免疫学检测技术

第十四章 免疫学检测技术,经典的免疫学方法：一、凝集反应（agglutination）细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后形成凝集团块的反应。1、直接凝集反应2、间接凝集反应3、间接凝集抑制反应,二、沉淀反应（precipitation）血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸液等可溶性抗原与相应抗体结合后出现沉淀物的反应。1、单向免疫扩散（single immunodiffusion）2、双向免疫扩散（double immunodiffusion）3、免疫电泳（immunoelectrophoresis）4、火箭免疫电泳（rocket immunoelectrophoresis）5、免疫浊度测定（immunonephelometry）,免疫浊度测定：可溶性Ag+Ab，二者比例合适时，在特殊的缓冲液中快速形成一定的AgAb复合物，使反应液出现浊度。透射比浊法 散射比浊法 速率散射比浊法 终点散射比浊法,一定要保持抗体过量，以维持抗原抗体复合物的相对不溶解性。,该方法的分析范围主要检测的是血浆、体液中特定蛋白系列。如Ig、补体、血浆蛋白、炎性反应蛋白、一些小分子量的治疗性药物浓度等。,第一节 免疫学检测常用标记技术,免疫标记技术（immunolabelling technique） 指用荧光素、放射性核素、酶、发光剂或电 子致密物质（胶体金、铁蛋白）作为示踪剂标 记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。优点：高灵敏度、特异性、快速，能定性、定量、定位测定，易于观察结果并适合自动化检测。总体分为：免疫组化：定位检测组织或细胞中的 Ag/Ab 免疫测定：定量检测液体标本中的 Ag/Ab也可分为：荧光免疫技术，放射免疫技术，酶免疫技术，化学发光免疫技术及免疫金标记技术等。,一、酶免疫技术基本原理：以酶标记抗体（或抗原）用于免疫检 测，通过相应底物被酶解后的显色反应，对标本中的抗原/抗体进行定量、定位分析。 标记物：酶（催化底物：生物放大作用）特点：灵敏度高、特异性强、准确性好，酶标记试剂能够较长时间保持稳定，检测方法简便安全易行，容易与其他技术偶联衍生出适用范围更广的新方法。,（一）常用的酶和酶作用底物1、辣根过氧化物酶（HRP）HRP来源于植物辣根中，分子量40KD，由主酶（糖蛋白）和辅基（亚铁血红素）组成的复合物。HRP常用的底物有：（1）邻苯二胺（OPD）OPD显色后为橙黄色，加入终止液为棕黄色，可溶性产物，应用最早，但配成溶液后稳定性差，且有潜在的致癌性，显色反应需避光。（2）四甲基联苯胺（TMB） TMB经酶作用呈兰色，可溶性产物，加酸终止后黄色，稳定性好，显色反应无需避光，无致突变作用。应用最广泛。但水溶性差。,2、碱性磷酸酶（AP） AP从大肠杆菌或小牛肠粘膜中提取，菌源性活力小于小肠粘膜活力。AP价格较HRP高，稳定性差，但敏感度高，空白值低。 可催化对硝基苯磷酸酯（p-NPP），生成黄色的对硝基酚，NaOH终止后黄色可稳定存在一段时间（405nm）。,（二）酶免疫技术的分类酶免疫组化 （EIH） 均相酶免疫测定（HEI） 酶免疫测定 非均相酶免疫测定 固相酶免疫测定 （EIA） 液相酶免疫测定 （同RIA）,（三）酶免疫测定（EIA） 1、均相酶免疫测定（HEI）,特点：仅需将待测样品、酶标试剂和底物溶液混合，待抗原抗体反应完成即可直接测定结果，整个检测过程都在均匀的液相中进行。以酶放大免疫测定技术（EMIT）为例：,2、非均相酶免疫测定,（1）液相酶免疫测定（液相EIA）： 同RIA：抗原、酶标抗原、抗体相继加入后，使反应达到平衡，再加分离剂。（2）固相酶免疫测定（固相EIA）：AgAb反应在固相载体的表面进行，应用最广泛的是酶联免疫吸附试验（ Enzyme linked immunosorbent assay ELISA ）,1） ELISA 基本原理将抗原或抗体结合到固相载体的表面，并保持其免疫活性。