非病毒基因载体.doc

概述定义非病毒载体是利用非病毒的载体材料的物化性质来介导基因的转移。特点非病毒载体具备无传染性，没有载体容量限制，材料来源广泛，化学结构可控制，且易于大量制备，在表达质粒、反义寡核苷酸或反义表达质粒真核细胞的靶向转移中，有着病毒载体不可替代的作用。与病毒载体相比较，具有毒性低、免疫反应低，而且所携带的基因不整合至宿主细胞基因组等优点。然而，非病毒载体的转导效率低，目的基因只能实现瞬间表达，其运送系统的颗粒较大，容易引发免疫反应和被机体所清除。2常用材料脂质体或脂类复合物脂质体包括阳性、中性和阴性脂质体,其中阳性脂质体研究的最为广泛。自从1987年以来, 众多学者相继合成出许多阳离子脂质体。所有的阳离子脂质体的一端皆拥有12条由12 18个碳原子组成的疏水链, 使其在水性介质中形成双层结构, 并包裹DNA;另一端为亲水性的N+, 通过静电力与DNA结合以形成脂质复合物。脂质体或脂质复合物经静脉注射后,很快被血浆清除并在肺组织中积蓄, 蛋白质主要在肺内皮细胞中表达，通常表达时间较短,一般在给药后4 24h即达峰, 1周后消失。因此,阳离子脂质载体在治疗一些肺部疾病如肺代谢性疾病、门脉高压和急性呼吸窘迫综合征等有较好前景。脂质体或脂质复合物也可直接应用于病变 部位以避免静脉给药选择性差的缺点。目前虽然在阳离子脂质体构效关系研究的基础上,合成了一些新的脂质载体, 但离理想的脂质载体还相距较远,其主要困难在于体内外转染条件的差别, 而且转染效果还取决于给药途径。因此, 只有根据实际的临床应用来个性化设计才能获得较为理想的载体, 这无疑给载体的开发带来困难。脂质体或脂质复合物并没有长期安全性报道。阳离子多聚物1、多聚赖氨酸：聚L-赖氨酸和去唾液酸糖蛋白连接的聚合物用于细胞的基因靶向转移, 其基因转染效果较阳离子脂质体差。有研究表明，在有或无靶向配体的情况下，多聚赖氨酸与DNA的聚合物的细胞摄取率和基因转染率都依赖于聚合复合物正电性的存在。2、聚乙烯亚胺( polyethylenimine, PEI) ：PEI阳离子聚合物表面的正电荷与DNA上带负电荷的磷酸基团产生静电作用形成复合物。这种复合物的超分子结构可以描述为一种核-壳结构, 疏水核是部分中和的DNA,外壳则是亲水的阳离子聚合物链段。这种核-壳结构,增加了体系在血液循环中的稳定性, 保护DNA在传递过程中不受DNA酶或巨噬细胞的降解。PEI阳离子聚合物由于其自身具有缓冲容量, 在不需要加入吞噬细胞或溶酶体溶解剂的情况下就显示出较好的基因转染效果。3、树突状聚合物：树突状聚合物系一定Mr 范围的聚酰胺和含磷树状聚合物的末端氨基通过静电力与DNA结合形成的一种阳离子多聚物非病毒基因载体，聚酰胺树状聚合物的酰胺键在水或乙醇中的水解,可 使基因转染率增加50倍, 其原因可能是水解增加了聚合物的柔韧性。故一些可水解的聚酰胺树状聚合物对体内颈动脉的基因转染比支链PEI更有效。壳聚糖载体聚合物壳聚糖作为一种天然阳离子聚合物,通过与DNA以静电方式作用使壳聚糖-DNA体系不被降解, 完全进入细胞。作为基因载体, 壳聚糖具有细胞毒性低、生物相容性好、基因免疫性低和转染效率较高等特点。壳聚糖-DNA复合物按制备方法主要分壳聚糖及其衍生物的DNA复合物、壳聚糖-DNA纳米微球和壳聚糖自聚体 -DNA。有研究表明，壳聚糖的Mr、DNA复合物的N/P值、DNA复合物颗粒大小和对壳聚糖的改性及其改性程度是影响这类DNA复合物对细胞的转染效 率和是否对特定细胞具有靶向性的主要因素。壳聚糖载体对质粒DNA有效的凝聚作用和保护DNA不被核酸酶降解是其它高分子载体无法比拟的。无机纳米粒子载体应 用于基因转运的无机纳米粒子主要包括硅、铁氧化物、碳纳米管、磷酸钙、金属纳米粒子、量子点等。