁排出多于尿中。GSH可以结合在饱和碳原子上（置换出Cl、Br、I、SO3、OSO2R、OPO32-等基团），杂原子上（置换出NO2-、CN-等基团），、不饱和基团上（使双键变成单键），应变环的碳原子上（使环开裂）以及活性双键上。1）,（六）谷胱甘肽(GSH)结合反应,2）3）,谷胱甘肽结合物的体内代谢过程,-谷氨酰基转肽酶,二肽酶（半胱氨酸甘氨酸）,裂解酶,乙酰转移酶,Mercapturic acid conjugate(硫醇尿酸结合物),release a free thiol(mainly at kidney),Mercapturic acid,谷胱甘肽结合型代谢物的分析,对于谷胱甘肽结合型代谢物的分析,Bailard 等建议通过中性丢失扫描129 (-谷氨酰基部分) 识别而Baillie 等提出甘氨酸甲基酯(89) 丢失扫描。,相代谢,总结,总结：一相、二相的主要反应酶,相代谢,通过学习，要能学会判断反应发生的类型,不一定能定量。,代谢物反应,发生反应的类型,分子量变化，色谱峰，质谱峰的对比,判断反应发生的位置,通过化合物结构,用NMR确证,药物代谢,高效液相色谱-电喷雾离子阱质谱法鉴定人尿中奥美拉唑代谢物（9个）,奥美拉唑,药物代谢,药物代谢,M1为吡啶5-甲基羟基化代谢物,药物代谢,M2是一种0-脱甲基并与-D-葡萄糖醛酸结合的代谢物,药物代谢,M 3 378,147+2H+,230,羟基的砜型代谢物，但羟基位置暂时不能确定。,药物代谢,M 5 316,147+2H+,M 6 316,133+2H+,182,168,M5为吡啶O-脱甲基的硫醚型代谢物,M6为苯并咪唑环上O-脱甲基的硫醚型代谢物,药物代谢,所以M7为吡啶环上5-甲基羟基化硫醚型代谢物,药物代谢,M 8 396,182,故M8为苯并咪唑环上O-脱甲基的硫醚与硫酸结合的结合型代谢物。,药物代谢,M 9 426,182,所以M9为苯并咪唑环6-H羟化的硫醚与硫酸形成的结合型代谢物。,Effects of drug metabolism:,在代谢过程中，药物一般会逐渐失去活性失活，但前药通过代谢会增加其药理活性活化。也有些药物通过代谢改变了其原有的药理活性，出现了与原来不同的新的药理功能。,通过代谢寻找安全有效新药、前药或代谢物等,Effects of drug metabolism:,Effects of drug metabolism:,毒性、活性降低，药理消失,最常见的下降：,毒性、活性等降低但未消失,Effects of drug metabolism:,Effects of drug metabolism:,1,形成活性代谢物：,代谢物活性原药,Effects of drug metabolism:,1.,Effects of drug metabolism:,活性改变,Effects of drug metabolism:,形成毒性代谢物：,肝脏、肾脏、心脏、血液系统等不允许有毒性影响。若有，药物就会被淘汰。,Effects of drug metabolism:,前药的代谢激活：,药物在体内代谢后药物的活性被激活，一般是一相代谢激活。多为化疗药物。不缺活性，需降低毒性。,Eg:,前药的制备是药物结构转化规律的一种成功的应用。提高药物选择性，降药物不良反应。,肝外药物代谢,众所周知肝脏是药物主要的代谢器官。但随着分子生物学如蛋白质分离纯化技术、免疫抗体标记及cDNA技术的发展和应用，越来越多的药物代谢酶在肝外组织和器官中被发现.,肝外药物代谢,肝外药物代谢,随着药物代谢研究的不断深入，人们逐渐发现有些药物的代谢在肝内及肝外均有代谢,如氨基比林、红霉素、环磷酰胺和阿糖胞苷等；而有些药物的部分代谢过程仅在肝外的特定组织进行，如维生素D3的1位羟化仅于肾脏中进行。 