《CR技术原理》PPT课件.ppt

第五章PCR技术原理 定义 PCR技术又称聚合酶链式反应 polymerasechainreaction 是通过模拟体内DNA复制的方式 在体外选择性地将DNA某个特殊区域扩增出来的技术 PCR技术 PCR概念的提出 1983 KaryMullis 引物 引物 Mullis的构思 DNA聚合酶 DNA聚合酶 Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段 不耐高温 Heat stablepolymeraseisvitaltotheeaseoftheprocess thermusaquaticus TaqDNA多聚酶的发现 1988年Saiki等从温泉 Hotspring 中分离的一株水生嗜热杆菌 thermusaquaticus 中提取到一种耐热DNA聚合酶 此酶具有以下特点 耐高温 在热变性时不会被钝化 不必在每次扩增反应后再加新酶 大大提高了扩增片段特异性和扩增效率 增加了扩增长度 2 0Kb 酶命名为TaqDNA多聚酶 TaqDNAPolymerase 此酶的发现使被PCR广泛应用 在1989年 Science将PCR中的TaqDNA多聚酶命名为当年的风云分子 Moleculeoftheyear 1 PCR技术的基本原理 在微量离心管中 加入适量的缓冲液 微量的模板DNA 四种脱氧单核苷酸 耐热性多聚酶 一对合成DNA的引物 通过高温变性 低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环的反应过程 每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍 一般样品是经过30次循环 最终使基因放大了数百万倍 扩增了特异区段的DNA带 一 PCR技术的基本原理和工作方式 94 变性 50 65 退火 72 延伸 2 PCR反应过程 20 40个PCR循环 1个PCR循环 PCR扩增原理 引物 延伸 延伸 5 5 3 3 变性 退火 变性 退火 模板 单链或双链DNA 引物 16 30bp合成的寡核苷酸 DNA聚合酶 耐热的DNA聚合酶 底物 四种脱氧三磷酸核苷 dNTP dATP dTTP dCTP dGTP Mg2 DNA聚合酶的激活剂 3 PCR基本要素 4 PCR反应程序 94 96 30 3 预变性 使模板DNA充分变性 94 30 变性 50 60 30 1 复性 使引物与模板充分退火 72 n 按1 扩增1kb计算 延伸 72 3 7 总的延伸 使产物延伸完整 4 10 保存 1 复性和延伸温度复性的温度是PCR扩增是否顺利的关键因素 通常在50 60 之间 具体的温度主要由引物的Tm值决定 低于Tm值2 3 延伸温度绝大多数设定为72 如果复性的温度很高 可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度 变成二步法PCR 2 反应时间变性一般使用30秒钟 如果模板的G C含量较高 或直接用细胞做模板 变性时间可适当延长 复性时间有30秒种一般是足够的 延伸时间由扩增产物的大小决定 一般采用1kb用1分钟来保证充足的时间 3 循环次数循环次数主要与模板的起始数量有关 循环数通常为25 35次 平台效应 plateaueffect PCR扩增过程后期出现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象 原因 底物和引物的浓度已经降低 dNTP和DNA聚合酶的稳定性或活性降低 产生的焦磷酸会出现末端产物抑制作用 非特异性产物或引物的二聚体出现非特异性竞争作用 扩增产物自身复性 高浓度扩增产物变性不彻底 4 PCR反应液的配制最后加入DNA聚合酶 早期的PCR仪没有带加热的盖子 要求在反应液上覆盖一层矿物油 防止水分蒸发 热启动 hotstart PCR操作方式可较好解决非特异性扩增的问题 总体积50 100 l 缓冲液 dNTP 底物 引物 模板 DNA聚合酶 5 反应体系 缓冲液 提供合适的PH值和DNA聚合酶的激活剂10mMTris HCl pH8 