无机纳米粒子主要通过穿过细胞膜将药物或生物分子转运到生 物体中而起到治疗疾病的作用, 其发挥转染功能的大致过程有：首先,将DNA和RNA等基因治疗分子包裹在纳米颗粒之中或吸附在其表面,通过内吞入胞等方式被转运至细胞内并且被释放。其 次,将DNA导入细胞核并发挥功能。但目前没法确定DNA进入细胞核的确切途径,学者们主要倾向于两种主要理论: 一种是纳米粒子在内涵体或细胞质中被溶解, 然后释放DNA转运进核; 另一种是携带DNA的纳米粒子直接到达细胞核表面,然后DNA转运进核。3非病毒载体介导基因治疗需克服的屏障非病毒载体克服的基因转染效率很低。这主要是非病毒载体介导基因治疗需要克服3道屏障：细胞膜、内涵体-溶酶体系统、核膜。要提高非病毒载体基因转染效率，就必须要使载体能有效的跨越细胞膜即增强细胞对复合物的摄取; 其次要保护基因不受内涵体溶酶体系统酸性环境的破坏降解，并能使内涵体溶酶体有效的释放基因; 最后，基因要进入细胞核表达目的蛋白就必须要能有效的跨越核膜。提高细胞对载体-基因复合物的摄取为提高摄取率，就要提高复合物的细胞靶向性，增强与细胞膜的作用。1、连接靶向配体在非病毒载体骨架上接上配体，与相应的细胞表面受体特异性结合，加强复合物的细胞靶向，增加细胞对复合物的摄取，从而增加基因的表达。转铁蛋白是一种内源性的糖蛋白，多数肿瘤细胞过表达转铁蛋白受体，在载体上接入转铁蛋白可提高纳米复合物的癌细胞靶向性，增加细胞对复合物的摄取率从而增强基因的表达。2、载体材料的结构修饰载体材料是携带基因达到靶细胞的运输工具，其结构影响复合物达到靶细胞的效率 通过载体材料的修饰可以改善其溶解性，屏蔽其过多的表面电荷，降低细胞毒性 另外载体材料结构修饰可以更好的包裹基因，保护基因不被破坏，提高细胞靶向性，增强与细胞膜的作用。聚乙二醇(polyethyleneglycol ，PEG ) 是亲水性很强的聚合物，常用来修饰纳米粒载体以改善其水溶性或者屏蔽其表面电荷，但PEG修饰后的纳米粒细胞摄取率很低，这很大程度上限制了PEG在纳米 载体上的运用。为了克服低转染效率问题运用低聚PEG修饰载体，这样可以减小空间位阻有利于细胞的摄取。3、赋予纳米粒“隐形”的特性基因转染效率要高，首先要求纳米粒能有效的集中于靶细胞，增强靶细胞的摄取 但一般的纳米粒粒径较大，进入体循环后很容易被体内的单核细胞吞噬系统 (MPS) 所吞噬，并在网状内皮系统（RES） 中聚集，这使得达到靶细胞的纳米粒的量极少，导致体内转染时效率极低。目前发展的隐形纳米粒具有粒径小，水溶性高的特点，能有效的避免MPS的吞噬，减少 体循环中的降解。而这种隐形作用，主要取决于纳米粒的粒径大小和水溶性纳米粒半径控制在100nm以下，并采用亲水材料修饰形成亲水层，可以避免或者减少 体内单核细胞吞噬系统的吞噬，使其在体循环中存在时间更长，能有效地转运到靶器官或组织。促进载体基因复合物从内涵体溶酶体释放内涵体溶酶体系统的酸性环境往往导致基因的破坏，其中的核酸酶则会导致基因的降解这都使基因转染效率大大下降。 因此，保护基因在内涵体溶酶体系统的完整性和促使基因从该系统中的释放是提高非病毒载体基因转染效率的行之有效的方法。1、加入溶酶体酶倾向剂增加载体基因复合物在内涵体吞噬泡中释放的一种可行措施是在转染时加入溶酶体酶倾向剂，如氯喹。研究显示氯喹能增加基因转染效率可能包括3种机制：缓冲吞噬泡中的；替代复合物中的载体； 改变释放后核酸的生物物理学特性。2、三元复合物载体材料为了提高基因转染的效率可以在原有的纳米载体基因复合物的基础上再接入另一种质子缓冲材料，形成三元复合物，缓冲溶酶体中的酸性环境，提高基因转染效率。由于接入材料的理化性质，在保护基因不受降解同时使基因易于从内涵体溶酶体中释放到细胞质中从而提高转染效率。