《分子克隆工具酶》PPT课件.ppt

基因工程 田长恩Tel基因工程 1基因工程概论 2天然DNA的制备 3分子克隆工具酶 4分子克隆载体 5表达载体 6PCR技术及其应用 7基因文库的构建 8基因克隆的筛选策略 10细菌基因工程 11酵母基因工程 12植物基因工程 13动物基因工程 14基因工程的安全 9转基因及其表达 3分子克隆工具酶3 1限制性核酸内切酶与DNA切割概念 restrictionendonuclease 一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列 并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶 endo deoxyribonuclease 生物学意义 是生物细胞内限制性修饰系统的一部分 可防止外源DNA的入侵 图 生物在长期的演化过程中 含某种限制性核酸内切酶的细胞 其DNA分子中或者不具备这种限制性核酸内切酶的识别序列 或者通过甲基化酶把甲基转移到识别序列的碱基上 保护相应序列不被酶切割 分布 细菌 少数霉菌和蓝藻中也有 类型 即I II和III型酶 各具特性 表 分子生物学和基因工程操作中用的是II型酶 PhageinjectsDNAintoE coli REbindstophageDNA PhageDNAiscleaved REcannotbindstorecognitionsequence Recognitionsequencearemethylated E coliDNA TherestrictionandmodificationsysteminE coli 命名 以酶的来源生物的属名和种名的第1 2个字母以及菌株 型 的代号来命名 如果从同一生物中先后提取到多种限制性核酸内切酶 则依次用罗马数字表示 例如 从HaemophilusinfluenzaeRd中提取到的第三种限制性核酸内切酶被命名为HindIII 作用机制 以环状和线形的双链DNA为底物 在合适的反应条件下 识别特定的核苷酸序列 使两条核糖核苷酸链上特定位置的磷酸二酯键断开 产生具有3 OH基团和5 P基团的片段 图 黏性 突出 末端的产生 内切酶造成DNA分子的断裂类型 i 黏性 突出 末端 两链的断裂位置交错 对称地绕着一个对称轴排列所形成的断裂 ii 平末端 两条链上的断裂位置处在一个对称结构的中心所形式的断裂 II型限制性核酸内切酶的基本特性与I及III型限制酶不同 II型酶只有一种多肽 并常以同源二聚体存在 具三个基本特性 i 在DNA双链的特异识别序列切割DNA 产生断裂 ii 通常2个单链断裂部位在DNA分子上不直接相对 iii 因此 断裂形成的片段往往具有互补的单链延伸末端 识别序列 能识别的核酸链上特殊的核苷酸序列 绝大多数的II型酶的识别序列由4 8个特定的核苷酸组成 其中以6个为多 II型酶从识别序列内切割DNA 识别序列多连续 如GATC 少间断 如GANTC 其共同特点是 双重旋转对称的结构形式 即回文结构 图 切割位点就旋转对称轴而言位于对称的位置 产生黏性末端有两类 3 OH 5 P 3 OH5 P DNA的识别序列数 在随机排列的DNA中 由n个核苷酸组成的内切酶识别序列出现一次的概率为4n 有的限制酶识别序列包含在另一种限制酶识别之内 如Sau3AI GATC BamHI GGATCC 识别序列的多样化 一些限制酶能识别多种核苷酸序列 如HindII 同裂酶 识别序列相同而来源不同的酶 isoschizomer 同裂酶的用途 有些同裂酶对碱基甲基化的敏感性不同 可用来研究DNA甲基化作用 例如 HpaII和MspI的靶子是CCGG 当靶序列中有5 甲基胞嘧啶 C CGG 甲基化碱基 时 HpaII不能切割 而MspI能切割 同尾酶 来源和识别序列各不相同 但产生出相同粘性末端的酶 isocaudamer 如BamHI BclI BglII Sau3AI和XhoII 产生粘性末端GATC 同尾酶用途 同尾酶产生的粘性末端 能够通过之间的互补作用而彼此连接 由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点 特称之为 杂种位点 hybridsite 一般不能再被原来的任何一种酶所识别 不过亦有例外 表 U Pu 嘌呤 Y Py 嘧啶 影响限制性核酸内切酶活性的因子DNA的纯度 消化速率取决于DNA的纯度 DNA制剂的污染物有蛋白 酚 氯仿 酒精 EDTA SDS 以及盐离子等 都可能抑制制酶活 解决途径 增加酶量 每微克DNA可高达10单位或以上 扩大反应体积 