3 9 0 1 5mMMgCl2 50mMK dNTP 底物 等摩尔浓度的4种dNTP 即dATP dTTP dCTP和dGTP 终浓度一般为200mM 即饱和浓度 dNTP的浓度会影响扩增的产量 特异性和忠实性 引物 1 M L 引物设计的一般原则 长度 至少16bp 通常为18 30bp 更短的引物一般会降低扩增的特异性 但会提高扩增的有效性 引物的解链温度 两个引物之间的Tm值差异最好在2 5 对于小于20个碱基的引物其Tm值可用简易公式计算 即Tm 4 G C 2 A T 对于14 70个核苷酸的引物可用以下公式计算 Tm 81 5 16 6 1g K 0 41 G C 675 N N表示引物的核苷酸数目 K 表示单价离子即钾离子的浓度 避免引物内部或引物之间形成引物二聚体 特别是引物的3 端 G C含量 尽量控制在40 至60 之间 4种碱基的分布应尽可能均匀 尽量避免嘌呤或嘧啶的连续排列 以及T在3 末端的重复排列 引物的3 末端最好是G或C 但不要GC连排 模板 单 双链DNA均可 模板的数量会直接影响扩增的效果 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加 DNA聚合酶 最常用的是TaqDNA聚合酶 最适反应温度75 PfuDNA聚合酶 是目前使用最广泛的具有3 5 外切活性的PCR酶 目前为止错配率最低的高温DNA聚合酶 酶量增加使反应特异性下降 酶量过少影响反应产量 6 PCR技术的特点 1 高度的灵敏性 2 特异性 引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键 引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性 同时尽可能减少非特异性扩增 3 操作简便易行 PCR扩增法 只需要数小时 就可以用电泳法检出1 g基因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列 通常的DNA扩增法是分子克隆法 首先要构建含有目的的基因的载体 然后将它导入细胞后进行扩增 还要用同位索探针进行筛选 这种方法 要经过DNA内切 连接 转化和培养等相关的过程 操作复杂 一般需要数周时间 4 用途广泛 生命学科医学工程遗传工程疾病诊断法医学考古学 1 长片段DNA的PCR扩增常规PCR长度为2kb以下 长片段PCR扩增存在的问题 1 随着扩增片段的延长 扩增效率降低 2 高温会损坏模板DNA和PCR产物 3 高温下其他二价离子的存在会促进DNA的裂解 4 长片段DNA分子的变性比短片段困难 DNA聚合酶与模板DNA的趋近和接合变得困难 5 错配碱基的掺入导致DNA聚合酶的作用不能正常发挥 从而限制产物的长度 二 PCR的类型 改进 1 改进缓冲体系 2 采用混合DNA聚合酶主体使用扩增效率高 延伸能力强的TaqDNA聚合酶 少量使用具有3 5 外切酶活性的高温DNA聚合酶 及时切除不匹配碱基的掺入 2 PCR扩增未知DNA片段1 染色体步查 移 chromosomewalking 是指从生物基因组或基因组文库中的已知序列出发 逐步获得与其相邻的未知序列的核苷酸组成的方法和过程 2 反向PCR inversePCR 一种简单的扩增已知序列周边序列的方法 扩增原理 已知序列 未知序列 未知序列 限制酶 限制酶 连接酶 步骤 首先用已知片段内部没有的限制性内切酶切割模板DNA 再将酶切后的DNA片段连接成环状分子 最后根据已知片段两端的序列设计引物 PCR扩增邻近的DNA片段 3 利用接头的PCR 步骤 1 基因组DNA的限制性内切酶酶切 2 接头与限制性内切酶片段的连接 3 已知序列侧翼未知序列的PCR扩增 利用分别根据已知序列和接头序列设计的引物 4 1 热不对称交错PCR TAIL PCR的基本原理 利用目标序列旁的已知序列设计3个嵌套的特异性引物 简称sp1 sp2 sp3 用它们分别和1个具有低Tm值的短的随机简并引物 arbitrarydegenerateprime AD 约14bp 相组合 根据引物的长短和特异性的差异设计不对称的温度循环 