抗原或抗体与酶连接成酶标抗原或抗体，仍分别保持其免疫活性和酶活性。在固相载体上按照一定的步骤加入待测抗原或抗体及酶标抗体或酶标抗原，洗去未结合的游离物质，加入酶的底物显色，颜色的深浅与待测物质含量呈相关性。,2）固相载体的种类A、塑料制品 聚苯乙烯： 蛋白质非共价键或物理吸附结合到载体表面，可制成小试管、小珠、微量反应板的形式专用于ELISA的微量反应板ELISA板（812=96孔）B、微颗粒 高分子单体聚合成的微球或颗粒，带有能与蛋白质结合的功能基团，易于化学偶联，结合容量大。反应时可均匀的分散到整个反应溶液中，反应速度快。其中可包裹磁性物质，制成磁化微颗粒，使分离可在磁板中完成，自动化分析。C、膜载体 NC膜（硝酸纤维素膜） 、玻璃纤维素膜、尼龙膜等微孔滤膜。非共价键吸附Ab/Ag，吸附能力强。广泛应用于斑点-ELISA等。,3）ELISA方法类型及反应原理 A、双抗体夹心法 此法是检测大分子抗原的常用方法。,上述方法亦可改为双位点一步法，使用针对抗原分子上两个不同表位的单克隆抗体，分别作为固相抗体和酶标抗体。注意钩状效应。,B、间接法 此法是测定抗体的常用方法。可以用一种酶标抗抗体检测多种抗体。,C、竞争结合法 可用于测定小分子抗原或半抗原及抗体。以检测抗原为例，待测抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，结合于固相的酶标抗原量与标本中待测抗原含量呈反比。,D、捕获法最常用于检测IgM抗体包被抗人IgM 链+待测标本-IgM类抗体全被固相抗体捕获-洗涤+ 特异性抗原（针对待测IgM的相应抗原）与固相上特异性IgM结合+酶标抗体（针对特异性Ag的）+底物-显色-显色表示有特异性IgM。,E、 BAS-ELISA 生物素（B） -亲和素（A）系统（ biotin avidin system，BAS）是以生物素和亲和素具有的独特结合特性为基础，它们的结合迅速、专一、稳定，并具有多级放大效应。应用生物素亲和素放大系统的ELISA，使反应信号放大， 检测灵敏度提高。,1个亲和素（链霉亲和素）可结合四个生物素衍化物 1个抗体可结合多个B，与蛋白质-NH2结合形成 肽键，-NH2越多，标记B越多。 E B Ag?EB ABE B Ab B B B E EBABE,BAS-ELISA包括：ABC-ELISA （间接法、双抗体夹心法） BA-ELISA （间接法、双抗体夹心法） BAB-ELISA （间接法、双抗体夹心法）例如：BAB-ELISA（双抗体夹心法）：固相Ab+待检Ag+（Ab-B）+ A + B-E + 底物显色,ABC-ELISA （间接法、双抗体夹心法）,（四）酶免疫组化（EIH）原理：以酶标记抗体与用于相应抗原反应，通过底物被酶解显色以示踪抗原-抗体结合物存在的部位。酶免疫组化染色标本可在普通光学显微镜下观察，并能长期保存。此外，作为辣根过氧化物酶底物的二氨基联苯胺（DAB），其分解产物为不溶性，适于镜下观察。,1、直接法组织标本待测抗原+ 酶标记抗体DAB显色2、间接法 组织标本待测抗原 + Ab1 + 酶标-二抗使用一种酶标抗体可检测多种抗原。敏感性较直接法高，但低于PAP法。,3、生物素-亲和素法 将亲和素（A）与生物素（B）系统应用于酶免疫组化包括：ABC法（直接法、间接法） BAB法（直接法、间接法） BA法 （直接法、间接法）,3.,1）ABC法直接ABC法:玻片Ag + BAb Ag-AbB ABC Ag-AbB-AB*C 特点:将BAB法中的A先与BE结合，制备成复合物ABC间接ABC法：用生物素化的第二抗体与抗原抗体复合物结合玻片Ag + Ab1 Ag-Ab1 BAb2 Ag-Ab1-Ab2B ABC Ag-Ab1-Ab2B-AB*C,2）BAB法（桥联亲合素-标记生物素法BRAB）直接BAB法:组织切片或细胞涂片Ag + BAb Ag-AbB A Ag-AbB-A BE Ag-AbB-A-BE 特点：以游离A分别连接BAb和BE 间接BAB法：用生物素化的第二抗体与抗原抗体复合物结合组织切片或细胞涂片Ag + Ab1 Ag-Ab1 BAb2 Ag-Ab1-Ab2B