microRNA在白血病及肿瘤中的研究进展

MicroRNA在肿瘤及白血病中的研究进展,RNA的种类及主要功能,NON-CODING RNA: FORMERLY KNOWN AS “JUNK”,RNA Transcripts,Protein-coding mRNA,Non-coding RNA Transcripts,Regulatory RNAmiRNAsiRNAAnti-sense RNA,snoRNAs,Housekeeping RNAs,tRNArRNAsnRNAtmRNAsRnase P RNAsvRNAsgRNAsMRP RNAsSRP RNAsTelomerase RNA,Transcription/chromatin structure regulatorsTranscriptional regulatorsProtein function modulatorsRNA/Protein localization regulators,MiRNA定义：,微小RNA(microRNA, miRNA)是一种长度约为22-28 nt的非编码小分子RNA，miRNA通过与靶mRNA 3UTR(Untranslated Regions,即非翻译区，是mRNA分子两端的非编码片段)完全或不完全的互补结合，导致靶mRNA降解或翻译抑制，从而调控靶基因的表达，影响细胞增殖、分化和凋亡。它们通过miRNA介导的特异性的基因沉默导致靶mRNA降解及抑制蛋白质的合成调控转录后基因表达水平。miRNA对细胞的增殖、分化和凋亡有重要的调节作用。,MiRNA特征：,MicroRNA是一种长度约为21nt的单链非编码小分子RNA。在进化过程中高度保守。其通过与靶基因序列的3UTR区特异性结合，诱导靶mRNA 降解或阻遏其翻译。MiRNA预计调控超过60%的蛋白编码基因并且参与近乎所有已知的细胞进程。,miRNAs的发现,1993年，miRNA由哈佛大学Victor Ambros和Gary Ruvkun首次发现 (lin-4)2000年，第二个miRNA Let-7 在由哈佛大学博士后 Frank Slack 发现(Ruvkun lab),Victor Ambros,Gary Ruvkun,miRNA的研究思路,miRNA的研究方法,1. miRNA芯片技术,将目前已经克隆的miRNA或潜在miRNA制备成探针固定在尼龙膜或其它固相支持物上，然后与不同组别的总RNA或细胞器RNA杂交，通过信号的强弱比较探讨miRNA 的表达状况。 该方法类似于基因芯片技术，具有高通量、快速等优点，是目前疾病相关miRNA筛选常用的一种技术。,qRT-PCRNorthern Blot原位杂交技术等RNA-seq,miRNA芯片是目前筛选和研究miRNA调控的高通量手段,RNA-seq 是另一种高通量研究方法,RNA-Seq: a revolutionary tool for Transcriptomics，Nature,2009,10:57,有些miRNA具有类似抑癌基因功能，通过转录后负性调控致瘤性靶 基因的表达而发挥生物学功能；有些miRNA具有类似癌基因的作 用，通过下调抑瘤性靶基因的表达而发挥功能。,恶性肿瘤的microRNA结构与表达异常,恶性肿瘤相关性microRNA,如果组织中某种或某些miRNA的表达失常，细胞内许多起重要作用的瘤基因或抑瘤基因就会受到异常调控而表达失常，从而导致肿瘤的发生 。,有些miRNA具有类似抑癌基因功能，通过转录后负性调控致瘤性靶 基因的表达而发挥生物学功能；有些miRNA具有类似癌基因的作 用，通过下调抑瘤性靶基因的表达而发挥功能。,恶性肿瘤的microRNA结构与表达异常,恶性肿瘤相关性microRNA,如果组织中某种或某些miRNA的表达失常，细胞内许多起重要作用的瘤基因或抑瘤基因就会受到异常调控而表达失常，从而导致肿瘤的发生 。,原癌基因与抑癌基因,原癌基因（proto-oncogene ）癌基因(oncogene)Myc抑癌基因(cancer suppressor gene)p53,miR-21 （1）miR-21在乳腺癌、肝癌、脑瘤等多种恶性肿瘤中表达显著上 调，并与乳腺癌等肿瘤的恶性分级呈正相关；（2）miR-21 可能通过抑制其靶基因 TPM1(tropomyosin 1)的表达而促进胶质瘤细胞的增殖。 （3）miR-21通过负调控抑癌基因PTEN的表达，促进肝癌细胞的增殖和侵袭能力 。（4）通过抑制PCD4 (programmed cell death 4) mRNA的翻译效率，抑制MCF-7的增殖。,（一）致瘤性microRNA （onco-miRNA）,在microRNA (miRNA)家族中，有些miRNA具有类似癌基因功能，与肿瘤发生呈正相关，这部分miRNA称为致瘤性miRNA（onco-miRNA），其过表达或持续活化将直接导致肿瘤的发生发展。,let-7 家族 (1) Let-7是2000年由Reinhart等在线虫中发现的一种具有转录后调节作用的miRNA，通过转录后调节lin-47和lin-51的表达而控制线虫向成虫的转变。