肝外药酶种类很多，但其中主要为 P450 酶、转移酶、结合酶和脱氢酶四大类。,肝外药物代谢,药物肠代谢 药物的肾代谢 药物的肺代谢 药物的脑代谢,药物肝外代谢的主要部位：,药物肠代谢,1.主要酶类： CYP3A 葡萄糖醛酸转移酶 硫酸转移酶、乙酰转移酶 儿茶酚氧位甲基转移酶、酯酶、羟化酶等2.肠道代谢的特点：1）肠中主要形成结合产物。在结合反应中主要是形成硫酸结合物和葡萄糖醛酸结合物，肠粘膜药物代谢多具有解毒性质。2）药物的肠代谢（包括相代谢和相代谢）常常导致首关效应，使药物的生物利用度降低。3）肠粘膜药物代谢酶具有饱和性和可诱导性。,药物肠代谢：,药物肠代谢,First-pass effect,药物肾代谢,1.主要酶类： 肾中的一相代谢酶含量和活性均明显低于肝脏药酶，所以药物在肾脏中的 I 相代谢处于次要地位。主要是相代谢酶。2.肾脏代谢的特点： 1）肾脏是机体重要的排泄器官，药物进入机体后，以原形或代谢物经肾排泄。药物在肾中的代谢研究促进了药物靶向性组织分布系统的发展，药物靶向性的组织分布避免了药物的一些副作用。 2）此外，药物在肾中代谢后，可以使其排泄和重吸收发生改变。由于肾脏是药物的主要消除器官，肾功能的改变将会直接影响到药物经肾脏的代谢和排泄。,药物肾代谢,药物的肺代谢,1.肺中重要的药物代谢酶： CYP450（一相中） UGTs 和 STs（二相中） 前列腺素 H 合成酶(PHS)2.肺代谢的特点1）肺是化学异物(包括药物)通过呼吸进入体内的主要门户，既可与空气中环境化学异物接触，又可与体循环中化学物质相接触。2）代谢主要取决于该类细胞对药物及化学异物的处置能力或失活的能力。3）肺中的代谢是有限的，目前已知只有为数不多的药物如茶碱可以在肺中代谢。,药物的肺代谢,药物的脑代谢,1.脑中主要的代谢酶： 脑中也存在一些重要的相和相代谢酶。2.脑代谢的特点：1）血脑屏障可看成是一种生物膜，允许许多亲酯化合物通过，但不允许亲水性分子通过，这种原理在两边都是适用的。因此脑内水溶性代谢物的形成将导致代谢物在脑中的消除半衰期的延长。脑外亲酯性药物不易进入发挥作用。 2）脑中 P450 酶的同工酶可被苯巴比妥、 3-甲基胆蒽等诱导。3）脑中微粒体 P450酶和线粒体 P450酶都参与异物的代谢，且脑中线粒体P450酶的含量明显高于微粒体中 P450酶含量。4）由于酶量少，血脑屏障等原因，只有为数不多的可以进入到脑中的药物有可能在脑中被代谢。,药物的脑代谢,肝外药物代谢,除了上述的组织和器官外血浆、胎盘、皮肤、眼和脾脏中也存在一些药物代谢酶，因此药物在这些组织和器官也可进行代谢，但目前对于药物在这些组织和器官中的代谢了解甚少。,其他组织中的药物代谢,药物代谢酶的调节,1.药物代谢酶的诱导2.药物代谢酶的抑制,药物代谢酶的调节,药物代谢酶的调节,1.目前临床上使用的很多药物具有酶的诱导作用，一些药物能加快自身的代谢，一些药物能加快其他药物的代谢，还有一些药物既能加快自身代谢又能加快其他药物的代谢。,临床常见的酶诱导剂,药物代谢酶的诱导：,药物代谢酶的调节,2.外源物对代谢酶的诱导1）外源物对CYP的诱导： 肝脏富集大量的药物代谢酶，外源物对酶的诱导作用主要发生在肝脏组织，外源物对CYP的诱导作用通常具有组织特异性并呈剂量依赖性，当去除外源物后，诱导效应可被逆转。肝外组织中的许多CYP同工酶可以被药物和其他化学物质诱导，此外，这些代谢酶还同时受到内源性化合物和激素的调控。2）外源物对其他药物代谢酶的诱导： 相比CYP，对其他药物代谢酶的诱导剂的特异性相对较差，常通过引起肝脏内质网膜的增生或者药物代谢酶活性的提过发挥诱导作用。,药物代谢酶的调节,药物代谢酶的抑制：1.