A Ag-Ab1-Ab2B-A BE Ag-Ab1-Ab2B-A-BE,3）BA法（标记亲合素-生物素法LAB法）直接BA（或LAB）法玻片Ag + BAb Ag-AbB AE Ag-AbB-AE特点：以AE/SAE代替BAB法中的A，省却了加BE的步骤间接BA（或LAB）法：用生物素化的第二抗体与抗原抗体复合物结合玻片Ag + Ab1 Ag-Ab1 BAb2 Ag-Ab1-Ab2B AE Ag-Ab1-Ab2B-AE,BAS实验方法及反应层次,方 法 反应层次 直接法 BA Ag(Ab-B)A* BAB Ag(Ab-B)AB* ABC Ag(Ab-B)AB*C 间接法 BA AgAb1(Ab2-B)A* BAB AgAb1(Ab2-B)AB* ABC AgAb1(Ab2-B)AB*C Ag 抗原； Ab-B 生物素化抗体； A 亲合素； A* 标记亲合素； B 生物素； B* 标记生物素； Ab1 第一抗体； Ab2 第二抗体; Ab2-B 生物素化第二抗体,4、过氧化物酶-抗过氧化物酶（peroxidase anti-peroxidase complex，PAP）法和碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶（alkaline phosphatase-antialkaline phosphatase，APAAP）法 原理：应用抗酶抗体与酶结合，形成可溶性、稳定的酶-抗酶抗体复合物。此法优点是：未经化学交联反应，故避免了抗体和酶活性降低，并省去酶标记抗体需纯化的繁复过程。,二、荧光免疫技术（fluoroimmunoassay）原理：以荧光素标记的抗体或抗原，用于相应抗原或抗体的分析鉴定。荧光免疫技术分为：免疫荧光显微技术（荧光免疫组化）：用荧光抗体对细胞、组织切片或其他标本中的抗原（或抗体）进行鉴定和定位检测，可在荧光显微镜下直接观察实验结果，流式细胞术：进行自动分析检测荧光免疫测定：用于检测体液标本中抗原或抗体。,（一）常用的荧光色素,1、异硫氰酸荧光素（FITC）橙黄色/黄色粉末，发出黄绿色荧光。最大吸收峰490495nm，最大发射峰520530nm，含异硫氰基-N=C=S。应用最多的荧光素。2、四乙基罗丹明（RB200）橘红色粉末，发出橘红色或橙色荧光。最大吸收峰570nm，最大发射峰595600nm。含磺酸基。与FITC做双标记或对比染色。3、藻红蛋白（R-RE） 发出橙色荧光，最大吸收峰565nm，最大发射峰575nm，可与FITC共用488nm激发光，可用于流式细胞仪的双标记。,（二）免疫荧光显微技术1、方法及原理1）直接法应用特异性荧光抗体直接检查标本中的相应抗原。2）间接法以特异性抗体（或待测抗体）为第一抗体，以荧光素标记的抗球蛋白抗体（标记的抗抗体）为第二抗体，用于检测抗原或抗体。,3）补体法 此法是在间接法的第一步抗原-抗体反应加入补体，使之与抗原-抗体复合物结合；再用荧光素标记的抗补体抗体进行示踪。 4）双标记法 此法用异硫氰酸荧光素（FITC）及罗丹明（TRITC）分别标记不同抗体，进行同一标本的荧光染色，若有两种相应抗原存在，可同时见两种（橙红、黄绿）荧光。,2、荧光显微镜检查1）染色标本尽可能立即观察结果。2）镜下观察时同一标本区观察时间不易过长。3）通风较好的暗室中进行。4）油镜检查时用无荧光镜油，先观察对照，再看待测标本。,（三）流式细胞术（FCM） FCM是将免疫荧光技术应用于流式细胞仪，对单个细胞表面标志（抗原或受体）进行快速、精确分析和自动检测，并可对不同类型细胞进行分选和收集。FCM还可对同一细胞的多种参数（如DNA、RNA、蛋白质和细胞体积等）进行多信息分析，故成为当代生命科学研究领域中被广泛应用的一项新技术。,1、基本概念与原理 FCM是一种分析单个微粒（如细胞、微生物和人工合成微球等）物理和化学特性的技术，其特点是快速、准确、客观，能定量。FCM的原理：悬浮在液体中的分散细胞单个地依次通过测量区时产生电信号，从而可快速对大量细胞进行多参数检测和分析，并可从整个群体中分选出特定的细胞亚群。