(2) Ras 是Let-7的直接靶基因，受到let-7家族的负性调控。Ras是 一个膜相关的GTPase信号蛋白，具有调节细胞生长、分化 的功能，是一个重要的瘤基因。(3) 在肺癌、乳腺癌、子宫癌等恶性肿瘤中，let-7家族与这些肿 瘤有关的脆性位点密切相关，在肺癌中其表达下调，是一个 与肺癌预后负相关的抑癌基因。,（二）抑瘤性microRNA (suppressor miRNA),在miRNA 家族中，有些miRNA具有类似抑癌基因功能，与肿瘤发生呈负相关，称为抑癌性miRNA（suppressor miRNA）。抑癌性miRNA的表达下降或者缺失，将直接导致肿瘤的形成。,17,miRNA与肿瘤发生的关系存在两种可能的模式 Caldas, et al.（Nature Medicine 2005） ：1、若miRNA表达上调，其对应抑癌基因表达下调时，则可能导致肿 瘤发生；2、若miRNA表达下调，其对应癌基因表达上调时，同样可能导致肿 瘤发生。,癌症相关 miRNAs 举例,恶性肿瘤microRNA的转录调控异常,（转录因子-microRNA-靶基因”交互作用的分子网络）,1转录因子对microRNA初级转录产物的调控,2. microRNA对靶基因的调控,大部分miRNA具有自己一套独立的顺式作用元件（启动子和增强子序列），受到上游一系列转录因子的调控。类似于蛋白编码基因的转录过程，这些转录因子通过与miRNA的顺式作用元件结合，调节miRNA在转录水平的表达。,miRNAs与其靶基因3-UTR的结合位点并不是完全互补，可以存在短的错配和G-U配对，因此，miRNA调控多个靶基因。同时，同一个靶基因又同时受到多个miRNA的调控。 miR-21 TPM1、PCD4和PTEN ；miR-15，miR-16，miR-181和miR-195 bcl-2,因此，一个转录因子可以调控多个miRNA分子，一个miRNA分子又同时受到多个转录因子的调控；同时，一个miRNA分子能调控多个靶基因，而一个靶基因又同时受到多个miRNA分子的协同调控；它们之间组成了错综复杂的调控网络，实现了对人体生命活动以及疾病发生发展和转归过程的精细调控。,3“转录因子-microRNA-靶基因”构成复杂的分子网络,microRNA与肿瘤的诊断和治疗,肿瘤的分子诊断与治疗是分子医学的重要组成部分，已成为当前肿瘤研究领域的热点。一些具有重要诊断和治疗价值的分子标志物已经在临床上得到了广泛的应用，但由于特异性、敏感性或靶向性等方面的因素，其临床应用仍然受到很大局限 。由于miRNA在肿瘤多阶段发生过程中具有独特的表达特征和生物学功能，miRNA在肿瘤的分子诊断和治疗中具有广泛应用前景。,一、microRNA与肿瘤的诊断,(一) 肿瘤组织特异性表达标志物,miRNA 表达特征来对肿瘤进行分类，并且筛选能对肿瘤进行预后评估的miRNA标记。,Lu等通过对多种组织来源肿瘤组织miRNA（约200个）表达谱进行归类，发现这些结果与肿瘤组织的胚胎来源一致。例如，内皮起源肿瘤，如直肠癌、肝癌、胰腺癌和胃癌等被分成一类，血液系统来源的也被归为一类。而16000个蛋白编码基因的mRNA则不能将其聚在同一类。因此，肿瘤的miRNA表达特征反映了其发育起源，这也与miRNAs 指导组织特异性发育功能相一致。,1. 肿瘤的miRNA表达特征反映了其发育起源,许多的研究通过miRNA芯片技术系统研究了miRNA在胃癌、乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、白血病等肿瘤组织与其正常组织中的差异表达，构建了相应肿瘤组织与正常组织差异miRNA表达谱，筛选出了一些具有临床诊断价值的分子靶标。 如，miR-221、miR-301和miR-376a诊断胰腺癌。,(2) miRNA指导临床肿瘤诊断,（3）miRNA非常稳定,福尔马林固定的石蜡包埋的样品中分离出来，这使得miRNA表达谱特征库的建立成为可能。,(二) 肿瘤血清标志物,血清的获得相对比较简单、对病人创伤少，因此肿瘤血清标志物越来越受到广大医学研究者青睐。,（1）miRNA在血浆和血清中非常稳定，它们被有效保护以避免接触RNases，在严酷的环境条件下仍能保持稳定。（2）miRNA在血浆和血清中稳定性使得其实际值与在病人身上得到的测试值非常吻合。,第一个被发现的血清miRNA标志物是miR-21。Lawrie等人证实，弥漫性大B细胞淋巴瘤病人的血清miR-21水平很高，与淋巴瘤存活率呈负相关，是一个淋巴瘤预后预测的理想分子靶标。,二、microRNA与肿瘤治疗,（1）microRNA (miRNA)具有重要的生物学功能，参与肿瘤 的发生发展； （2）miRNA序列短，操控简单，基因药物容易导入到宿主体 内，从而逆转肿瘤的恶性生物学行为，达到治疗肿瘤的 目的。 （3）根据miRNA的生物学功能，可以从癌基因和抑癌基因的 角度设计针对性药物对肿瘤进行治疗。,针对致瘤性miRNA设计药物： 人工合成的反义寡聚核苷酸-抗miRNA寡聚核苷酸（AMOs）在灭活具有癌基因特性的miRNA表达，逆转肿瘤细