自然基金申请书写作技巧

如何撰写申请书,一、摘 要（限400字）包括：研究方法、内容、目标、科学意义。,如：采用方法，进行研究， 阐明机制或揭示规律， 为奠定基础提供思路。,作用：画龙点睛效果：引发评议专家的兴趣，使其产生探个究竟的好奇心 “他到底是怎么做的 ？ ”,采用改良的消减杂交技术建立老年性白内障晶状体上皮细胞差异表达基因文库并制备基因芯片，利用此芯片筛选出白内障相关基因。通过基因转染在体和培养的晶状体上皮细胞，观察细胞的形态、增殖和凋亡、骨架蛋白及晶状体蛋白的变化，研究基因的功能。从晶状体上皮细胞的角度阐明老年性白内障发生的分子生物学机制，为防治白内障提供新思路和理论依据。,摘 要(限400字)以本课题组首先发现的大白菜细胞核复等位基因型雄性不育材料为试材，通过该不育材料与大白菜自交系Chiifu(多国芸薹属植物基因组计划MBGP的基础材料)进行杂交,构建F2群体。在F2分离群体中,采用BSA与AFLP相结合的方法寻找与不育位点连锁的AFLP标记。根据连锁标记在150个F2个体中的基因型，利用JoinMAP创建不育位点的遗传连锁图谱。利用本课题组开发的SCAR标记高效转化技术，将与该不育位点紧密连锁的AFLP标记转化为共显性SCAR标记。SCAR标记的转化有利于通过分子标记辅助选择,加快核基因雄性不育系的转育进程。同时，以Chiifu作为亲本材料，有助于利用Chiifu已知的基因组序列及其高密度的SSR遗传连锁图谱，为下一步图位克隆该位点复等位的不育基因、恢复基因和可育基因奠定基础。本研究对于进一步开发利用我国特有的、十分珍贵的大白菜核不育复等位基因遗传资源具有重要意义。,摘 要(限400字)：辽宁绒山羊是我国重要的地方品种资源，虽然产绒量高，但个体间差异较大，且绒较粗。进一步提高辽宁绒山羊产绒性能必将加强其在国际市场上的竞争力，巩固我国绒山羊业的优势地位。本课题通过饲养试验，研究不同硫源和硫水平下辽宁绒山羊的采食量、产绒量、绒品质（细度、长度、氨基酸含量等），以此研究硫营养对产绒性能的影响效果。然后通过消化代谢试验和消化动态学试验，研究硫营养对氮硫代谢、瘤胃发酵、营养物质降解率等的影响；通过皮肤切片，研究硫营养对毛囊活性和形态的影响；采用放射免疫（RIA）法，研究硫营养对毛囊激素影响；采用“RT-PCR”技术，研究硫营养对毛囊激素受体基因表达的影响，从而全面研究硫营养影响辽宁绒山羊产绒性能的机制，为通过硫营养调控绒山羊产绒性能提供理论基础和技术依据，也为通过激素、转基因等手段提高绒山羊产绒性能奠定基础。,二、立论依据 （研究意义、国内外研究现状及分析，附主要参考文献目录。） 对基础研究，着重结合国际科学发展趋势， 论述科学意义 对应用基础研究，着重结合学科前沿，围 绕国民经济和社会发展中的迫切需要解决的关键科技问题和重要科技问题 论述应用前景,在立论依据的阐述中，对研究领域、研究方向、 具体科学问题的理解 研究领域：白内障的研究，包括发病机制、预防、诊断、 治疗措施等研究 研究方向：白内障发病机制的研究，包括环境因素、致病 靶点、细胞水平、分子水平研究等 科学问题：白内障发病过程中的相关基因研究，包括致病 基因筛选、功能研究、调控机制、信号 转导等,在研究领域层面,从研究方向展开,围绕某一具体科学问题（本项目研究目标）进行归纳分析,提出研究设想,从研究领域切入,研究意义,国内外现状分析,1、项目的研究意义 存在问题：对科学意义的阐述不足或夸大 撰写方法： 从领域入手，提出主要问题，引出热点研究方向。 围绕热点研究方向进行简要分析，找出目前尚未解决的具体科学问题，以此为切入点提出假设，阐述如果解决了该问题（研究目标），对该领域甚至相关领域的科学贡献（理论意义或应用前景）。,例1： 老年性白内障是与年龄相关的疾病，随着年龄的增加，其发病比率也不断升高。特别是人类趋向老龄化，白内障的患病人数还将持续增加。目前，它已是人类第一位的致盲疾病。迄今为止, 治疗白内障唯一有效的方法是通过手术摘除混浊的晶状体并植入人工晶状体。 