,2、流式细胞术在免疫细胞研究中的应用1）细胞表型分析 表型分析可用于免疫细胞鉴定、计数和功能评价。2）细胞功能检测 （1）细胞功能状态和活化信号转导： 包括检测胞内钙离子浓度、蛋白磷酸化、蛋白激酶活性状态、信息传递相关蛋白表达及相互作用等。,（2）细胞增殖： 应用活细胞染料5-二醋酸羧基荧光素琥珀酸单胞菌酯（5-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester，CFSE）作为标记物，建立了检测细胞增殖的新技术。原理：CFSE能自动穿过胞膜，与胞内蛋白赖氨酸不可逆结合，并随细胞分裂而倍减，借助FCM检测荧光强度，可判断细胞的增殖状态。,（3）细胞分化：借助胞内细胞因子染色（intracelluar cytokine staining，ICCS），可应用FCM检测单细胞产生和分泌的CK，从而判断单一细胞亚群的分化和功能状态。原理：应用蛋白转运抑制剂使胞内合成的CK滞留在高尔基体；应用透膜剂（saponin）使荧光标记抗体可逆性穿透胞膜，以进行胞内染色。,（4）细胞毒效应：通过检测某些效应分子（FasL、穿孔素和颗粒酶等）可判断细胞毒效应。（5）细胞凋亡：见下文。,（四）荧光免疫测定（FIA）1、荧光偏振免疫测定（FPIA） 该法主要用于小分子物质（特别是药物浓度）测定。原理：荧光素标记的已知抗原+待测抗原+抗体形成标记抗原抗体复合物，由于其分子量大，旋转慢，在激发光照射下，吸收的偏振光多，发出的偏振荧光强，小分子游离标记抗原旋转快，其偏振荧光弱。因此，标本中抗原浓度越高，形成的标记抗原抗体复合物越少，发出的偏振荧光越弱。反之，发出的偏振荧光越强。,2、时间分辨荧光免疫测定（TR-FIA） 原理：应用具有较长荧光寿命的镧系螯合物（如铕）标记抗原或抗体，并利用时间分辨荧光分析仪延缓测量时间，有效消除非特异性本底荧光的干扰，所得信号完全是镧系螯合物发射的特异荧光，从而最大限度提高测定方法的灵敏度和特异性。,3、酶免疫荧光测定（ELFIA） 原理：应用具有潜在荧光的物质作为酶的底物，经过酶解反应产生高强度荧光，可用荧光测量仪进行定量测定。,三、放射免疫技术是以放射性核素作为示踪剂的标记 免疫测定方法，其特点是将核素分析的高 灵敏度与抗原-抗体反应的特异性相结合。 广泛应用于各种微量蛋白质、激素、小分子药物和肿瘤标志物的定量分析，对相关学科的发展起到了极大的推动作用。包括放射免疫测定（RIA）和免疫放射测定（IRMA）,（一）常用的放射性核素射线：131I、125I、51Cr、60Co射线：14C、3H、32P 射线半衰期长，易造成对环境的污染，比活性差，需液体闪烁仪。一般不用。,（二）放射免疫测定（RIA） 1、RIA基本原理以放射性核素标记的抗原（Ag*）和检品中待测的未标记抗原（Ag）与固定量特异性抗体竞争结合反应。若Ag*和Ab的量固定，二者结合所形成Ag*-Ab复合物受Ag含量制约。若反应系统中Ag含量高，其对Ab竞争结合能力即强，Ag-Ab复合物生成量增加，Ag*-Ab复合物则相对减少。因此，Ag*Ab复合物形成量与Ag含量间呈一定负相关函数关系。,Ag*+AbAg*Ab+Ag* + Ag AgAb+ Ag B F B0 T,2、 RIA测定方法1）AgAb反应2）B、F的分离加入PR试剂（二抗和PEG混合物， 也可制成固相二抗（二抗与颗粒固相物连接）Ag*Ab1+Ab2Ag*Ab1-Ab23） 放射性强度的测定 计数仪测上清/沉淀cpm，制备标准曲线（B/（B+F），B/F，B/B0）。亦可用计算机处理。,（三）免疫放射测定（IRMA）1、单位点IRMA是将待测抗原与过量标记抗体直接反应，然后加入固相的抗原免疫吸附剂与游离的标记抗体结合经离心去除沉淀物，测定上清液放射性强度，从而推算出检品中待测抗原含量。2、双位点IRMA测定固相上的cpm数,四、化学发光免疫技术是将发光技术与免疫反应和计算机技术结合 的自动化仪器分析技术，目前已趋替代RIA而 成为免疫检测广泛采用的分析技术。可用于多项指标的检测。可测定内分泌激素类、肿瘤标志物类、心肌标志物类、病毒标志物类、治疗性药物浓度、骨代谢指标和贫血类等方面的检测。