一种药物代谢酶具有广泛的底物谱，如CYP可同时代谢多种底物同时存在时，就可能出现竞争，达到一种药物抑制其他药物的代谢，这里可以是竞争性的，也可以是非竞争性的抑制。2.外源物通过破坏肝脏CYP抑制药物代谢。许多药物和环境污染物能够通过多种途径破坏肝脏中的CYP，有的化合物本身是无活性的，需要CYP的代谢激活，因此，这类化合物被归为血红蛋白的“自杀性底物”，有的通过与肝脏CYP形成无活性的复合物来抑制药物代谢。3.金属离子对药物代谢的抑制作用。金属离子能广泛抑制功能性氧化酶的活性，特别是钴离子。其对血红蛋白形成的关键酶有抑制作用。4.此外一些核受体也能对药物代谢酶进行调控。,药物代谢酶的调节,给药途径对药物代谢的影响 给药剂量和剂型对代谢的影响 药物代谢的立体选择性对药物代谢的影响 酶抑制和诱导作用对药物代谢的影响 体内外因素对药物代谢的影响,影响药物代谢的因素,药物代谢酶的调节,同一药物由于给药途径不同可影响药物的代谢过程，从而使药理效应受到影响。如特布他林静脉注射后硫酸结合物占尿中总排泄量的10 % 20 %，而口服给药后占70 %左右，这是因为药物经肠黏膜吸收时形成了硫酸结合物。 给药途径和方法所产生的代谢过程的差异主要与药物代谢酶在体内的分布以及局部器官和组织的血流量有关。肝脏和胃肠道存在有众多药物代谢酶，口服药物的“首过效应”明显，因此“首过效应”是导致体内代谢差异的主要因素。,给药途径对药物代谢的影响,药物代谢酶的调节,（一） 剂量对代谢的影响 机体对药物的代谢能力主要取决于体内各种代谢酶的活力和数量。通常药物代谢速度和体内药量成正比，即随着给药剂量的增加而代谢加快。但当剂量增加到一定程度，达到代谢酶的最大代谢能力时，代谢反应会饱和，即代谢速度达最大，不再随剂量增加而增加。导致体内血药浓度异常升高，引起中毒反应。,给药剂量和剂型对代谢的影响,药物代谢酶的调节,（二） 剂型对代谢的影响 相同剂量不同剂型的药物，由于其剂型的差异而导致吸收行为的差别，药物进入体内的程度和速度会不同。结果，药物的代谢行为也会不同。 如口服不同剂型（溶液剂、混悬剂、颗粒剂）的水杨酰胺1g后，测定尿中硫酸结合物的排泄量。结果服用颗粒剂时最多，混悬剂次之，溶液剂最少。因为后两者口服后，所有剂量直接接触到胃肠吸收表面，当吸收面代谢有限的时候，很容易出现饱和现象。而颗粒剂服用后，其药物需要一个溶出过程才能达到吸收面而被逐步吸收，不易出现饱和，最终其硫酸代谢物的量明显增加。,药物代谢酶的调节,临床药品中有许多药物存在光学异构现象。研究表明，不同的异构体具有不同的药理活性和副作用，主要原因可能是体内的酶及药物受体具有立体选择性，因此不同的异构体同样显示出明显的代谢差异。药物的代谢速度和蛋白的结合程度在不同的异构体间是不一致的。,药物代谢的立体选择性对药物代谢的影响,药物代谢酶的调节,一些药物重复应用或与其他药物合并应用后，可促进酶的合成、抑制酶的降解或与代谢酶竞争结合，导致药物代谢发生变化。 代谢变化可分为两种情况：一是某些药物的代谢被另外一些药物所促进（诱导）；另一种是某些药物的代谢被其他药物所抑制。促进代谢的物质称为诱导剂，抑制代谢的物质称为抑制剂。有的药物是自身的诱导剂，对另一药物却可能是抑制剂。如保泰松对洋地黄毒苷等药物的代谢起诱导作用，而对甲苯磺丁脲、苯妥英钠起抑制作用。 此外还有许多化学异物（如毒物、环境污染物、食物及食品添加剂等）也可对肝药酶起到诱导或抑制作用，从而影响到药物的代谢。,酶抑制和诱导作用对药物代谢的影响,药物代谢酶的调节,药物相互作用对药物代谢的影响 药物相互作用对药物代谢的影响主要表现在对肝药酶的诱导作用（enzyme induction)和抑制作用（enzyme inhibition）,药物被抑制时,原药的血药浓度升高,代谢物的血药浓度降低,药物代谢酶的调节,体内因素： 生理学因素： 种属、品系和种族的差异。 