虽然手术后患者可以恢复良好的视力，但是不可避免的术后并发症以及手术设备、材料耗资巨大，治疗白内障所花费的资金已成为世界各国包括富裕的发达国家严重的医疗负担。最近的调查表明，如果把老年性白内障的发病时间延缓10年，白内障手术的数量就会减少45%1。 所以，一些学者认为通过预防白内障发生或延缓其发展的途径征服白内障已成为一项全球性的社会和社会经济问题2。,但是目前我们对老年性白内障发病机理的认识还不十分清楚。多年以来许多学者的研究结果证实晶状体上皮细胞在老年性白内障发生中起重要的作用，但对其中进一步的基因调控知之甚少。如果从参与老年性白内障晶状体上皮细胞变化的相关基因入手，研究基因的生物学功能，有可能抓住引起白内障发生、发展的主要环节。据此，本研究拟利用改良的消减杂交技术和基因芯片技术准确、全面、快速的特点，以晶状体上皮细胞为研究对象，一次性筛选出老年性白内障全部有差异表达的基因，从中再筛选出与白内障相关基因，并着重对其功能进行研究，从基因水平阐明白内障的发病机制，为防治白内障提供新思路和理论依据。,例2：山羊绒是纺织工业中最上乘的动物纤维纺织原料，被称作“纤维宝石”。辽宁绒山羊是辽宁省重要的地方品种资源，被誉为“中华国宝”、“中国绒山羊之父”。因此辽宁绒山羊对于我国绒山羊的发展起着至关重要的作用。绒的产量和品质同等重要，国际市场实行“优质优价”的贸易原则。羊绒的细度是羊绒价格的决定性因素。国际上将低于14m的绒毛视为最珍贵的纤维，其价格要高于其它绒毛一倍以上。辽宁绒山羊虽然产绒量高，但绒的细度不理想，这不可避免地影响其在国际市场上的竞争力。因此，必须改善辽宁绒山羊绒的品质，进一步巩固我国山羊绒生产的优势地位。硫营养对羊毛（绒）的产量和品质有重要的影响。但目前对绒山羊的硫营养研究还很缺乏，尚需要对绒山羊饲料中的硫含量、硫对绒山羊生长和产绒的影响以及影响机理等作进一步研究。本项目拟以补饲硫的形式，从营养学、生理学、组织学等角度，全面研究硫营养对辽宁绒山羊产绒性能的影响及其机制，并从基因水平阐明羊绒生长调控的生理学基础。本研究的开展可为确定辽宁绒山羊的硫营养标准，为通过饲料配合或使用组织代谢调控剂、转基因等手段，提高辽宁绒山羊的产绒性能提供相应的理论基础和技术依据，使我国绒山羊的研究水平赶上并超过世界领先水平，进而全面推动绒山羊业的发展。,2、国内外现状分析（与综述的区别） 存在问题： A、低水平重复：不了解最新进展，对国内外现 状缺乏真正了解，提出的问题别人已解决。 B、文献复习不全：检索文献方法不当、选择关键词 不妥，甚至人为缩小检索范围。 C、总结表达不够：对国内外现状缺乏归纳分析， 只是简单罗列，缺乏逻辑性和针对性。 D 、对方法原理理解不够：对研究方法不熟悉，简 单移植或夸大其作用，缺乏实际应用的可行性。,撰写方法：要紧紧围绕本次申请项目的主题。 A、从领域切入，简要论述国内外研究成果，并引 出当前的热点研究方向。 B、从研究方向展开，较详细地分析国内外的研究 进展，阐明在该方向上存在的问题。 C、围绕存在的问题，结合国内外以往的研究结果、 当前的现状及今后的发展趋势，详细论述和分 析这些问题产生的原因，提出该方面的空白点、 未知数、以及研究的难点、焦点，从而为自己 申请项目确立研究目标奠定充分的立论基础。,D、对拟采用的技术方法进行介绍和分析。 成熟的方法重点介绍可以应用于本研究的理论依据和实验依据。 新方法在详细介绍其原理的基础上，阐明可以应用于本研究的理论依据和实验依据。 需特别注意的问题：必须对所运用的技术方法的原理、流程尤其是在实际运用中可能出现的问题要十分清楚，绝不能是一种简单的移植。 例如：抗体 + 功能基团，理论上可以实现融合，但存在“活性、表达载体选择、纯化等问题。 E、提出本项目的研究设想。,例1 防治白内障必须针对其发病的主要环节。多年以来，国内外学者从不同的角度探讨白内障的发生机理。就致病的环境因素讲，氧化因子、紫外线辐射、晶状体周围环境中离子浓度改变及一些生长因子、细胞因子的改变均与老年性白内障的发生有关。