,（一）化学发光免疫测定（CLIA） CLIA是以化学发光剂（如鲁米诺、吖啶酯等）标记抗体或抗原，免疫反应完成后，直接引发化学发光反应进行检测。,（二）化学发光酶免疫测定（CLEIA） CLEIA的抗原-抗体反应步骤与酶免疫测定相同，仅酶促反应所用的底物为发光剂，通过化学发光反应进行检测。,（三）电化学发光免疫测定（ECLIA）ECLIA实际上是在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应。,三联吡啶钌 RU(bpy)32+三丙胺（TPA）,.,电化学发光免疫分析示意图,电化学发光免疫测定示意图,五、免疫金标记技术（immunogold labelling technique） 氯金酸（HAuCl4）在还原剂（枸橼酸三钠）作用下被还原成原子金，聚合成特定大小的金颗粒悬液，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态胶体金。是以胶体金作为示踪标志物，应用于抗原-抗体反应。胶体金具有高电子密度，最初主要用于免疫电镜技术，以后其应用范围逐步扩展。在免疫组化方面，胶体金标记的抗体可直接用于检测细胞表面和组织切片中的抗原或受体，并可在普通光学显微镜下观察。在流式细胞术中，胶体金可作为多参细胞分析和分选的有效标记物。,常用的方法： 1、免疫金（银）染色法（IGS/IGSS） 组织切片（抗原）+特异性抗体+胶体金标记二抗+银显影剂，标记物上的金颗粒催化硝酸银离子还原成银颗粒，在抗原抗体复合物上形成黑色“银壳”，使Ag位置放大，从而提高了镜下的可见度。,用NC膜或微孔滤膜为载体吸附抗原，用胶体金标记抗体代替酶标抗体。,2、斑点免疫层析试验（DICA）,六、免疫印迹技术（immunoblotting） 又称为Western-blotting，是将凝胶电泳的高分辨力与固相免疫测定结合起来的一种方法。由十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、蛋白质转印和固相膜免疫测定三项技术结合而成。,七、免疫PCR （immuno-PCR，IM-PCR） 是将免疫学反应和PCR技术相结合而创建的一种新的检测技术，具有抗原、抗体反应的特异性和PCR技术的高效性。基本原理：用一段已知的DNA分子作为标记物，结合一抗或二抗后去检测相应抗原或抗体，再用PCR法扩增该DNA分子，扩增产物用琼脂糖电泳定性，根据该DNA分子的存在与否，确定检测结果。该方法与ELISA的原理类似，不同的是以DNA分子作为标记物。免疫PCR可采用直接法、间接法和双抗体夹心法。,八、细胞凋亡检测技术（一）形态学检测 应用电子显微镜或普通光学显微镜直接观察细胞大小、凋亡小体和其他凋亡细胞的形态学改变；应用某些可直接、间接产生荧光的染料如双苯并咪唑（HO）、碘化丙啶（PI）、 Annexin V等使细胞着染，借助荧光显微镜区分凋亡细胞、坏死细胞和正常细胞。,（二）生物化学检测方法 凋亡细胞染色质DNA在核小体单位间连接处断裂，形成180200bp整数倍的寡核苷酸片段，在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱（DNA ladder）。（三）免疫学检测方法 原理：凋亡细胞染色质DNA断裂而产生的核小体DNA，可与组蛋白结合为复合物。应用抗组蛋白和抗DNA单抗，借助ELISA方法可测定细胞凋亡。该技术优点是：可用于检测不同培养细胞株或不同动物来源的细胞凋亡；灵敏度高，且可检测早期细胞凋亡。,（四）分子生物学检测方法 常用技术为脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）， 原理：凋亡细胞的DNA链发生断裂而暴露3-OH末端，可借助末端转移酶（TdT）将脱氧核糖核酸与荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA 3-OH末端，从而检测细胞凋亡。TUNEL法的优点是：能对完整的单个凋亡细胞或凋亡小体进行原位染色；适用于不同样本的检测；灵敏度远比一般组织化学和生化测定法高。