以稀释抑制因素 延长反应时间 提高纯度 加入聚阳离子亚精胺 终浓度为1 2 5mmol L DNA的分子结构 构型影响酶活 某些酶切割超螺旋的质粒或病毒DNA所需要的酶量要比消化线性DNA的高许多倍 最高可达20倍 侧翼序列 a大多限制酶只对两侧存在侧翼序列的识别序列起作用 如EcoRI不能对GAATTC作用 而可作用于ATGAATTCGC b一些限制酶 对不同具有不同侧翼序列的限制位点的切割效率不同甚至有些位点很难被切 如NarI NaeI SacII以及XmaIII等 甲基化程度 识别序列中特定核苷酸的甲基化影响酶活 正常大肠杆菌有两种使特定核苷酸甲基化的酶 dam甲基化酶 催化GATC中A的甲基化 dcm甲基化酶 催化CCATGG中内部的C甲基化 因此 从正常大肠杆菌中分离的质粒 能被限制酶局部甚至不被消化 解决途径 a使用缺失甲基化酶的菌株制备质粒DNA b尝试同裂酶 酶切反应的温度 不同的限制酶 具不同的最适温度 低或高于最适温度影响酶活 甚至完全失活 多数限制酶的标准反应温度是37 有的低于37 如SmaI25 ApaI30 有些则高于37 如MaeI45 BelI50 MaeIII55 BstEII60 TaqI65 等 反应的缓冲液 标准缓冲液包括氯化镁 氯化钠或氯化钾 Tris HCl 巯基乙醇或二硫苏糖醇DTT以及牛血清白蛋白 BSA 等 阳离子 酶活性的正常发挥需要二价阳离子 通常Mg2 不正确的Na或Mg2 浓度会降低酶活 还可导致识别序列特异性的改变 部分酶对 Na 或 K 变化十分敏感 而另一部分酶可适应较广变幅的离子强度 缓冲系统 Tris HCl 偶用Tris Ac 使反应混合物的pH恒定在酶活性所要求的最佳值 绝大多数限制酶的最佳pH为7 4 巯基试剂 抗氧化 保持酶的稳定性 限制酶的Star活性 在特定条件下 某些酶在非识别序列处切割DNA的现象称为Star活性 Star活性因限制酶种类 DNA和反应条件的不同而不同 高浓度酶 高浓度甘油 低离子强度 Mn2 取代Mg2 或高pH 几乎所有限制酶都具有Star活性 易产生Star活性的限制酶见p26 解决途径 尽量避免 即使是降低酶活性 DNA分子的片段化1 单酶切用一种限制酶切割DNA分子 环状DNA完全酶切 产生的片段数是限制酶识别序列数 线形DNA完全酶切的结果 产生的片段数限制酶识别序列数加1 底物 缓冲液 H2O 酶活性 总体积往往为1U 20微升 完全酶切后进行琼脂糖凝胶电泳 紫外成像 2 双酶切用两种不同的限制酶切割DNA分子 无论环状 还是线形分子 经双酶切所产生的DNA片段的两个末端不同 同尾酶切割除外 环状DNA完全酶切 产生的片段数是两种限制酶识别序列数之和 线形DNA完全酶切的结果 产生的片段数是两种限制酶识别序列数之和加1 反应条件相同或相近 可用同一缓冲系统 同时进行双酶切 完全酶切后进行琼脂糖凝胶电泳 紫外成像 反应条件不同 a不同温度时 先低温后高温 b不同盐浓度时 先低盐 后再高盐 c反应系统相差很大时 第一种酶切割后 用酚 酚 氯仿和氯仿抽提 乙醇沉淀DNA 或电泳分离 再用第二反应系统 进行第二酶切 3 部分 不完全 酶切对DNA分子上的全部识别序列进行不完全的切割 原因 底物纯度低 识别序列甲基化 酶量不足 反应体系和温度不适宜 反应时间不足 结果 影响欲获得DNA片段的得率 用途 根据DNA重组的需要 专门创造部分酶切的条件 以获得所需DNA片段 DNA分子作图 A 完全酶切 B 部分酶切 DNA的限制性图谱DNA分子上限制性核酸内切酶的识别序列分布图称限制性图谱 restrictionmap 或物理图谱 physicalmap 见图 限制性图谱可以是所有限制酶 也可以是部分限制酶的识别序列分布图 限制性图谱是基因工程工作者设计DNA重组的重要依据 对于未测定序列的DNA分子来说 可用下面的一些方法绘制出它的限制性图谱 1 双酶切法 自学 2 部分酶切法 自学 3 末端标记部分酶切法 EP 4 Bal31逐步切割法Bal31是一种核酸酶 能从DNA分子的两断逐个切割核苷酸 先用此酶进行不同时间的切割 再用相应的限制酶 如EcoRI 完全酶切 根据电泳结果得出限制性图谱 3 2DNA连接酶 ligase 3 2 1连接酶的功能1 缺刻修复 2 连接两个DNA分子 WeusuallyuseT4ligaseinjoiningDNAfragmentsincludingStickyandbluntends Mechanism ligationtakesplacebetween5 Pand3 OH 3 2 2Cloningstrategy3 2 2 