年龄 性别 激素 病理因素： 肝脏疾病 非肝性疾病,体内外因素,药物代谢酶的调节,体外因素： 饮食因素： 基本营养物质 饥饿 微量营养物 非营养物质 吸烟、饮酒 环境因素： 放射性物质 污染物 杀虫剂,药物代谢酶的调节,不同种族或同种族不同个体之间体内药物代谢存在先天差异.造成这种代谢差异的原因很多，一般分为遗传学差异和非遗传学差异。 前者主要是由于遗传因素导致代谢酶或活性水平的差异。代谢快者成为快代谢型（extensive metabolizer ,EM),代谢慢者为慢代谢型（poor metabolizer,PM),即呈现代谢的多态性。目前发现药物体内代谢具多态性的主要有乙酰化代谢和氧化代谢（羟化代谢）两种类型。,药物代谢的个体差异性,药物代谢酶的调节,Example (EM and PM)Omeprazole,药物代谢酶的调节,Plasma concentration-time profiles of omeprazole and its metabolites following a single oral 40mg dose,原型药物c-t图中AUC、T（Max）、 C（Max）PM 大于 EM,CYP2C19的代谢产物AUC、T（Max）、 C（Max）PM 大于 EM,PM者更多的是通过CYP3A4途径代谢原药,所以,奥美拉唑在做生物等效性的时候,人群中个体差异极大有时同时服用合格的同一厂家相同剂量的肠溶胶囊时,不同人原药的AUC是2-3倍的关系,药物代谢酶的调节,年龄和性别对药物代谢的影响,药物代谢酶的调节,食物饮料对药物代谢的影响,药物代谢酶的调节,制备代谢物的生物转化方法,体内代谢的一般规律制备代谢物的生物转化方法代谢物的识别与结构鉴定,主要内容：,制备代谢物的生物转化方法,药物代谢研究分为体内法和体外法。 多在动物体完成，特别是与人有相似代谢特征的动物的体内试验。在给药后一定时间内将动物处死取消化道各部分内容物进行分析，可研究药物在胃肠道的代谢过程，而分析尿、粪便、胆汁等则可测定代谢物的结构，并可研究药物的代谢途径和代谢机制。 可短时间获得大量的代谢产物，推断药物代谢途径及参与代谢的酶。由于代谢体系较纯净，易于对代谢物进行分离、提取，可在较短时间内得到明确结果。,制备代谢物的生物转化方法,体内法：,体外法：,相辅相成,药物体外代谢研究,肝微粒体温孵法基因重组酶温孵法肝细胞温孵法离体肝灌流法肝组织切片法 肠道菌群体外温孵法,药物体外代谢研究,药物体外代谢研究,亚细胞水平,肝微粒体温孵法基因重组酶温孵法,相代谢的测定,肝微粒体体外温孵法,1.肝微粒体体外温孵法 肝微粒体体外温孵法是采用制备的肝微粒体（一般采用差速离心法制备）辅以 NADPH 再生系统，在体外模拟生理环境条件进行代谢反应，经过一定时间的反应后，采用 HPLC、HPLC-MS 和 HPLC-MS/MS 测定温孵液中原型药物和其代谢产物，并对代谢产物进行初步的分析和鉴定。 药物的代谢产物的结构鉴定和代谢途径的研究 药酶代谢的相互作用 种属和性别差异、药物的代谢相互作用等方面的研究。,（一） 肝微粒体及重组 P450 酶体外温孵法,肝微粒体体外温孵法,肝微粒体制备流程图,准备：,肝微粒体体外温孵法,一般步骤：,检测分析,动物预处理,肝匀浆制备,微粒体制备,蛋白质含量测定,药物代谢酶辅因子溶液的配制,各种重要药物代谢酶的含量测定或活力测定,终止反应，处理底物与代谢物,温孵,肝微粒体体外温孵法,肝组织匀浆的制备: 为避免酶失活，制备组织匀浆所用到的仪器和试剂都必须事先冷却并放在冰浴中（或4）匀浆时避免过多的泡沫产生，如出现，则说明已有部分蛋白质变性。