,（五）流式细胞术1、亚“G1”峰检测法 处于增殖周期的细胞，其在不同周期时相（Go/G1、S、G2/M）的DNA含量为2n4n。凋亡细胞核内的DNA裂解成小片段，应用胞膜通透剂可使小分子量DNA片段穿过胞膜而丢失，仅剩大片段DNA，这些失去部分DNA的细胞，染色后形成一个DNA含量2n （即G1期细胞）的分布区，称为“亚G1峰”。该技术的缺点为：不能反映发生于G1峰后S期和G2期的细胞凋亡；不能区别死细胞和活细胞。,2、HO/PI染色法 原理：HO被活细胞摄取，与DNA结合后在紫外光下呈蓝色荧光；PI使死细胞着染，产生红色荧光。根据两种荧光所形成的细胞二维直方图，可分辨正常活细胞、凋亡细胞和死细胞。3、Annexin法 应用Annexin V， Annexin V是一种Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，具有易于结合到磷脂类如PS（磷脂酰丝氨酸）的特性。对PS有高度的亲和性。借助FCM可定量分析被标记的凋亡与坏死细胞数。,4、caspase活性检测 caspase（胱天蛋白酶）水平及活性升高乃细胞凋亡的标志，并反映效应细胞的细胞毒活性。应用能透过胞膜的caspase荧光底物，其被酶切后释放荧光基团，借助FCM检测所释放的荧光强度，可推断caspase活性。该法优点为：可在单细胞水平对抗原特异性T细胞细胞毒作用进行可视化和数量化分析。,第二节 免疫分子的检测,一、免疫球蛋白测定检测IgG、IgA、IgM含量常用单向免疫扩散法、火箭免疫电泳法、免疫比浊法以及免疫化学自动分析仪。血清中IgE和IgD含量很低，须用RIA、ELISA、 RAST等灵敏度较高的方法测定。,二、补体测定（一）血清总补体活性测定 原理：应用家兔抗SRBC抗体致敏的SRBC作为抗原-抗体复合物，激活待测血清中补体经典途径，导致SRBC溶解；若待测血清样品中补体含量减少或某种补体成分缺失，可影响此种溶血反应。通常以50%溶血作为判定反应结果的终点，故称为50%溶血试验（50% complement hemolysis，CH50）。根据引起50%溶血所需的最小补体量，计算血清总补体活性。,（二）血清补体旁路途径活性测定 原理：家兔红细胞（RRBC）可直接激活人 B因子，引起补体旁路途径活化，导致RRBC溶解。（三）补体各成分测定1、免疫溶血法 该法可用于C4、C2及B因子测定。以抗体致敏的SRBC作为指示系统进行检测。2、免疫化学法 常用方法有单向免疫扩散法、火箭免疫电泳法、免疫比浊法、ELISA及RIA等。,三、细胞因子及其受体检测（一）生物学检测法原理为：根据CK特定的生物学活性，采用相应指示系统（如各种依赖性细胞株或靶细胞），通过与标准品对比，判断样品中细胞因子活性水平，一般以活性单位（U/ml）表示。可分为促进细胞增殖或增殖抑制法、集落形成法、细胞毒活性测定法、细胞病变抑制法、趋化活性测定法等。,生物学检测法优点：灵敏度高（达pg水平），并能直接显示CK生物活性。生物学检测法缺点：多种CK可能具有相同功能，故干扰因素较多；某些抑制因子可降低CK活性；某些细胞同时表达CK受体，其与CK结合将影响生物学活性检测结果。,（二）免疫学检测法 1、体液中CK的检测几乎所有CK均可借助免疫学方法进行检测。常用方法包括ELISA（双抗体夹心法或竞争法）、RIA及免疫印迹法等。某些细胞因子含量甚微的样品（如脑脊液）可用免疫PCR（immuno-PCR）进行检测，极大地提高检测灵敏度（可达1012mol/L）。,2、单个细胞分泌CK的检测（1）反向溶血空斑试验（reversed hemolytic plaque assay，RHPA） RHPA是一种体外检测抗体分泌细胞的试验。亦可将其用于测定CK分泌细胞。 原理：待测CK分泌细胞+抗CK抗体+SPA-SRBC+补体，4种成分与琼脂糖凝胶混匀，注入小室内；反应后导致SRBC溶解，在CK分泌细胞周围形成溶血空斑，每个空斑代表一个CK分泌细胞，空斑大小与细胞所分泌CK的量成正比。