Southern Blot操作流程.doc

Southern Blot 操作流程1、哺乳动物基因组DNA的提取（或用OMEGA试剂盒E.Z.N.A.TMTissue DNA Kit）1、 取约30mg样品，加入600 ul SNET，再加入12 ul（20.2mg/ml）的蛋白酶K，使蛋白酶K的终浓度为400ug/ml；2、 55振荡过夜；3、 加入0.6 ul RNaseA，室温下孵育10 min，后置于65 10 min；4、 加入300 ul Tris饱和酚，288 ul 氯仿和12 ul异戊醇，室温下振荡30 min；5、 17,000 g离心5min，转移上层水相（600 ul）至一新的离心管；6、 加入等体积（600 ul）的异丙醇沉淀DNA，于4下13,250 g离心15 min；7、 小心除去异丙醇，加入1 ml 70%的乙醇。离心5 min后除去乙醇，室温下干燥1520 min；8、 加入100 ul TE，使核酸沉淀溶解。一、 酶切1、 拷贝数的计算哺乳动物基因组全长3.0109个碱基对，按插入基因单拷贝计算如下：2、 酶切体系基因组DNA10 ug10*Buffer10 ul酶(10U/ul)10 ulTotal100 ul3、 混合后置于适宜酶切温度进行酶切反应；4、 对酶切产物进行纯化，用30 ul TE洗脱；5、 制备1%浓度的琼脂糖凝胶（不加EB）；6、 将纯化后的酶切产物敞开盖子于70放置15 min，以除尽残留乙醇和消除酶切后产生的粘性末端；7、 电泳：1v/cm。二、 转膜1、 碱变性：把胶条转移到含碱变性液的器皿中，摇床处理15 min；重复一次；2、 中和：倒出器皿中的碱变性液，加入中和液，摇床处理15 min；重复一次；3、 倒出中和液，加入20SSC，摇床处理15 min；4、 转膜：1） 在一干净的容器中放入一包吸水纸，倒入20SSC，浸湿；2） 放上一张与胶条大小相当的sigma 3M滤纸，倒上一层20SSC，防止产生气泡；3） 将预先剪裁好的尼龙膜放入ddH2O中充分浸润2分钟；4） 小心把胶条铺在滤纸上面，用玻璃棒擀平，赶走气泡；5） 往胶上倒上一层20SSC，将尼龙膜铺在胶条上，再向上倒上一层20SSC；6） 再放上一张与胶条大小相当的sigma 3M滤纸；7） 用保鲜膜把胶条四周封上，在上面压上一包吸水纸，再用一个约250mg的物体压在吸水纸上面；8） 转膜过夜；5、 固定将膜放在用10SSC浸湿的滤纸上面，使含DNA面朝上，放入紫外交联仪中，以1.5J，254n，2.5min的程序将DNA固定在尼龙膜上。三、 杂交1、 标记探针：可用随机引物法或PCR方法标记探针；2、 将尼龙膜有DNA 的一面朝内，卷成筒状放入杂交管中，加入10 ml 经预热至50的DIG Easy Hyb，于50 预杂交30 min；3、 取10 ul经标记的探针，热水浴5 min变性，然后迅速放入冰水混合物中；4、 将变性后的探针加入4 ml预热的 DIG Easy Hyb中，混匀，并防止气泡的产生（气泡会产生背景）；5、 倒出预杂交液，加入含探针的杂交液，杂交4h或过夜。6、 杂交温度的计算Tm=49.82+0.41（%G+C）-（600/I）I=length of hybrid in base pairsTopt= Tm-20 to 25四、 洗膜1、 室温下用W1洗液洗5min，重复一次；2、 68下用W2洗液洗15min，重复一次；3、 将膜用 Washing Buffer浸润5min；4、 2550下，用100ml Blocking Solution孵育30min，保持摇动；5、 2550下，用20ml Antibody Solution孵育30min，保持摇动；6、 用100ml Washing Buffer洗15min，重复一次；7、 用20ml Detection Buffer平衡5min；8、 将膜放入杂交袋中，使含DNA面朝上，滴加1ml CSPD ready-to-use，将杂交袋合上，并赶走气泡，于1525孵育5min；9、 挤出多余的液体，将潮湿的膜置于37孵育10min，以增强发光反应。五、 显影直接用成像系统成像。 DNA提取的溶液配制1.Tris-HCl (1mol/L ；PH 8.0) 用800ml蒸馏水溶解12.1g Tris碱，加浓HCl（约42ml）调PH至8.0，应使溶液冷却至室温后，方可最后调定PH值，加水定容至1L。高压灭菌。*如果溶液出现黄色，应予以丢弃，并使用质量更好的Tris。2.EDTA（0.5 mol/L ；PH 8.0）186.1 g EDTANa2H2O加入800ml水中，用NaOH调节PH至8.0（约需20gNaOH），定容至1L，高压灭菌。*EDTANa需在PH接近8.0时才会溶解。3.NaCl (5 mol/L)292g NaCl加入800ml水中，定容至1L，高压灭菌。4.SDS（20%，m/v）十二烷基磺酸钠200g SDS加入900ml水中，加热到68有助于溶解，定容至1L。*无须灭菌，不要蒸汽高压。5.SNET20 mmol/L Tris-HCl(PH 8.0)5 mmol/L EDTA(PH 8.0)400 mmol/L NaCl 1%(m/v) SDS6.TE(PH 8.0)100 mmol/L Tris-HCl(PH 8.0) 10 mmol/L EDTA(PH 8.0)Southern 缓冲液配制（修正版）1.Washing buffer： 分子量 1L体系 5L体系0.1M 马来酸（116.07）： 11.607g 58.035g0.15M NaCl （58.45）： 8.768g 43.838g用NaOH 调pH至7.5 （20）灭菌0.3% Tween20： 3ml 15ml2.Maleic acid buffer：分子量 1L体系 5L体系0.1M 马来酸（116.07）： 11.607g 58.035g0.15M NaCl （58.45）： 8.768g 43.838g用NaOH 调pH至7.5（20）灭菌3.Detection buffer: 分子量 1L体系 5L体系0.1M TRIS Base（121.14）： 12.114g 60.57g0.1M NaCl （58.45）： 5.845g 29.225g用HCl调pH至9.5（20） 灭菌4. 10% SDS1L 体系SDS溶液 100g SDS用0.45um滤器进行灭菌（不能进行高温灭菌）5. 20*SSC 分子量 1L体系 3M NaCl （58.45）： 175.3g0.3M 柠檬酸钠（294