提高目的基因的跨膜转运基因治疗的第三道屏障是核膜，目的基因能否有效地进入细胞核直接关系到基因的转染效率。非病毒载体介导的基因转染效率不高，主要是外源基因难以有效的导入到细胞核，导致基因在细胞质中被核酸酶降解。核蛋白定位 信号（NLS）是一种富含精氨酸、赖氨酸等碱性氨基酸的短肽，能有效的介导蛋白或者核酸的跨核膜转运。目前常用的NLS有鱼精蛋白，低相对分子质量的鱼精 蛋白，SV40大T蛋白 非病毒载体通过NLS修饰后，不仅可以协助基因的跨核膜转运，同时可以提高细胞摄取率非病毒基因治疗载体的研究进展人类基因组草图的绘制完成及深入研究将为基因治疗打下坚实的基础，基因治疗已成为世界上最活跃的研究领域，基因治疗药物将对医药工业产生深远的影响。自从1990年Anderson等首次成功地进行基因治疗的临床研究以来，迄今已完成了500多例基因治疗临床研究，但其结果尚不尽人意，其最大困难在于开发无毒、高效的基因治疗载体。虽然80%的研究仍采用转染率较高的病毒载体，但尚存在的非导向性、有限的携带能力、生产和包装以及安全性的困扰等问题，如2000年美国宾州大学以重组病毒为载体的基因治疗药物在临床研究中造成一个18岁受试者死亡的悲剧以及腺病毒有选择性的促肾上腺皮质作用的报道，因此，近年来非病毒基因治疗载体倍受关注，也正是当前药剂学研究的前沿课题。为此，本文就其研究进展作一概述。1 裸DNA将目的基因连接在表达的质粒或噬菌体中直接注射而不依赖其它物质的介导，是最简单的非病毒载体系统。已知皮肤细胞、某些肿瘤细胞及免疫细胞对裸DNA较为敏感。肌内注射后可直接诱导相应的免疫反应，也可检测到DNA的明显表达。电穿孔（electroporation）技术和微粒子轰击法（microparticle bombardment, 此法也称作基因枪）的出现，大大提高了裸DNA的转染效率，而且使DNA可直接到达细胞核，避免了各种酶对DNA的降解。目前使用的DNA疫苗，就是用编码病毒抗原的质粒直接肌内注射，可获得有效的抗病毒免疫。虽然将裸DNA直接用于病变组织是可行的基因转移策略，但是，对于解剖学上不能进入的部位如器官里的实体瘤，显然给予裸DNA是无效的。最近，Yoshiakit等还使用高频、低强度的超声波转染荧光素酶质粒DNA到培养的人血管平滑肌细胞和内皮细胞。结果显示，在这两种细胞中的荧光素酶活性显著增加。同样用超声法把抗原癌基因（P53）质粒DNA转染到兔颈动脉以治疗血管损伤后再狭窄，结果表明P53蛋白显著增加，且没有明显的不良反应，如炎症反应。2 脂质体或脂质复合物自从1987年Felgner等率先用脂质体作为基因转移载体以来，相继合成了许多阳离子脂质。所有这些阳离子脂质的一端皆拥有12条由1218个碳原子组成的疏水链，使其在水性介质中形成双层结构，并包裹DNA；另一端为亲水性的N头部，通过静电力与DNA结合以形成脂质复合物。构效关系研究表明，增加分子中N数目以及N与疏水链的距离，则有利于基因转移。脂质体或脂质复合物经静脉注射后，很快被血浆清除以及在肺组织中积蓄，蛋白质表达主要在肺内皮细胞，表达时间短，一般在给药后424 h达峰，1周后消失。因此，阳离子脂质载体在治疗一些肺部疾病如肺代谢性疾病、门脉高压和急性呼吸窘迫综合征等有较好前景。脂质体或脂质复合物也可直接应用于病变部位以避免静脉给药的靶向困难，如：气管内给药可使肺泡上皮细胞中的 b-半乳糖苷酶基因表达，给予P53凋亡诱导基因可使早期肺肿瘤缩小。另外，通过喷雾给药可有效地防止脂质复合物中DNA的降解。还报道用单糖、双糖或PEG作 冻干保护剂，采用冷冻干燥法可改善脂质复合物的稳定性。虽然，在阳离子脂质构效关系研究的基础上，合成了一些新的脂质载体，但离理想的脂质载体还相距较 远，其困难在于体内外转染条件的差别，而且转染效果还取决于给药途径。