1LigatingbluntendsItisverydifficulttojoinstickyendsofDNA Underthehighertemperature 22 condition largeamountofsubstratesandenzymeshouldbeusedtoincreasethechancesoftheendsofthemoleculescomingtogetherinthecorrectway 3 2 2 2ligatingstickyendsItisveryeasilytojoinstickyendsofDNAbecauseofhydrogenbundsformationbetweenbasepairs thetemperaturecanbeat16 Soweshouldtrytogetstickyendsingenecloning 3 2 2 3OtherwaystoobtainstickyendsAddlinkers 连接体 tobluntends Linker Ashort sequence known syntheticds DNAwithrestrictionsiteandbluntends 2 Addadaptors 衔接头 tobluntends adaptor Ashort sequence known syntheticoligaonucleotides 寡核苷酸 withstickyendsinwhichrestrictionsiteexists 3 2 2 4Directionalcloning 定向克隆 Itisveryimportanttokeepcorrectdirectionbetweentheinsertandlinearvector astheclonedgenemustbeplaceddownstreamofpromoterincorrectdirection Promoter Terminator AUGUAAdeletion GATCC GGATCC GG CCTAGG CCTAGresultIGATCC GGATCC GG CCTAGG CCTAGresultII GATCC GGATCC GG CCTAGG CCTAGBmaHIBmaHI Insert Vector Insert Insert Vector Vector 1 Nondirectionalcloning ligationbetweenbluntends oneREdigestionproducts GATCC GCTAGG CresultIII GATCC GGATCC GG CCTAGG CCTAGBmaHIBmaHI Insert Vector Vector Selfligationofvector Howtoavoidselfligationofvector Deletionof5 PoflinearvectorwithBAP CIPisausualmethod AATTC GAATTC GG CCTAGG CCTAGEcoRIBmaHIEcoRIBmaHIGATCC GAATTC GG CTTAAG CCTAGEcoRIBmaHI 2 Directionalcloning ligationbetweentwoREdigestionproducts Directionalcloning Insert Insert Vector Vector Nucleases 核酸酶 cut shortenordegradenucleicacid suchasBal31 ExonucleaseIII DNaseI nucleaseS1 Polymerase 聚合酶 makecopiesofnucleicacid suchasDNApol I RTase RNApol Modifyingenzymes 修饰酶 removeoraddchemicalgroups suchasBAP CIP polynucleotidekinase terminaltrasferaseTopoisomerases 拓扑异构酶 introduceorremovesupercoilsfromcovalentlyclosedcircularDNA cccDNA 3 3其他酶 3 3 1Nucleaes1 Exonuclease 核酸外切酶 Bal31ExonucleaseIII 2 endonuclease 内切酶 DNaseI S1nuclease 5 3 ExonucleaseActivity3 5 ExonucleaseActivityDNAPolymeraseActivity 3 3 2DNAP