,（2）酶联免疫斑点试验（ELISPOT） 原理：抗CK抗体包被固相载体+待测分泌CK的细胞+结合后洗去细胞+酶标抗CK抗体+底物，显色反应的深浅测定结合在固相载体上的CK量，并可在光镜下观察分泌CK的细胞。,3、细胞内CK的检测 采用FCM免疫荧光技术可从单细胞水平检测不同细胞亚群中的CK，用不同颜色荧光标记的抗CK抗体可在同一细胞内同时测定两种不同CK。,免疫学检测法优点：特异性强，可测出单一细胞因子含量；方法简便，无须细胞培养，便于大量样品检测；实验流程短，方法易标准化，重复性好免疫学检测法缺点：免疫学方法所检出的细胞因子含量，与该因子生物活性并非必然平行；不同单抗所识别的细胞因子表位和亲和力不同，所测结果可出现差异。,（三）分子生物学检测法 应用细胞因子cDNA探针或寡核苷酸探针，经放射性核素（32P或35P）、生物素或地高辛标记，与提取的细胞因子mRNA进行杂交（Northern blot）；亦可在细胞或组织切片上进行原位杂交分析；若同时结合免疫组化技术，还可鉴定表达细胞因子基因的细胞类型。,分子生物学检测法优点：特异性高。分子生物学检测法缺点：仅能检测CK基因表达情况，不能直接提供CK含量及生物活性等信息，故此法主要用于研究CK基因表达与调控。,四、黏附分子的检测（一）细胞膜表面AM检测1、间接免疫荧光法组织细胞表面AM组织切片标本+抗AM单抗+羊抗小鼠IgG荧光抗体，进行间接免疫荧光染色，借助荧光显微镜观察表达AM的阳性细胞数。2、间接酶免疫组化法组织细胞表面AM组织切片标本+抗AM单抗+羊抗小鼠IgG酶标抗体，加入酶底物显色，显微镜观察表达AM的阳性细胞数。3、流式细胞术内皮、淋巴细胞等表面AM待检细胞悬液+两种荧光素标记单抗，在流式细胞仪上可同时检测胞膜表面两种不同的AM。,（二）可溶性AM测定1、ELISA双抗体夹心：最常用于检测选择素家族和免疫球蛋白超家族成员。2、其他免疫测定方法：RIA或IRMA、化学发光免疫测定、时间分辨荧光免疫测定方法等,第三节 免疫细胞的检测,一、免疫细胞的分离与纯化（一）白细胞的分离1、自然沉降法 2、高分子聚合物加速沉降法,（二）外周血单个核细胞（PBMC）的分离1、聚蔗糖-泛影葡胺（ficoll-hypaque，F-H）密度梯度离心法 2、Percoll密度梯度离心法 （连续和不连续）,（三）淋巴细胞的纯化与亚群分离1、去除红细胞 一般采用无菌蒸馏水低渗裂解法或0.83%氯化铵处理法。 2、去除血小板离心洗涤或胎牛血清（FCS）梯度离心法， 因FCS可让单个核细胞通过，而阻止血小板通过。,3、去除单核细胞和粒细胞（1）黏附法 玻璃纤维或葡聚糖凝胶Sephadex G-10柱，清除发生黏附的细胞（2）羰基铁粉吞噬法单核细胞吞噬羰基铁粉后，用磁铁将细胞吸至管底 （3）苯丙氨酸甲酯法 苯丙氨酸甲酯具有亲溶酶体性质，用该法可溶解含溶酶体的细胞（如单核、粒细胞等）。,4、淋巴细胞亚群的分离 （1）E花环分离法 T细胞表达SRBC受体，能与SRBC结合形成E花环，而B细胞则不能。经聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心，可将T、B细胞分离。（2）尼龙棉柱分离法 B细胞易黏附于尼龙棉纤维（聚酰胺纤维）表面，而T细胞则不易黏附，借此可将T细胞与B细胞分离。,（3）亲和板结合分离法（洗淘法）直接结合法：抗体包被塑料平皿或细胞培养瓶 （板）+细胞，吸附表达特定抗原的细胞。间接结合法：包被抗小鼠IgG抗体（第二抗体）+与单抗结合的淋巴细胞，被吸附固定而分离。特异性抗原（配体）包被+表达相应受体的细胞，该细胞被分离。,优点：可同时进行细胞的阳性分选和阴性分选，且所获细胞量较大。缺点：亲和板结合分离法一般适合进行阴性分选。此外，包被的抗体宜采用不含Fc段的（Fab）2抗体片段，以免发生非特异性吸附。,（4）补体细胞毒分离法 抗体+细胞+补体，通过补体依赖的细胞毒作用（CDC）而清除相应细胞，用于细胞阴性分选。 （5）流式细胞术分选法,直接法：将特异性抗体与磁性微粒交联，称为免疫磁珠（IMB），其可与表达相应膜抗原的细胞结合；应用强磁场分离IMB及其所吸附细胞，从而对特定细胞进行阴性或阳性分选。