蛋白质含量的测定： 在对组织匀浆催化药物代谢的能力进行比较时，需测定组织匀浆中蛋白质的含量。蛋白质含量测定的方法常用的用三种，主要是加入一些可与蛋白质结合或反应而显色的物质，然后在一定波长下测定吸收值而测定的。如加入folin-酚或考马斯亮蓝。,肝微粒体体外温孵法,辅助因子的配制： NADPH为许多药物生物转化反应中不可缺少的辅因子，它在这些反应中起到了还原剂的作用，体系中只要NADPH的浓度达1mmol/L时，便可以维持药物代谢反应进行。因为较贵，一般采用再生系统，用枸橼酸或6-磷酸葡萄糖在相应脱氢酶下反应得到。药物代谢酶活性测定： 一些一相、二相反应中重要的酶的活性。如一相中的NADPH-细胞色素-P450还原酶和二相中的葡萄糖醛酸转移酶的活性测定。,肝微粒体体外温孵法,1.大鼠肝微粒体体外温孵法研究CP-199、CP-331(LT1受体的拮抗剂，用于哮喘的治疗)的动力学参数（Vmax及Km），推算出CP-199、CP-331肝脏清除率。结果表明，它们在体外大鼠微粒体温孵组成中发生氧化作用时，雄性大鼠比雌性大鼠表现出较强的亲和性，这一结果比雄性、雌性大鼠中分别静注给药所测的血浆消除率是一致的。体外肝脏清除率与体内血浆清除率具有显著相关性，说明CP-199、CP-331的清除完全是由肝脏代谢的。,运用举例：,肝微粒体体外温孵法,2.对Tegaserod（一种选择性的5-TH4受体）的肝微粒体体外代谢途径结果表明，O-去甲基的Tegaserod是其在肝微粒体代谢中的主要产物；而应用人肝组织切片及小肠组织切片中对该药代谢途径作了研究，通过LC-MS的检测分析，N-葡萄糖醛酸化的Tegaserod为其主要的代谢产物，O-去甲基的Tegaserod未检出。说明肝微粒体与肝组织切片中代谢酶系的组成存在差异，对应于催化不同的代谢途径。,点评,药物体外代谢研究,肝微粒体体外温孵法与其它的体外肝代谢方法相比，具有酶制备技术简单、代谢过程快、结果重现性好、易于大批量操作、便于收集和积累代谢样品供代谢物结构确证研究的优点；但该法所得的结果与体内代谢的一致性方面存在不足，因而其实验结果一般仅用于预测体内代谢情况，尚需体内代谢研究的进一步证实。,药物体外代谢研究,想要考察单个酶的作用，一般常见两种方法：1.肝微粒体体外温孵法，因为其为一个综合酶的作用，可采用针对某种酶的特异性抑制剂，如果加了抑制剂后代谢物浓度下降，可知该药的作用酶即该酶。2. 可运用纯度较高的单一P450同工酶进行研究，比第一种方法更明确，可了解不同代谢产生差异的原因，找出机制与原因。,利用重组P450酶体外温孵法,药物体外代谢研究,基因重组 P450 酶体外温孵法与肝微粒体体外温孵法的主要区别在于酶的制备和纯度。基因重组P450 酶是利用基因工程及细胞工程将调控 P450 酶表达的基因整合到大肠杆菌或昆虫细胞，经细胞培养，表达高水平的 P450 酶，然后经过分离纯化得到纯度较高的单一的 P450 同工酶。,2.重组P450 酶体外温孵法,药物体外代谢研究,基因重组P450酶系对药物-药物相互作用的研究： 利用基因重组的在药物但代谢中发挥主要作用的8种P450酶亚型，在体外评估几种抗真菌药物对其特异性和选择性，结果表明20200mol/L的浓度范围内，CYP2C9, 2C19, 2B6, 3A4均被咪康唑，硫康唑等药物所抑制。因而推断这类药物在体内很可能具有明显的药物相互作用。,Eg:,药物体外代谢研究,肝细胞体外温孵法与肝微粒体法相似，即以制备的肝细胞辅以氧化还原型辅酶，在模拟生理环境条件下进行代谢反应的体系。 肝细胞体外温孵法适于研究蛋白及 mRNA 水平药物代谢酶的诱导和酶活性，在药物代谢酶的诱导研究中占据主导地位，被广泛用于药物间的相互作用研究。