细胞破碎技术.doc

摘要：细胞破碎技术的基本概念及其基本方法关键词：细胞破碎技术 破碎方法生物分离是从生物材料、微生物的发酵液、生物反应液或动植物细胞的培养液中分离并纯化有关产品（如具有药理活性作用的蛋白质等）的过程，又称为下游加工过程。生物分离过程的主要特点:常无固定操作方法可循,生物材料组成非常复杂,分离操作步骤多，不易获得高收率,培养液（或发酵液）中所含目的物浓度很低，而杂质含量却很高,分离进程必须保护化合物的生理活性,生物活性成分离开生物体后，易变性、破坏,基因工程产品，一般要求在密封环境下操作。生物分离的一般工艺流程：发酵液预处理细胞分离（ 细胞破碎细胞碎片分离）初步纯化高度纯化成品加工的过程，而胞内产物需经细胞破碎，细胞碎片分离等步骤；胞外产物则将细胞去除后，对余下的液体即可进行初步纯化。在生物分离技术中细胞的破碎应用非常的广泛，尤其在生物技术迅猛发展的今天更是不可小视。组织细胞的破碎方法很多，有机械方法、物理方法、化学方法和生物化学方法等。在破碎前，材料常需要预处理，如动物材料要除去与实验无关甚至有妨碍的结缔组织，脂肪组织和血污等，植物种子需要除壳，微生物材料需将菌体和发酵液成分分开等。不同实验规模、不同实验材料和实验要求，使用的破碎方法和条件也不同。一些坚韧组织，如肌肉、植物的根茎等，常需要强烈的搅拌或研磨作用，才能把其组织细胞破坏。而比较柔软的组织如肝、脑等，用普通的玻璃匀浆器即可达到完全破坏细胞的目的破碎技术中细胞破碎法包括机械法和非机械法机械法又包括高压匀浆、高速珠磨、超声波破碎等方法。非机械法包括化学法、酶解法、渗透压冲击法、冻结融化法、干燥法。细胞壁的结构和破碎方法都会对细胞破碎产生影响。了接细胞壁的组成对于选择破碎方法非常重要。在微生物中各种生物的细胞虽小但是每一种都有其特有的组成方式。例如：细菌球菌直径0.5-1um杆菌直径0.5-1um，长为直径1-几倍螺旋菌直径03-1um，长1-50um细菌大小也不是一成不变的细胞重量10-13-10-12g，每g细菌基本结构是细胞不变部分，每个细胞都有，如细胞壁、膜、核。特殊结构是细胞可变部分，不是每个都有，如鞭毛、荚膜、芽孢。革兰氏阳性菌和阴性菌细胞壁的主要组成也是不同的，因而对细胞破碎的影响也不一样革兰氏阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖层（约2080nm）组成，而革兰氏阴性菌肽聚糖层较薄，仅23nm，在肽聚糖层外还有两层外壁层。外壁层约810nm，所以革兰氏阳性菌细胞壁较厚，较难破碎。对于霉菌来说霉菌的细胞壁较厚，约100250nm。酵母菌酵母的细胞壁比革兰氏阳性菌的细胞壁厚，更难破碎。植物细胞培养物产生的次生代谢物通常在液泡内浓集,而不释放到培养基中.为了回收这类产物,必需破碎细胞,这是一种不能由培养物进一步生产产物的高价方法.由植物细胞培养物生产次生代谢物的经济实用系统需要在不破坏细胞的条件下重复回收细胞产物的方法.这种技术已由剑桥大学的N.J.Kilby和BristolPolytechnic的C.S.Hunter研究成功.Kilby和Hunter报道,当施以1.02MH_2连续超声波达30秒钟以上时,悬浮培养的甜菜很多基因工程产物都是胞内物质，必须将细胞破壁，使产物得以释放，才能进一步提取，因此细胞破碎是提取胞内产物的关键步骤，破碎方法的得当与否，直接影响到所提取产品的产量、质量和生产成本。以释放胞内物质为主要目的的细胞破碎条件，采用均质破碎法、超声波法、加酶法和碱性自溶法等对谷氨酸菌作进行破碎试验，并对其相应的工艺参数进行了优化研究。结果表明，使用碱性自溶法在pH10.0，温度70，干菌浓度为10时，自溶40min后蛋白质的释放率接近80，表明该法对释放胞内物质的作用效果较理想细胞破碎就是破坏细胞壁和细胞膜，使胞内产物得到最大程度的释放。破碎酵母释放乙醛脱氢酶的研究中乙醛脱氢酶（ALDH）是一种胞内酶，在从酵母中分离提取ALDH的过程中，破碎细胞是其中的关键步骤之一。本文着重考察了自溶、反复冻融、超声波和高压破碎仪的细胞破碎方法对释放ALDH的影响。结果表明，用高压破碎仪破碎，酵母细胞破碎率可达到95以上，而且有效地防止了ALDH的分解及降解，是一种较为理想的破碎方法。