通过分级反应来扩增特异引物 第一次反应包括5次高特异性 1次低特异 10次较低特异性反应和12个热不对称的超级循环 5次高特异性反应 使sp1与已知的序列退火并延伸 增加了目标序列的浓度 1次低特异性的反应使简并引物结合到较多的目标序列上 10次较低特异性反应使2种引物均与模板退火 随后进行12次超级循环 第二次反应则将第一级反应的产物稀释1000倍作为模板 通过10次热不对称的超级循环 使特异性产物被选择地扩增 而非特异产物含量极低 第三次反应又将第二次反应的产物稀释作模板 再设置普通的PCR反应或热不对称超级循环 通过上述3次PCR反应可获得与已知序列邻近的目标序列 sp1 sp2 sp3 随机引物 高浓度引物 低浓度引物 2 不对称PCR 3 与反转录相关的PCR扩增 RT PCR reversetranscriptase PCR RT PCR 又称反转录PCR 是以反转录的cDNA作模板所进行的PCR 可对基因的表达和序列多态性分析 聚合酶 cDNA PCR扩增 AAAnA AAAnA 逆转录酶 反转录 TTTnT cDNA第一链 mRNA 1 cDNA末端的快速扩增 rapidamplificationofcDNAend RACE a 5 RACE GSP3 设计引物 合成cDNA第一链 AP AAAAA AAAAn TTTTT TTTT 5 用RNase降解模板mRNA 纯化cDNA第一链 TTTTT TTTT GSP1 AUAP GSP2 b 3 RACE 特异性引物与接头引物对cDNA的PCR扩增 2 差异显示PCR Differentialdisplayreversetranscriptase PCR DDRT PCR 使用3 端的锚定引物 T12MN 通过反转录过程 可以将整个mRNA群体在cDNA水平上 分成大致相等但序列结构不同的12亚份群体 这一过程叫差异显示反转录 DDRT 锚定引物的通式是oligo dT 12MN M A C G N A C G T共有12种oligo dT 12MN引物 4 PCR产生DNA指纹 1 多重PCR multiplexPCR 设计多对引物 在同一个PCR反应体系中 同时扩增一份DNA样本中几个不同靶区域的DNA片断 这一过程称之为多重PCR 使用随机选择的核苷酸作为PCR反应体系中的引物 在较低的复性温度下 36 进行PCR 由于非特异性引物与模板上的多个位点结合而不是与某一限制性位点特异性结合 因此经过PCR扩增反应后可以产生多个PCR产物 经凝胶电泳可以将上述多个PCR反应产物分离 这样多态性的产物通常称为随机扩增多态性DNA randomampificationpolymorphicDNA RAPD 2 随机扩增多态性 randomampificationpolymorphicDNA RAPD 是针对基因组DNA的限制性酶切片断进行选择性PCR扩增而建立DNA指纹的技术 1 基因组DNA的限制性内切酶酶切 2 与酶切片段末端相对应的 接头与酶切DNA片段的连接 3 含有接头序列和酶切位点序列及延伸序列的 引物对连接产物作PCR扩增 3 扩增片断长度多态性 AFLP amplifiedfragmentlengthpolymorphism GAATTC CAATTG TTAA AATT G AATTC T AAT GAATTCMNV MNVAATT 核心酶切延伸序列位点序列 7 实时定量PCR real timePCR 常规PCR技术 对PCR扩增反应的终产物进行定量及定性分析定量PCR技术 对PCR扩增反应中每一个循环的产物进行定量及定性分析 1 原理 通过特定设计的PCR仪器来实时检测PCR扩增过程中每一轮循环产物的累积数量 可以很好的推算模板的起始浓度 这种工作方式称为实时定量PCR 域值 将荧光信号由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的荧光强度设定为域值 Ct值 荧光信号达到域值所对应的循环次数称为Ct值 定量曲线 可以检测扩增产物的纯度 溶解曲线 SYBR荧光染料 SYBRgreen TaqMan探针发夹型杂交探针 2 荧光标记方式 TaqMan探针工作原理 三