基因芯片原理及其在细胞生物学中的应用.ppt

1 基因芯片原理及其在细胞生物学中的应用 周士新82802003北京大学医学部细胞系 2 主要内容 1 基因芯片的概念和原理2 基因芯片的类型3 基因表达的数据分析4 细胞学应用实例介绍 3 1 基因芯片的概念和原理 基因芯片 genechip 又称DNA微阵列 DNAmicroarray 是由大量DNA或寡核苷酸探针密集排列所形成的探针阵列 其工作的基本原理是通过杂交检测信息 实质是核酸碱基的互补匹配 把大量已知序列探针集成在同一个基片上 经过标记的若干靶核酸序列通过与芯片特定位置上的探针杂交 利用基因芯片杂交检测图像 可以对生物细胞或组织中大量的基因信息进行分析 基因芯片能够在同一时间内分析大量的基因 实现生物基因信息的大规模检测 4 LabeledTarget HybridizedArray DetectionReagents DNAMicroarray 基因芯片的原理 5 基因芯片的相关知识 6 应用原则 测基因表达水平的微阵列应用最为广泛是比较试验为了提高实验的可靠性 对于同一样本 往往有两次或更多次的重复实验 由于DNA微阵列的费用较贵 不可能重复足够多的次数来满足实验数据分析的要求良好的模型 除比较因素外 其他尽量相同 时间点的选择适当的统计方法来分析数据 7 2 基因芯片的类型 制备方法 1 cDNAarrays Microspotting cDNA芯片2 Oligonucleotidearrays Photolithographicsynthesis Ink jettechnology etc 寡核苷酸芯片探针位置 基因表达芯片 geneexpressionmicroarray 启动子芯片 promotermicroarray CHIP 染色质免疫共沉淀 onchip外显子 exonsmicroarray 基因组芯片 Tilingmicroarray 8 基因芯片的类型 用途 转录因子 药物作用 免疫分子 细胞周期等肿瘤相关 Oncogene芯片 抑癌基因芯片microRNA芯片DNA甲基化芯片 9 基因芯片的探针设计 10 分子生物学的认识 2004 Protein hnRNA DNA transcription Moleculeswitheffectorfunction tRNA rRNA reversetranscription mRNA splicing ribozymes miRNA dicing pre miRNA OthernoncodingRNAs 11 基因组序列 基因表达谱 蛋白质谱 mRNA编辑 表观遗传机制 转录过程 染色质的结构 DNA甲基化 转录因子表达谱 转录因子结合序列的差异 DNA结合RNA 可变剪切 MicroRNAs 12 表观遗传学 epigenetics 是指在基因组中除了DNA和RNA序列以外 还有许多调控基因的信息 它们虽然本身不改变基因的序列 但是可以通过基因修饰 而影响和调节遗传的基因的功能和特性 表观遗传的的信息也被称为第二遗传密码 它是建立在我们熟知的经典遗传密码 3联密码 之外的遗传信息 高等生物的发育调控是通过对其二倍体基因组的选择性表达来实现的 主要有 DNA甲基化 组蛋白修饰和染色质重塑 RNA剪辑 13 Oligo 寡核苷核 芯片 Oligo 寡核苷核 芯片介绍公司 美国Affymetrix 推动主要特点是超高密度核苷酸长度较短 60nt 14 Affymetrix光脱保护合成法 Lamp Mask Chip 15 Affymetrix光脱保护合成法 16 Affymetrix光脱保护合成法 Eachprobe25bplong11 20probespergenePerfectMatch PM aswellasMisMatch MM probes 17 Affymetrix基因表达芯片的探针设计 5 3 mRNAsequence PerfectMatch Mismatch 18 Affymetrix基因芯片流程 Specimens Bioinformatics LabeledTargets 0 0 0 0 19 单色标记 20 PM MM ProbePair ProbeCell 24mmx24mm 3mm Pixel 64Pixels Affymetrix探针设计 21 cDNAProbesGenBankUniGenedbEST cDNAArrays 10 000Probes cDNA基因芯片 22 23 Control Test RT LabeledwithFluorDyes cDNAMicroarrays scanning Cy3 Cy5 Bioinformatics cDNA基因芯片样品标记 24 cDNA基因芯片样品标记 25 cDNA基因芯片的荧光信号 26 Oligonucleotide芯片与cDNA芯片的比较 OligonucleotideArrayscDNAArraysHighdensityLowerdensityHighspecificityCross hybridizationcannotbedeterminedRequiressmallamountofsamplesLargeramountofsamplesisrequiredGeneexpressionandMostlyforGeneExpressionGeneticalteration polymorphismHighreagentcostsLowerreagentcostsHybridizationoftargetfromasinglesourceSimultaneoushybridizationoftargetsfromtwosourcesClonesforsignalvalidationhavetobeClonesavailableforsignalvalidationobtainedfromothersourcesDifficulttomanufacturearraysin houseArraymanufactureislaborintensiveandinitialset upisexpensiveHighcostperarrayLowcostperarrayLowerflexibilityHighflexibility 27 基因表达芯片 cDNAArrays OligonucleotideArrays GlasArrays MembranebasedArrays 28 图像分析 网格Gridding identifyspots automatic semiautomatic manual 分割Segmentation separatespotsfrombackground