除了某些细胞外的多肽激素和某些蛋白质与酶以外，对于细胞内或多细胞生物组织中的各种生物大分子的分离纯化，都需要事先将细胞和组织破碎，使生物大分子充分释放到溶液中，并不丢失生物活性。不同的生物体或同一生物体的不同部位的组织，其细胞破碎的难易不一，使用的方法也不相同，如动物脏器的细胞膜较脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有较坚固的纤维素、半纤维素组成的细胞壁，要采取专门的细胞破碎方法。1. 机械破碎(1)研磨研磨是将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中，加入少量石英砂研磨或匀浆，即可将动物细胞破碎，这种方法比较温和，适宜实验室使用。工业生产中可用电磨研磨。细菌和植物组织细胞的破碎也可用此法。(2)匀浆匀浆这是一种较剧烈的破碎细胞的方法，通常可先用家用食品加工机将组织打碎，然后再用10000r/min20000r/min的内刀式组织捣碎机(即高速分散器)将组织的细胞打碎，为了防止发热和升温过高，通常是转10秒20秒，停10秒20秒，可反复多次。高压匀浆法适用于酵母菌、大肠杆菌、巨大芽孢杆菌和黑曲霉等。不适用于高度分枝的微生物。高速珠磨法是利用玻璃小珠与细胞悬液一起快速搅拌，由于研磨作用，使细胞破碎。超声波破碎法：实验室常用影响因素：频率、液体温度和粘度、处理时间等。(3)胶体磨胶体磨的基本原理是流体或半流体物料在离心力的作用下，强制通过高速相对运动的定齿与动齿之间，使物料受到强大的剪切力，磨擦力、高频振动和高速旋涡等复杂力等作用，有效地被粉碎、乳化、均质、混合，从而达到精细超微的效果。定转子间的高速相对运动是使胶体磨工作获得物理微细度的主要条件，只有提高磨盘的精密度与线速度，才能达到良好的加工效果。2. 物理破碎(1)压榨压榨是一种温和的、彻底破碎细胞的方法。在1000105Pa2000105Pa的高压下使几十毫升的细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。这是一种较理想的破碎细胞的方法，但仪器费用较高。(2)冷热交替冷热交替是在90左右维持数分钟，立即放入冰浴中使之冷却，如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎，细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此技术。(3)反复冻融反复冻融是将待破碎的细胞冷至1520，然后放于室温(或40)迅速融化，如此反复冻融多次，由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞破碎。(4)超声波超声波是借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器。破碎微生物细菌和酵母菌时，时间要长一些，处理的效果与样品浓度和使用频率有关。使用时注意降温，防止过热。 3.化学与生物化学破碎非机械法有化学法：采用化学试剂处理细胞，溶解细胞或抽提细胞组分酶解法利用酶（溶菌酶、蛋白酶、脂肪酶、核酸酶、透明质酸酶等）反应分解破坏细胞壁上特殊的键，以达破壁的目的。需与其它方法配合使用（辐射、渗透压冲击、反复冻融法等）途径：在细胞悬液中加酶或采用自溶作用(1) 有机溶剂有机溶剂是利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或SDS(十二烷基硫酸钠)等表面活性剂处理细胞，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，此技术也可以与研磨法联合使用。(2)自溶 将新鲜的生物材料存放于一定的pH和适当的温度下，细胞结构在自身所具有的各种水解酶(如蛋白酶和酯酶等)的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来，此法称为自溶法。该法使用时要特别小心操作，因为水解酶不仅可以使细胞壁和膜破坏，同时也有可能会把某些要提取的有效成分分解。