就研究的部位分，晶状体中皮质与核的蛋白质改变及晶状体纤维的改变与白内障的形成有关，而位于晶状体前囊膜下单层的晶状体上皮细胞在白内障的形成中的变化更引人关注。,因为晶状体上皮细胞是晶状体中唯一有分裂活性、数量相对稳定的细胞，它们分裂、分化出晶状体纤维细胞、产生晶体蛋白，终生不停息，形成了晶状体均一、对称的结构，对维持晶状体的透明起重要作用。不仅如此，晶状体上皮细胞还是晶状体中受外来刺激影响较早的部位，已有研究证实老年性白内障的晶状体上皮细胞还发生退行性变、细胞膜通透性增加、细胞内酶活性改变、细胞数量减少、凋亡细胞增多等改变，与单纯老化的晶状体之间存在差异3-5 。,体外实验也证实多种因素(H2O2、UV-B、晶状体蛋白的自身抗体)诱发的白内障模型中晶状体皮的损伤是晶状体混浊的主要环节6-8。因此，从晶状体上皮细胞的变化入手探讨白内障的成因，有可能抓住揭示白内障发病机理的主要环节。而晶状体上皮细胞变化的基因调控机制是问题的关键所在，也是有待我们深入研究的问题。,白内障的形成与晶状体的老化密不可分，是晶状体老化的极端表现。晶状体的老化是多种因素相互作用的结果，包括基因的和非基因的随机变化的不断积累，也有程序性的、非随机性的组织特异性多种基因表达的改变。目前，国内外对白内障相关基因的研究主要以下三方面：,一是对体外培养的晶状体白内障模型及上皮细胞的研究。UV-B辐射作用诱导的白内障中晶状体上皮细胞是主要的靶细胞，其Na-K-ATP酶的活性增加，蛋白质的合成和分泌增加；上皮细胞的凋亡增加，其中有c-fos基因的表达增加；还有组蛋白H4、H3 的低表达和蛋白酶C、-肌动蛋白、-肌动蛋白基因的高表达9-12。Carper等13利用RT-PCR-DD(reverse transcription-polymerase chain reaction differential display)技术研究H2O2诱导的晶体上皮细胞的基因差异性表达结果显示NADH脱氢酶4亚基、细胞色素b、谷氨酰胺转移酶基因表达减少以及细胞因子的核蛋白、替代拼接因子2 （alternative splicing factor）、-三羟基异丁酰辅酶A水解酶基因表达的增加。,二是利用转基因动物的研究。波形纤维蛋白基因（vimentin）、杂交的型中间纤维蛋白基因的转基因小鼠表现出白内障，而且有随小鼠年龄增加白内障加重的趋势。晶状体改变的共同特点是晶状体纤维细胞分化受抑制14,15。Gong等16报告晶状体的细胞膜蛋白连接蛋白3（3 Connexin）基因敲除小鼠（knockout mouse）在晶状体形成的早期及纤维细胞分化早期不受影响，其后出现与晶状体蛋白溶解有关的核性白内障。 虽然体外实验和白内障转基因小鼠都提示我们一些基因的变化与白内障有关，但是，这些变化的基因是否与老年性白内障形成有关，目前尚缺乏进一步的报告。,三是对人老年性白内障晶体上皮的研究。Lee17利用RT-PCR技术研究显示前极性白内障与核性白内障上皮细胞中纤维连接蛋白、I型胶原纤维、-平滑肌蛋白、TGF-1、TGF-2、TGF-型受体、结缔组织生长因子的基因表达有差异。Kantorow等18利用RT-PCR-DD研究老年性白内障与正常晶状体上皮的基因差异性表达的初步结果是老年性白内障有三个高表达基因和12个低表达的基因。但就DD-PCR技术来讲，在实验中难以解决假阴性、假阳性以及克隆全长cDNA的问题。,上述三方面的研究均取得了不同程度的研究结果，但由于当时技术条件的限制都未能全面阐明与白内障相关的基因及其功能。 寻找白内障时晶状体上皮细胞与正常晶状体上皮细胞间差异表达的基因有可能揭示白内障的发病机理。,寻找差异表达基因的经典方法是消减杂交技术（subtractive hybridization, SH），它是，但是实验操作复杂。 经过改进后的抑制性消减杂交（suppression subtractive hybridization ,SSH是Diatchenko等1996年建立的方法）简化了实验操作，但仍然问题很多。 