Fixedcircle B AdaptivecircleC Adaptiveshape D Histogram强度提取Intensityextraction meanormedianofpixelsinspot背景修正Backgroundcorrection localorglobal 29 质量控制 Genespecific whetherrecognizeuniquesequencesinthesegenes Arrayspecific normalizationfactor genespresent linearity control spikeperformance e g 5 3 ratio intensity Acrossarrays linearity correlation background normalizationfactors noise 30 基因芯片的其它类型 研究的对象 探针的针对对象 用途 31 启动子芯片简介 染色质免疫共沉淀 chromatinimmunoprecipitation ChIP 技术该技术的主要方法是 将细胞先用甲醛固定 使DNA和蛋白质交联 再用DNA结合蛋白 转录因子和核酸结合酶类 的特异性抗体将蛋白质和DNA一起沉淀下来 与蛋白质解离后的DNA经过PCR扩增 并用荧光标记后 与芯片上的核酸探针杂交 通过杂交信号的检测 判定该DNA结合蛋白与何种基因结合 由于DNA结合蛋白通常与基因的启动子区结合 也称为启动子区基因芯片 32 33 34 35 Tilingmicroarray简介 36 Unbiased寻找转录因子的位点 TFBS 37 Miskaetal 2005currentopinioningenetics microRNA基因芯片简介 38 39 基因芯片需考虑的事项 组织或细胞的类型基因表达的时间性及空间性基因表达的方式 丰度 40 基因表达的时间性及空间性 41 时间和空间特异性 42 43 基因表达的方式 管家基因与奢侈基因管家基因 housekeepinggene 在一个生物个体的几乎所有细胞中持续表达的基因 组成性基因表达 constitutivegeneexpression 奢侈基因 luxurygene 只在特定的细胞类型中表达的基因 44 3 基因芯片的数据分析 DataProcessing DataMining Information Data Knowledge 45 数据处理 Normalization BackgroundSubtraction ExpressionAlgorithm IntensityAlgorithm DataProcessing 46 基因表达数据分析过程 强度算法 IntensityAlgorithm 将图像转化为杂交信号值背景去除 BackgroundSubtraction 去除非特异性的杂交信号 背景信号 探针的对应算法 ExpressionAlgorithm 将探针的杂交信号值与各自所代表的基因相对应标准化 Normalization 不同试验和不同样品间数据的归一化 使它们均衡可比 47 数据筛选 探针筛选表达水平筛选 信号强度值 多次试验标准差等 背景差异筛选 选出与背景差异显著的探针 表达差异筛选 选择与对照样本表达差异较大的基因 48 探针筛选 以Affymetrix芯片为例 1 探针名的后缀以 at 识别基因的反义链而且 以 at 标识的探针表示仅识别唯一的基因 2 探针名的后缀以 a at 表示识别同一基因的多个可变剪切 3 探针名的后缀以 s at 表示识别不同基因的多个转录本 4 探针名的后缀以 x at 可能包含一些交叉序列的基因可以去除 s at 和 x at 的探针集 49 数据挖掘DataMining Genes Experiments NovelgenesNovelfunctionsofknowngenesPathwayelucidationsBiologicalProcesses 50 主成分分析PrincipalComponentAnalysis PCA 分层聚类分析HierarchicalClusterAnalysis HCA MultidimensionalScaling MDS k MeansClassificationandRegressionTree CART 自组织映射Self OrganizingMaps SOM 相关系数聚类CorrelationCoefficientClustering向量机SupportVectorMachine SVM k最近邻法k NearestNeighbors KNN PartialLeast SquaresRegression PLS Back PropagationArtificialNeuralNetwork BP ANN GeneticAlgorithm GA 数据挖掘的方法介绍 51 a hierarchicalclustering b Self organizingmaps SOMs d principalcomponentanalysis PCA e nearest neighborhoodmethod 52 基因表达的散点图 53 Leukemiamelanomabreastcancercoloncancer Scherfetal NatureGenetics24 236 244 2000 cDNAmicroarray9703cDNAprobes 人类肿瘤的基因表达谱 PCA分析 54 ResearchProjects 分层聚类分析 55 Alizadehetal Nature403 503 11 2000 56 集成的数据分析工具1 57 集成的数据分析工具2 58 ExpressionLevelsofRelatedGenesontheArray Structure Function Pathway etc SequenceAnalysis e g FunctionalDomains DatabaseQuery e g blastsearch BiochemicalActivity BiologicalActivity LiteratureSearch 集成的数据分析工具3 59 ExpressionLevelsofRelatedGenesontheArray Structure Function Pathway etc SequenceAnalysis e g FunctionalDomains DatabaseQuery e g blastsearch BiochemicalActivity BiologicalActivity LiteratureSearch 集成的数据分析工具4 60 