为此，一个理想的载体不得不根据实际的临床应用而个性化设计，这无疑给载体的开发带 来困难。脂质体或脂质复合物已在临床研究中用于治疗癌症和囊性纤维病变，但还无长期安全性报道。早期的动物和临床研究表明，脂质体或脂质复合物是无毒的， 而且若给予小剂量，其诱导的炎症反应很小。然而，现在有研究表明小鼠呼吸道吸入脂质复合物后，可诱导产生剂量依赖性的肺部炎症反应并伴随细胞因子的产生。 若静脉注射给予DNA阳离子脂质复合物，发现可激发高水平的细胞因子如 INF-g 和TNF-a 产生。这些细胞因子不仅引起所治疗小鼠的毒性，还抑制外源基因的表达。阳离子脂质起一个协同作用，诱导细胞因子产生的主要成分是质粒 DNA中未甲基化的胞苷磷酸鸟苷（cytidyl phosphate guanosine, CpG）二核苷酸。目前，解决上述问题的办法在于修饰质粒DNA以减少CpG数目和使用免疫抑制剂。另外，增加载体的组织特异性和降低含CpG DNA与免疫细胞的非特异性相互作用，也能降低免疫反应的发生。3聚合物3.1聚-L-赖氨酸 1987年首次报道与去唾液酸糖蛋白连接的聚-L-赖 氨酸偶合物用于肝细胞的基因靶向转移。聚合物用作基因载体的早期研究工作主要集中在如何偶联上靶向配体或抗体以增加靶细胞的摄取。研究发现，如果既不连接 靶向配体或抗体，又不添加吞噬泡或溶酶体溶解剂（如氯喹），其基因转染效果较阳离子脂质体差，这是双亲性阴离子脂质与可溶性聚合物聚-L-赖氨酸的重要区别。这种聚合复合物（polyplexes）的细胞摄取和基因转染在有或无靶向配体的情况下，皆依赖于聚合复合物正电性的存在。将组氨酸连接到聚-L-赖氨酸中L-赖氨酸的d-残基上形成的聚合物比添加了氯喹的聚-L-赖氨酸混合物更有效，这是由于在 pH 6以下，质子化的组氨酸提供了额外的内吞缓冲能力。因此，组氨酸的使用似乎有助于避免DNA在吞噬泡中被降解。研究还表明，用半胱氨酸和色氨酸残基替代聚-L-赖氨酸中的一些氨基酸残基，也会增强此聚合复合物的基因转染效果，表明DNA的释放可能受细胞内二巯键的还原所激发。虽然，聚-L-赖氨酸像脂质体一样能阻止血清中核酶对DNA的降解，但是，若经静脉注射，聚合物与血浆蛋白结合后仍将迅速从血浆中清除。3.2 聚乙烯亚胺（polyethylenimine，PEI）与聚-L-赖氨酸不同的是这种支链或线形PEI阳离子聚合物由于其自身的内吞缓冲特性，在不需要吞噬泡或溶酶体溶解剂的情况下显示出更好的基因转染效果。PEI和阳离子脂质体一样也具有细胞毒性作用，不同相对分子质量（Mr）或异构体(支链或线形)的PEI，在体内基因转染的效果和毒性是不同的。PEI的Mr对转染活性的影响报道不一，可能理想的Mr大约在19.9 10370.0 103。 PEI是一种非常有效的基因转移载体，但若静脉给药，其基因表达跟阳离子脂质体一样也主要在肺泡上皮细胞，因此，以前的研究多采用直接应用到靶组织。PEI已用于不同给药途径的基因转移如吸入、肾动脉内给药、脑内注射和静脉注射，其基因表达也较短暂，给药后 14天已不能检出。如果在此聚合物偶联上靶向配体将会增强其转染能力。若用PEG包衣能使其在肺外组织、肝的基因表达增加，而且还能调节PEI的毒性，但是体外摄取有所降低。不论是静脉注射，还是气管内给药，线形PEI的基因表达量皆优于阳离子脂质体。3.3树状聚合物一定分子量范围的聚酰胺和含磷树状聚合物已被用作基因传递系统，其末端氨基通过静电力与DNA结合，增加末端氨基的数目则能增加其基因转染的效果。聚酰胺树状聚合物的酰胺键在水或乙醇中的水解，可使基因转染率增加50倍，其原因可能是增加了聚合物的柔韧性。研究还发现，这种增加的柔韧性对吞噬泡的膨胀至关重要。