我校生化教研室建立了改良消减杂交技术19，20，其特点是：简便易行，能够获得目的细胞特异表达的全长基因，对低丰度基因也能有效分离。,该方法的建立者已利用这一技术从脂多糖刺激前后的人牙髓细胞的差异表达的基因中克隆到脂多糖刺激后特异表达的基因，其中5个为新基因。同理，利用此方法也能快速、有效地获得白内障晶状体上皮细胞与正常晶状体上皮细胞间差异表达的基因，并克隆到全长cDNA，为进一步的结构和功能研究打下基础。,基因芯片技术的出现，使检测差异表达基因和未知DNA分子变得更快捷、准确、高效。基因芯片是在1996年被提出并开始研制的，该技术是将成千上万的DNA探针集中到1厘米见方的基片上，利用碱基互补原理，DNA探针中的已知碱基序列与被测定的未知DNA分子杂交后由标记分子标记杂交体，经自动阅读设备分析杂交结果，从而对检测基因进行定性、定量和结构分析，确定未知DNA分子。,由于目前尚没有针对白内障研究的现成基因芯片，根据本研究的需要，我们将筛选到的差异表达的所有基因建立cDNA文库，再利用基因芯片技术制备成基因芯片，以此检测多个样本中白内障晶状体上皮细胞与正常晶状体上皮细胞间差异表达的基因，从中进一步筛选出白内障特异的基因，它们中可能有已知基因，也可能有未知基因。通过以上两种技术的有机结合，我们能更快捷、有效、准确地得到白内障相关基因。,综上所述，分子生物学技术的发展为研究白内障发生过程中的功能基因及特异调控基因提供了有利武器。本项目从晶状体上皮细胞入手，利用改良的消减杂交技术和基因芯片技术系统研究与白内障相关的基因，并采用对体外培养细胞和在体晶状体上皮细胞的基因转染，探讨它们在晶状体上皮细胞变化和白内障形成中的作用，可望阐明白内障晶状体上皮细胞变化的分子生物学机制，为防治白内障提供新的思路和理论依据。,例2 国内外研究现状及分析：1硫与生长：硫是反刍动物的必需营养素，不能在体内储存，必须由日粮供给。缺硫时羊的增重降低。若硫过量，会降低家畜的采食量。Johnson（1968）发现，饲粮中以CaSO4或Na2SO4形式添加0.5%硫，会妨碍羔羊的生长，降低采食量，影响饲料转化效率。Qi 等（1992）报道日粮中添加不同水平的硫促进马海毛生长，但对安哥拉山羊增重没有影响。而Kahlon等（1975）试验结果表明，添加硫增加氮、硫沉积量，羔羊体重显著提高。吴海霞（2004）研究发现，无水硫酸钠对绒山羊的增重有一定的促进作用，且发现0.6%剂量无水硫酸钠添加量己能满足绒山羊长绒后期正常生长时硫的需要量，再继续增加并没有表现出日增重升高的趋势。绒山羊的生长直接影响产绒。本项目拟研究硫营养对辽宁绒山羊生长性能的影响，以确定辽宁绒山羊的适宜硫需要量。,2硫与产绒羊毛的高含硫量和二硫键结构是羊毛理化特性的物质基础，对羊毛产量和弹性、强度等纺织性能有重要影响。绒、毛越细，其含硫量越高，羊需硫量越高。饲料原料中的含硫量仅为绒、毛中的10%左右，必须要额外添加。反刍动物的硫需要量通常以氮硫比（NS）的形式表示。NRC（1988）推荐反刍动物NS为101，但有些试验结果表明不能满足动物的需要。Qi（1994）研究认为，安哥拉山羊产毛的适宜NS为7.21。Dwivedi等（1995）研究认为，适宜的NS为71101。可见，目前绒山羊饲养标准中硫的需要量远不能满足其生长发育和产绒的需要，致使绒山羊的产绒量不高、绒的品质不好。因此迫切需要加强绒山羊的硫营养研究。硫源可分为无机硫（硫磺、硫酸盐）和含硫氨基酸（蛋氨酸）。Marston（1955）认为含硫氨基酸是羊毛角蛋白合成的限制性氨基酸。无机硫通过瘤胃硫素再循环产生含硫氨基酸，从而对山羊绒的生长产生影响。,目前大部分研究主要针对绵羊和安哥拉山羊，普遍发现补饲硫可提高毛纤维的产量及毛品质。对于绒山羊研究的很少，集中在国内。王娜（1999）评定了内蒙古白绒山羊日粮适宜NS，认为绒毛生长旺盛期适宜硫水平为0.186%，NS为7.631。吴海霞（2004）研究发现，添加无水硫酸钠对产绒量有增加的趋势；对羊绒细度无显著影响，但显著提高羊绒强度和伸直长度。