但因体外肝细胞活性仅能维持4h，不利于储存和反复使用。,肝细胞体外温孵法,微粒体亚细胞结构，无完整细胞结构，观察不到完整诱导过程。,药物体外代谢研究,Seglen两步灌流法(原位胶原酶灌注法)半原位酶分离法,肝细胞制备方法：,非灌流方法灌流方法,药物体外代谢研究,Seglen两步灌流法,药物体外代谢研究,在两步灌流法的基础上，由一次性输血器替换恒流泵装置，调节至最佳流速。少用灌流液，流程少。,半原位酶分离法：,肝细胞的制备，从第一步起就比较困难，要保护肝脏完好无损，否则灌流时漏出现象。整个试验操作和加药代谢至最好在4h之内，制备后不能冷冻，难度更大。,药物体外代谢研究,肝细胞体外温孵法与肝微粒体法相比，在代谢物生成、体外代谢清除率等方面有许多相似之处，但针对具体药物，两者在代谢物种类、主要代谢物的生成和所反映的药物代谢特性上存在着程度不同的量或质的差异，如肝细胞体外温孵法可做相代谢研究，而肝微粒体法一般不能。,点评,药物体外代谢研究,离体肝灌流法与肝微粒体法、肝细胞体外温孵法比较，一方面保留着完整细胞的天然屏障和营养液的供给，因而能在一段时间内保持肝脏的正常生理活性和生化功能；另一方面，具有离体系统的优点，能够排除其他器官组织的干扰，可控制受试物质的浓度，定量的观察受试物质对肝脏的作用。适合于定量研究药物体外代谢行为和特点。,离体肝灌流法,药物体外代谢研究,Krebs-Henseleit液：Nacl,KCl,KH2PO4,MgSO2,CaCl,NaHCO3,Glucose,EDTA组成，它是一种生理盐溶液，用于保存哺乳动物组织。,药物体外代谢研究,目前肝灌流主要有两种形式：循环型和一过型。循环型在体系上更接近体内循环，灌流液需要量也少。而一过型可以提供大量的灌流液样品，能直接评价外物经肝脏后的损失以及稳态下代谢产物的生成，易于建立剂量反应关系。 灌流途径如下：由门静脉 肝脏 下腔静脉流出，收集流出液进行测定。,药物体外代谢研究,注入葡聚糖Krebs-Henseleit 灌流液,药物体外代谢研究,离体肝灌流可用于研究药物和毒物的代谢以及它们本身的毒性,Eg：,在肝脏中雌激素受体的研究中，长期服用口服避孕药的妇女易出现一些副作用。虽然进行了一些整体动物试验，但不能排除肝外因素的影响，有学者使用离体肝灌流法观察了雌激素（E2）在肝脏与受体结合的情况。 采用循环式灌流法观察大鼠肝细胞浆与肝细胞核内受体与E2的结合两与结合速度。将大鼠分为5组，分别经7.5、15、30、60、90min灌流3H标记E2，灌流结束后测定肝细胞浆与肝细胞核内与E2的结合受体量，并配合薄层层析分析鉴定其代谢产物。结果表明7.5min在细胞浆内即可测得大量E2受体，至15min时达到高峰，以后逐渐下降。并从薄层层析中观察到，雌激素是在转变成2-羟基雌二醇后才移位到核内的。又通过去垂体和假去垂体雌性大鼠的灌流肝的测定，证实肝脏中雌激素受体的活动首垂体-性腺轴的调节。,药物体外代谢研究,与前两法相比：1）保留完整细胞的天然屏障和营养液供给，一段时间内可保持活性。2）离体系统的优点，排除干扰，可控，可定量研究。 毒理学的应用很多，如肝毒性的考察，可以测得很多生理生化方面的指标。,但其对实验设备和技术有一定的要求，一定程度上限制了其应用。,点评,优,缺,药物体外代谢研究,较不同组织器官的代谢差异和代谢的种属差异肝切片不仅完整的保留所有肝脏药酶及各种细胞器的活性，而且保留了细胞与细胞间的联系及一定的细胞间质。因此对某些药物代谢研究来说，使用肝切片技术比使用游离肝细胞孵育或培养更能反应药物在体内生理情况下的真实代谢过程。该法主要用于药物的体外代谢研究，包括相和相代谢，特别适合于比较不同组织器官的代谢差异和代谢的种属差异。,肝切片法,药物体外代谢研究,Krumdieck 组织切片机工作