一些可水解的聚酰胺树状聚合物对体内颈动脉的基因转染比支链PEI更有效。3.4 其它聚合物聚（二甲氨基）乙基甲基丙烯酸酯、聚-L-组氨酸、聚乳酸-乙醇酸共聚物、壳聚糖、明胶等皆被用作基因传递系统的载体材料。纳米粒由于它的超微小体积，能穿透组织间隙，具有良好的细胞摄取效果而将DNA导人到胞浆内；能控制DNA的释放而延长其体内、外的作用，因此，纳米粒作为基因转移载体得到了广泛的关注和研究。壳聚糖纳米粒是首次报道的口服基因传递系统的载体材料，这将为口服疫苗提供新的机遇。李拥军等用聚乳酸-乙醇酸共聚物和聚乙烯醇包载特异性反义单核细胞趋化蛋白-1基因制得的纳米粒，在体外的释放时间为2周左右，可将目的基因转移至平滑肌细胞基因组中，其效果与阳离子脂质体相当；体内可实现局部基因转染和表达，发挥相应的效应，其作用比阳离子脂质体介导的基因转染稍强；但该载体的包理率仅有0.9%。Goetting等 在用带正电荷的聚苯乙烯纳米粒装载带负电荷的寡核苷酸的实验中，测定了寡核苷酸的含量对纳米粒稳定性的影响。结果表明，随着寡核苷酸含量的增大，所形成的 纳米粒先变得不稳定，后趋于稳定。这是由于纳米粒的极性造成的，而当纳米粒达到电中性时，凝固作用也达到最大。另外，研究还表明，转基因纳米粒对靶细胞的 转染效果与细胞类型、纳米粒的粒径大小、细胞孵育的时间以及纳米粒的浓度有关。4复合载体4.1 脂质复合物将DNA与聚-L-赖氨酸、聚乙烯精胺或聚乙烯咪胺等形成复合物，再包封于阴性或中性脂质体中形成的脂质复合载体系统毒性更小，而且在某些情况下，由于更大程度上保护DNA免遭核酸酶降解而在体外基因转染中比阳离子脂质体更有效。脂质体或脂质复合物、聚合物或复合载体一般可以通过以下手段以增强载体的靶向性和提高转染率。由于阳离子脂质或聚合物是通过静电力与DNA形成复合物，只有在阳离子过量时才能有效地浓聚DNA，而这种正电荷在体内易与血浆蛋白（特别是白蛋白）相互作用并激活补体系统，从而引起复合物的去稳定性、非特异性清除及不良反应。因此，通过PEG修饰、包裹或羟丙基甲基丙烯酸包衣后的脂质复合物或聚合复合物体，可屏蔽复合物所带的电荷，减少它与血浆成分的相互作用，从而避免免疫系统的清除，增加循环时间；减少与非靶细胞因电荷引起的相互作用；聚合物质粒DNA复合物多呈不规则状，包裹或包衣后可使其成为球形结构；增加靶组织中蛋白质的表达，但体外的细胞摄取量有所降低。通过共价或非共价连接靶向抗体或配体如：肝细胞特异性的去唾液酸糖蛋白、肿瘤细胞特异性的转铁蛋白等来增加靶组织细胞中的转染率。 4.2 拟病毒颗粒用中性或阴性脂质体包裹偶联有核定位肽、两性分子肽的阳离子多聚物DNA复 合物，再加入未端有跨膜型疏水区的配体寡肽，插入脂质体双分子层中，形成一个功能齐全且有保护作用的穿梭载体，类似于病毒颗粒。这种拟病毒颗粒一般应用中 性或阴性脂质体，因阳离子脂质体在血浆中不能维持胶体的稳定性。导向配体采用具有介导内吞作用的配体，如碱性细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子等。5 基于抗体的靶向基因传递系统为了获得DNA与特异性细胞的靶向结合，早期的研究是将不同的质粒DNA与各种单克隆抗体结合，在体内外转染小鼠淋巴细胞实验中，证明有一定的效果。Durrbach等用高度特异性的G250单克隆抗体与 DNA的结合物转染肾癌细胞也取得了较好的内化效果，还发现外源DNA从吞噬泡中逃逸是其转入细胞核所必需的。为了进一步提高DNA进入细胞核的能力，有报道在引入靶向抗体的同时，将质粒DNA与组蛋白H1非共价连接，其中组蛋白H1起到DNA载体的作用而降低核酸酶的降解，则有利于进人静止期细胞的细胞核；再把一种能使吞噬泡膜不稳定的膜去稳