彭玉麟（2000）研究表明，补饲含硫氨基酸提高了羊毛中的含硫量和毛的生长率，不同程度地增加产绒量。谢实勇（2002）研究发现，包被蛋氨酸在绒生长旺盛期显著提高了羊绒生长率和羊绒长度，但对羊绒细度、含硫量和含硫氨基酸的比例没有显著影响；但Teh等（1991）认为，蛋氨酸可使绒纤维直径变粗。Sahlu等（1992）也发现给安哥拉山羊每天灌注1克蛋氨酸，纤维直径也增加。可见，不同的硫源和硫水平对产绒性能（尤其是细度）的影响还有待进一步研究，以进一步确定辽宁绒山羊的适宜硫需要量。,3硫与消化瘤胃pH和氨氮浓度是评价羊瘤胃发酵情况的重要指标。目前硫对瘤胃发酵的影响报道不一。Hume 等（1970）和Weston 等（1988）发现添加硫使绵羊瘤胃pH显著降低，但Elliott等（1982）试验表明添加硫不影响瘤胃pH，而Qi等（1992）发现，随硫采食量的增加安哥拉山羊瘤胃液pH升高，但对阿尔卑奶山羊瘤胃液的pH影响不大。Kennedy等（1972）和Elliott等（1982）报道在基础日粮中添加硫，使氨氮浓度提高；王娜（1999）报道，在山羊绒生长旺盛期（9-12月）添加硫磺使瘤胃液的pH升高，氨氮浓度降低。谢实勇（2002）研究发现，日粮中添加硫酸钠、蛋氨酸和蛋氨酸锌提高了内蒙古白绒山羊瘤胃pH和氨氮浓度，包被蛋氨酸对二者无显著影响。,硫代谢与氮代谢密切相关，Bray（1975）研究发现，氮与硫的沉积量呈线性相关N=10.37S0.38（r=+0.952）。添加硫可以促进日粮氮沉积和瘤胃纤维发酵，提高有机物的表观消化率及瘤胃细菌蛋白质的合成（谢实勇，2002；王娜，1999；彭玉麟，2001）。过瘤胃蛋氨酸生物学效价高于硫酸钠（谢实勇，2002），硫酸钠对内蒙古白绒山羊的效果好于硫磺和硫化钠（彭玉麟，2001）。可见，不同硫源和硫水平对绒山羊瘤胃发酵和营养物质消化的影响还需要进一步研究，以确定硫营养对辽宁绒山羊消化代谢的影响，并由此研究影响产绒性能的消化代谢机制。,4硫与毛囊绒毛由次级毛囊产生。因此揭示皮肤和毛囊的发生发育规律将对绒山羊的生产有积极的指导意义。Parry A.L.等（1992）研究了澳大利亚绒山羊初生、57日龄、107日龄和301日龄4个阶段的毛囊密度、S/P比例；林均德等（1991）对辽宁绒山羊成年羊的毛囊结构、毛囊密度和S/P比例进行了观察研究。绒毛的生长呈现周期性变化规律，在一个年周期内次级毛囊活动通常经历兴盛期(anagen)、退行期（catagen）和休止期（telogen）。绒山羊因品种不同，各时期的启动、延长时间也不同。绒山羊各品种间绒毛产量不同是由于总次级毛囊数、绒毛生长期（即从次级毛囊开始活动到休止的时间）和绒毛生长速率（由毛囊的有丝分裂速率决定）不同造成的。据文献报道，不同绒山羊间差异的主要原因是各种次级毛囊有丝分裂速度的不同。孙海洲等总结认为新纤维长出时间取决于毛囊球细胞有丝分裂的速率而不是启动时间。,囊球细胞数目和囊球的大小以及毛纤维直径呈强相关，这在许多不同品种的绵羊上都已证实（Schineckel，1961；Hynd，1989b）。而囊球细胞的分裂速率和囊球细胞的大小有关（Hynd，1989a）。营养水平影响细胞水平，自然也影响到分裂速度。含硫氨基酸供应量明显影响囊球细胞的分裂速度。囊球细胞分裂对营养素的需要量可能更接近于正常细胞，而增生细胞的分化进一步角质化需要更多的含硫氨基酸。营养水平对皮质细胞体积的影响也与绵羊品系有关，高产美利奴绵羊皮质层细胞体积对营养的变化非常敏感，而低产羊没有反应（Willians 和Winston，1987）。添加硫对绒山羊是否具有同样的反应趋势需要进一步。本课题对毛囊活性变化、皮肤下毛囊深度、次级毛囊毛球宽等作详细地研究，观察其在各个生长周期内的变化规律，旨在为进一步研究硫营养的影响机制提供科学依据，同时为分子机理方面的研究提供形态学方面的基础数据。,5硫与激素毛囊的发育和活动的调控机制，可分为决定毛囊发育和活动模式的控制机制及环境因素对其具体进程进行修饰的调节机制。环境信息主要包括光照、温度和营养。