间接法：用抗小鼠IgG抗体（第二抗体）包被磁性微珠，可与任何已结合鼠源性单克隆抗体（一抗）的细胞发生反应，从而对细胞进行分离。,（6）磁性激活细胞分离器（MACS）分离法,MACS分离法优点：所获细胞纯度高（93%99%），获率可达90%，活细胞率95%；分离效果可与流式细胞术相媲美，但比后者省时且费用低，操作简单。缺点：阳性分选中，抗体可导致细胞活化或细胞凋亡。,（四）单核-吞噬细胞分离和收集1、将PBMC通过Percoll连续密度梯度离心法或洗淘法（阳性分选）可获取单核细胞，但所得细胞数量较少。2、斑蝥敷贴法可以从组织渗出液中获得数量较多且较纯的巨噬细胞，亦无需作进一步分离。3、以灭菌巯基乙醇酸盐肉汤培养基（或无菌液体石蜡）注入小鼠腹腔内，引起无菌性炎性渗出，从腹腔冲洗液中可获得大量巨噬细胞（85%）。,二、淋巴细胞及其亚群检测（一）T细胞检测计数1、间接免疫荧光法 应用抗CD3/CD4/CD8单抗与PBMC结合，再加入荧光素标记的抗小鼠IgG抗体（第二抗体），在荧光显微镜下观察并计数。2、酶免疫组化法 1）碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶（APAAP）法； 2）ABC法（间接法） 细胞涂片+单抗+二抗-B+AB*C+底物显色3、流式细胞术 采用流式细胞仪计数4、免疫金银染色法（IGSS）,（二）B细胞检测计数1、膜表面免疫球蛋白（mlg）检测 细胞涂片+荧光素标记抗Ig抗体（免疫荧光法）/+酶标记抗Ig抗体（酶免疫组化法）2、间接免疫荧光法 细胞+CD19/CD20/CD21/CD22等的单抗+荧光素标记的二抗，鉴定和检测计数B细胞。3、流式细胞术4、B细胞亚群检测 采用流式细胞仪，标记CD5单抗和标记CD19单抗，鉴定B1细胞和B2细胞。,三、免疫细胞功能测定（一）吞噬细胞功能测定 1、中性粒细胞趋化功能测定（1）滤膜渗透法（Boyden小室法） 在上室加入待测细胞，下室加入趋化成分，上下室间被具有一定孔径和厚度的纤维膜隔开，反应后取纤维膜清洗后进行固定、染色和透明化，在高倍镜下观察细胞穿越纤维膜的移动距离，从而判断其趋化作用。,（2）琼脂糖平板法： 在琼脂糖平板中央孔内加白细胞悬液，两侧孔内分别加趋化因子或对照液，反应后通过固定和染色，观察细胞定向移动能力。,2、中性粒细胞吞噬、杀菌功能测定（1）显微镜检法 白细胞与葡萄球菌或白色念珠菌悬液混合、温育，取样制片、固定、染色；在油镜下观察多形核白细胞对细菌的吞噬情况，计算其吞噬率（%）和吞噬指数（phagocytic index）及杀菌率。,（2）硝基蓝四氮唑（NBT）还原试验 中性粒细胞在吞噬、杀菌过程中，能量消耗骤增，氧需要量增加。己糖磷酸旁路糖代谢活性增强；葡萄糖分解的中间产物6-磷酸葡萄糖在氧化脱氢转变为戊糖过程中，所释放的氢被摄入吞噬体的NBT染料接受，使其被还原成蓝黑色点状或块状甲臢颗粒，沉积于中性粒细胞胞质内。一般以阳性细胞数超过10%判定为NBT试验阳性。,3、巨噬细胞吞噬功能测定 巨噬细胞+鸡红细胞（具有清晰可见的胞核）吞噬试验，计算吞噬率和吞噬指数。 4、巨噬细胞胞毒作用测定 用-干扰素激活小鼠腹腔巨噬细胞，观察其对125I-UdR标记的小鼠肥大细胞瘤P815的杀伤活性。,（二）T细胞功能测定1、T细胞增殖（转化）试验 T细胞在体外受抗原或丝裂原（PHA、ConA）刺激后，细胞代谢和形态发生变化，主要表现为胞内蛋白质和核酸合成增加，发生一系列增殖反应，并转变为淋巴母细胞。（1）形态学观察：依据淋巴母细胞转化的形态学特征，借助光学显微镜进行检测。优点：方法较简单，无需特殊仪器设备。缺点：依靠肉眼观察形态学变化，准确性较差。,（2）放射性核素（3H-TdR、125I-UdR）掺入法： T细胞增殖，其胞内新合成DNA需摄取核苷酸原料，故应用核素标记的核苷酸参与反应，通过测定放射性强度可反映淋巴细胞增殖水平。优点：灵敏，可自动操作。缺点：若操作不规范，可影响实验结果重复性，另存在放射性核素污染危险。,（3）细胞能量代谢测定（MTT比色法）：活的增殖细胞在能量代谢过程中产生琥珀酸脱氢酶，使黄色可溶性的MTT（四甲基偶氮唑盐）还原为蓝黑色的不溶