（3）溶胀低渗溶液和低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，将细胞膜胀破释放出细胞内含物。(4)酶解用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶和酯酶等，于37，pH8，处理15分钟，可以专一性地将细胞壁分解，释放出细胞内含物，酶解破碎适用于多种微生物。例如从某些细菌细胞提取质粒DNA时，可采用溶菌酶(来自蛋清)破细胞壁，而在破酵母细胞时，常采用蜗牛酶(来自蜗牛)，将酵母细胞悬于0.1mmol/L柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲液(pH=5.4)中，加1蜗牛酶，在30处理30分钟，即可使大部分细胞壁破裂，如同时加入0.2疏基乙醇效果会更好。此法可以与研磨联合使用（5）渗透压冲击法胞放在高渗溶液中，由于渗透压作用，细胞内水分向外渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀释或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压发生突然变化，胞外的水分迅速渗入胞内，使细胞快速膨胀而破裂。（6）冻结-融化法将细胞放在低温（-150C），然后在室温中融化，反复多次，细胞壁破裂。（7）干燥法经干燥后的菌体，其细胞膜的渗透性发生变化，同时部分菌体会产生自溶，然后用丙酮、丁醇或缓冲液等溶剂处理时，胞内物质就会被抽提出来。破碎率定义为被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分比数，即：Y(%)=(N0-N)/N0100 N0原始细胞数量N经t时间操作后保留下来的未损害完整细胞数量目前N0和N主要通过下面的方法获得 ：直接计数法在血球计数板用显微镜观察，直接对适当稀释后的样品进行计数。间接计数法间接计数法是在细胞破碎后，测定悬浮液中细胞释放出来的化合物的量（例如可溶性蛋白、酶等）。通过做法是将破碎后的细胞悬浮液离心分离掉固体（完整细胞和碎片），然后用Lowry法测量上清中的蛋白质含量。在众多的细胞破碎方法中高压均浆和珠磨两种机械破碎方法，处理量大，速度非常快，目前在工业生长上应用最广泛。但在机械法破碎过程中，容易产生大量的热量，使料液温度升高，而易造成生化物质的破坏，特别是在超声波处理时。因此，超声波振荡法主要适用于实验室或小规模的细胞破碎。非机械法一般仅适用于小规模应用。渗透压冲击和冻结融解法都属于较温和的方法，但破碎作用较弱它们常与酶解法结合起来使用，提高破碎效果。干燥法属于较激烈的一种破碎方法，容易引起蛋白质或其它组分变性。在具有特异结合甘露糖基的雪花莲外源凝集素(Galanthusnivalisagglutinin,GNA)具有多种生物活性,在糖蛋白分离、逆转录病毒病和害虫防治等方面有广泛的应用价值。该试验分别采用超声破碎法、冻融裂解法和溶菌酶法破碎重组大肠杆菌细胞后,经尿素或SKL(十二烷基肌氨酸钠水溶液 )溶解后 ,再透析复性获得了在大肠杆菌 (E .coli)中高效表达的重组GNA蛋白,并经SDS -PAGE电泳检测GNA的大小、浓度及表达量。通过对诱导表达时间、超声处理的功率、时间、模式、尿素和SKL洗涤浓度,透析条件的优化组合 ,建立了一套从大肠杆菌细胞中分离重组GNA蛋白的有效方法 ,为进一步的重组GNA生物活性试验提供了物质基础。破碎方法的选择对于破碎结果和破碎的质量有很大的影响。方法的选择依据一般主要有（）处理量（）产物对破碎条件（温度、化学试剂、酶等）的敏感性以及产物在细胞中的位置（）生化物质的稳定性（）细胞的数量和细胞壁的强度（）破碎程度（）提取分离的难易。适宜的细胞破碎条件应该从高的产物释放率、低的能耗和便于后续提取这三方面进行考滤。抗氧化剂对根瘤土壤杆菌细胞破碎的研究中考察了研磨法、有机溶剂法和超声波破碎法对根瘤土壤杆菌细胞破碎的影响。结果表明，在有机溶剂破碎条件下，最佳搅拌时间为35h，此时CoQ10的含量为5703mgL；由正交实验分析得出，菌体浓度为40mgmL，作用时间为12min，破碎功率为2