环境信息是通过生理调节系统实现对毛囊发育和活动调节的。绒山羊接受环境信号后，将信息传递给毛囊及毛囊周围组织，调节某些生长因子或抑制因子，最终实现对毛囊发育、毛囊活动的启动和休止以及毛囊的有丝分裂速率的调节。绒山羊毛被生长的调控因子主要是褪黑素、类胰岛素生长因子（IGFs）、催乳素和生长激素等。在绒毛生长期和停止生长期通过外源褪黑素处理可显著提高绒山羊产绒量（文献）。在非产绒季节采用皮下埋植和注射褪黑素能不同程度地使山羊生产出羊绒（文献）。类胰岛素生长因子（IGF-I）可促进绒山羊次级毛囊的生长（文献）。Damak等（1996）把IGF-I基因构建到角蛋白启动子下得到转基因绵羊，并在毛囊中表达，可使净毛量平均增加6.2%。目前还不知道，光照对绒毛生长速率的调节是否是通过IGF-I发挥作用的，褪黑激素的分泌与IGF-I的作用是否有直接或间接的联系。,绒山羊毛囊中存在催乳素受体，可以初步认为催乳素对绒山羊毛囊的发育有直接作用（张焱如，2001）。高水平催乳素对于处于休止期的次级毛囊来讲是一种活动信号，它将促使休止的次级毛囊进入夏季的绒纤维生长阶段，但对于处于活动状态的次级毛囊来讲则提供一种进入过渡期的信号，一旦绒开始生长，催乳素在维持绒纤维生长方面并非必需；高水平催乳素仅仅使休止期的初级毛囊进入活动态。褪黑素可能是通过催乳素对毛囊发挥作用的；类胰岛素生长因子（IGF-I）可能对毛囊球细胞起直接作用，也可能是通过催乳素起作用。关于不同的硫源和硫水平对各激素的影响鲜有报道。吴海霞（2004）研究发现，无水硫酸钠可促进生长激素的分泌，有助于羊绒的生长。本项目拟研究硫营养对绒山羊上述激素的影响，以此研究影响产绒性能的毛囊激素机制。,6硫与基因营养最终要通过体内生理状况的改变而起作用。绒山羊接受营养信号后，在体内生理调节系统产生和释放信号分子，这些信号被功能细胞的信号接受系统接收，再经过细胞内信号转导系统的传递，调节功能基因表达，从而最终实现对毛囊的发育和活动的调节。在绒毛快速生长的时候，毛囊细胞分裂的速度非常快，合成蛋白质效率很高，毛囊中蛋白质的快速合成及毛囊呈现明显的年周期性变化都是由皮肤组织基因调控的。成年绒山羊绒毛生长的特征和皮肤基因的表达有着十分密切的关系。在成年皮肤中，其它的组织结构相对稳定，而毛囊的基因表达最为活跃。,Sleeman等在2000年研究了大鼠毛乳头细胞的基因表达谱。Adelson等2004年研究了美利奴绵羊皮肤和羊毛中表达的基因，获得了重要的信息。在成年绒山羊绒毛生长的特征和皮肤基因的表达有着十分密切的关系。尹俊等（2005）研究发现，在众多的基因当中，高硫的KAP6-1基因的表达活性最高。此外，IGF-I基因直接影响毛囊的分裂。目前关于硫与对羊毛囊基因的影响还未见报道。此方面的研究将从基因水平揭示硫营养对绒山羊产绒性能的影响机制。,3、参考文献 A、文献类别要全：以英文文献为主，同时也要引用 中文文献- 国内同行中知名专家的文献。 B、引文信息要全：文章题目、作者姓名、具体出处 （包括期刊名、年份、卷期、页码等）。 C、文献年代要新：主要是近五年的文献，最好能有 07年的最新文献。,三、研究方案,1、研究目标 撰写要求： 有限目标，与研究内容相呼应,如：明确关系，揭示规律， 阐明原理（机制），建立方法等,举例1：筛选出与老年性白内障相关的基因，明确部分基因在白内障形成中的作用，从晶状体上皮变化的角度阐明白内障的发生机理，为防治白内障提供线索。,例2 ：通过研究葡聚寡糖激发子诱导及挑战接种黄瓜霜霉病菌前后黄瓜蛋白质组表达的差异，从蛋白质组角度阐明葡聚寡糖激发子诱导黄瓜抗病性的分子机制；明确部分黄瓜抗病相关蛋白质群和作用网络，推测和克隆抗性相关基因，为黄瓜抗病的遗传育种提供线索。例3 ： 1）探明在玉米-大豆长期轮作施肥条件下土壤磷素营养诊断与推荐施肥的关系；2) 明确长期定位施肥对磷素有效性及其形态转化及时间分布的影响；3) 探索不同施肥处理土壤中磷化合物的转化及其对磷在土壤中垂直分布的影响。