Proteomics Genomics AutomatedDataAnalysis Multi platformDataIntegrationandAnalysis ActivitiesofCellularProcesses Phenotypes 数据分析与预测 61 4 基因芯片的应用实例 3 Extractmetylationpatternandinterpretresults 62 Expression Gene Experiment 63 1 用基因表达芯片探索药物作用机理 64 探索药物作用机理 treatmentwithoestrogenandtamoxifen它莫西芬 aselectiveoestrogenreceptormodulator Pilotexperimentsweredonefirsttodeterminetheoptimaldurationoftreatment andwefoundthata3 hrtreatmentofcEECs内皮细胞瘤with17b oestradiol E2 yieldedthegreatestcoverage about75 ofcurrentlyknownERtargetgenes Thus wechosea3 hrtreatmentforsubsequentexperiments 65 Endometrioidcarcinomasamples cEECs andfromsamplesofnormalendometrialepithelium nEECs 66 作用机理NatureReview 2006 6 67 它莫西芬的代谢通路 68 基因调控的复杂性 多层次 Information FunctionalComponents CellularPathways CellularProcesses CellularPhenotype 69 SignalTransductioninaCell fromDownward Nature August 2001 70 2 信号通路分析 PowerfulcapabilitiestovisualizeandmanipulatepathwaysGenesautomaticallyplacedonKEGGandGenMaPPpathwaysandlinkedwithexpressiondataPathwaysareeasilyconvertedtogenelistsforfurtheranalysisSeamlessintegrationwithpopularpathwaytools suchasAriadneGenomics PathwayAssist 71 PathwayAnalysisinGeneSpring 72 PathwayAnalysisinGeneSpring 73 PathwayAnalysisinGeneSpring Step3 Visuallyinspectimportantgenesandpathwaysidentifiedthroughthescriptusingthe splitwindow functioninGeneSpring 74 PathwayAnalysisinGeneSpring 75 信号通路数据库 AfCS TheAllianceforCellularSignaling www signaling gateway org 76 77 基因表达与信号通路 Howcanweobtainbiologicalinformationfromarraydataatthelevelofindividualgenesandcorrelationsinexpressionbetweengenes Canweusethecorrelationstobuildaconnectionnetworkthatreflectscorrelationsinexpression 78 Microarrayanalysismodelusinggeneexpressionprofiles DNA GeneA GeneB GeneC GeneD Protein mRNA mRNA P mRNA P mRNA Signaltransductionismostlikelyregulatedontheproteinlevel butthedownstreamsignalonthetranscriptionallevelistheresultantoutputfromtheupstream outsidethenucleus signalinput Thesignalinformationprocessingcomplexityisnowincreasedonthetranscriptionlevelbutsomeinformationflowsupstreamandoscillatesinaninput outputfashion 79 基因的相关性 信号通路 groupsofgenes clusteringmethods pairsofgenes correlationmethods Linearcorrelation x xmean y ymean x xmean 2 y ymean 2 Partialcorrelation r2xy rxy z rxy rx z ry z 1 r2x z 1 r2y z marginal globalcorrelation forligandj r2allxy r2allxyexceptligandj Genenetworkmaps AfCSexpressiondatawithliteratureinformation 80 TranscriptionaleffectsdownstreamfromproteinsrecruitedinMAPKcascades Hazzalin etal NatureCellBiology 2002 81 Two wayhierarchicalcluster meanratio vscontrol ofphosphoproteinlevelsandligand 82 Note theligandsthatelicitanERKresponse chemokines AIG CD40L clusteredtogether Acorrespondenceplotbelowalsoshowedthegrouping 83 TranscriptionfactorencodedbyfosisstabilizedbyERKandcontinuestoaffectotherIEgenessuchasjun fromNatureCellBiologyAu