例4 ： 通过对本研究室筛选分离的对植物寄生线虫有高毒力的真菌代谢产物菌线克的分离和纯化，解析该化合物的分子结构，进一步合成与该物质结构类似的化合物，在本研究室构建的杀线虫筛选体系的基础上，筛选创制出1-2种新型的具高杀线虫活性的组分或结构,丰富我国杀线剂种类，并为我国杀线剂的研发和创制奠定理论基础。,2、研究内容： 存在问题：内容过多，一个研究周期难以完成 内容分散，不能集中阐明研究目标 撰写要求：内容要适当确保研究周期内完成 为目标服务与目标相辅相成 要重点阐述注意与技术路线区别,举例1： （1）筛选白内障相关基因：采用改良的消减杂交技术，获得人老年性白内障晶状体上皮细胞和正常晶状体上皮细胞差异表达的基因片段，建立cDNA文库。制备差异表达基因的基因芯片，利用基因芯片技术从多个标本的老年性白内障晶状体上皮细胞中筛选出白内障相关基因。,（2）研究白内障相关基因的结构： （3）研究白内障相关基因在晶状体上皮细胞变化中的作用： 观察指标如下： 存活细胞数；光镜、透射电镜下细胞形态的变化；细胞凋亡检测：用原位末端标记和连接酶介导PCR方法，从形态和DNA水平分析细胞凋亡；细胞增殖的检测：；细胞骨架蛋白的检测：；晶状体蛋白的检测：,举例2：根据绒山羊产绒的季节性规律，按照产绒期（6月次年2月）和非产绒期（3月5月）两个阶段分别进行下列研究： 通过测定在不同日粮硫源和硫水平下辽宁绒山羊产绒期（6次年2月份）和非产绒期（35月份）的采食量、日增重、产绒量、绒品质（细度、长度和含硫量），来研究硫营养对辽宁绒山羊产绒性能的影响，并确定辽宁绒山羊日粮中适宜的硫源和硫水平； 通过测定不同日粮硫水平下辽宁绒山羊的氮硫代谢、食糜流通量、瘤胃发酵、营养物质降解率，来研究硫营养对辽宁绒山羊产绒性能的影响，即影响产绒性能的消化代谢机制； 通过皮肤切片，对毛囊活性变化、皮肤下毛囊深度、次级毛囊毛球宽等作详细地研究，观察其在一个生长周期内各时期的变化情况，以此探讨硫营养对辽宁绒山羊毛囊分裂速度和形态的影响，即影响产绒性能的毛囊调节机制； 通过测定不同日粮硫水平下辽宁绒山羊毛囊生长激素、褪黑素、催乳素和类胰岛素生长因子等，来探讨硫营养对辽宁绒山羊毛囊激素水平的影响，即影响产绒性能的激素调控机制； 研究硫营养对辽宁绒山羊毛囊类胰岛素生长因子IGF-I基因、催乳素基因等表达的影响，揭示硫营养影响绒山羊产绒性能的基因调控机制。,3、拟解决的关键问题： 存在问题：抓不住关键问题或抓得不准。 什么是关键问题 ？ -研究过程中对达预期目标有重要影响的某些研究内容或因素。 -为达预期目标所必须掌握的关键技术或研究手段。 撰写要求：找出关键问题，提出解决办法。,举例1： （1）建立差异表达的cDNA文库： 建立差异cDNA文库是筛选老年性白内障相关基因的前提。为使差异cDNA文库具有代表性，我们采取以下解决方案： 选择各种类型老年性白内障晶状体的前囊膜、取足够大量的标本（拟取50例标本）作为建库的mRNA的来源。 利用改良的消减杂交技术可快速、有效地获得差异表达的完整cDNA片段。此技术是本课题组成员主要的研究成果，在应用此项技术中已积累了较丰富的实验经验。,（2）制备基因芯片： 制备用于本研究的芯片是筛选老年性白内障相关基因的关键环节。制备基因芯片的关键是在 1平方厘米的基片上放上成百上千的不同基因探针而不使它们发生任何混淆。在制作基因芯片时做到：严格按操作程序进行；在标本的处理及RNA提取时避免污染，否则即会造成严重的损失。只要严格按操作程序进行操作就可以避免发生差错。,（3）在体基因转染： 在体基因转染是进行白内障相关基因功能研究的关键。在体的晶状体上皮细胞大部分处在静息状态，只有位于赤道前区的少量细胞具有分裂活性，而且晶状体表面有一层胶原性质的囊膜包裹。在体晶状体的基因转染的关键是如何使大量分裂后细胞转染，如何使病毒穿过晶状体的囊膜，针对以上问题我们拟采取下列方法解决：选用反转录病毒的慢病毒载体（ lentiviral vector ），它克服了一般反转录病毒只能转染有分裂能力细胞的局限性，对分裂后细胞也能有效的转染。这对在体晶状体的基因转染有很大的优越性。采用直径1-2m玻璃微管在显微镜下将病毒载体注入晶状体的前囊膜下，既不破坏晶状体的完整性，又可使病毒接触到囊膜下的上皮细胞。,举例2：拟解决的关键问题 辽宁绒山羊日粮中适宜的硫源和硫水平； 硫营养是否提高山羊绒的产量和品质（尤其是细度）； 硫营养是否影响毛囊的活性和形态； 硫营养是否影响毛囊中的某一激素； 硫营养是否影响到相关激素受体的基因。,4、研究方法 存在问题： 过于简单：在方案中只有方法名称而无具体步骤。 过于繁杂：大量罗列一些常规的实验方法。 撰写要求：以研究项目的需求为前提，尽量采用最适合的方法和手段，并将其操作步骤和关键环节体现在技术路线当中。,举例1：研究方法：利用真菌发酵培养技术和杀线虫剂的筛选体系获得高产率菌线克的发酵液，通过真空浓缩，活性炭柱，硅胶柱和离子交换树脂柱层析，改变推动剂参数获得最佳纯化方法，获得粗提物，利用制备液相色谱进行纯化，采用真空冷冻干燥机进行最后的干燥纯化。获得的纯品经过纯度检验符合要求后采用液质联用和核磁共振获得谱图，然后进行结构解析。通过获得的结构，收集和合成类似化合物，并对类似结构的化合物进行杀线虫活性测定，明确相关化合物的杀线虫特性。,研究方法举例2： 通过饲养试验，测定不同硫源和硫水平下辽宁绒山羊采食量、日增重、产绒量、绒品质（细度、长度和含硫量等），来研究硫营养对辽宁绒山羊产绒性能的影响效果，确定辽宁绒山羊日粮适宜的硫源和硫水平； 通过消化代谢试验和消化动态学试验，以氮硫代谢、食糜流通量、瘤胃发酵、营养物质降解率为指标，研究硫营养对辽宁绒山羊消化代谢的影响； 通过皮肤切片，利用Sacpic染色法来探讨硫营养对辽宁绒山羊毛囊活性和形态的影响； 采用放射免疫（RIA）法，通过测定不同日粮硫水平下辽宁绒山羊毛囊生长激素（GH）、褪黑素（MLT）、催乳素（PRL）和类胰岛素生长因子（IGF）等，来探讨硫营养对辽宁绒山羊毛囊激素水平的影响； 采用“RT-PCR”技术，研究硫营养对辽宁绒山羊毛囊IGF-I基因、PRL基因等表达模式和丰度的影响。,5、技术路线 存在问题： 不清楚，不详细，不可行。 撰写要求： 清晰、详细、注意逻辑性。 撰写方法： 以时间顺序为主线设计技术路线 以研究内容为主线设计技术路线 分大小标题，突出逻辑关系。 详细地写清楚每个具体步骤。,举例1 （1）人晶状体上皮细胞的获得：老年性白内障晶状体上皮细胞取自白内障患者手术中取出的前囊膜（晶状体上皮细胞紧贴于前囊膜），直径约5mm。正常晶状体上皮细胞取自角膜移植供体眼的晶状体，在显微镜下撕下前囊膜，直径约8mm。按文献提供的方法去除晶状体纤维细胞，仔细清洗以去除血细胞污染。 （2）建立差异cDNA文库：从50例白内障手术患者的前囊膜上取下的晶状体上皮细胞作为实验组，从25例正常晶状体前囊膜上取下的晶状体上皮细胞作为对照组，利用改良的消减杂交技术19，20，获得差异表达的cDNA，并建立文库。主要的实验流程如下：,正常晶状体上皮细胞 白内障晶状体上皮细胞 Promega PolyATtract System 1000 mRNA分离 mRNA分离oligo-dT18反转录 ntech Cap-finder方法反转录 cDNA Biotin-21-dUTP pending-cDNA 随机引物PCR 杂交,Sephacryl S-400柱,除盐及小片段 链亲和素-生物素磁性分离 除去杂交体及过量正常晶状体上皮细胞cDNA “长距离”PCR 目的cDNA的特异扩增 克隆、鉴定、转化 建立差异基因文库,（3）制备基因芯片筛选白内障相关基因： 基因芯片的制备： 白内障相关基因的筛选： （4）白内障相关基因的结构分析： 序列测定：. . 序列的计算机分析： . . 获得全长基因： . . （5）基因转染： 培养人晶状体上皮细胞的转染： 在体晶状体的转染：,举例2：技术路线(一) 菌线克的分离纯化和结构解析利用真菌发酵培养技术和杀线虫剂的筛选体系获得高产率菌线克的发酵液，通过真空浓缩，活性炭柱，硅胶柱和离子交换树脂柱层析，改变推动剂参数获得最佳纯化方法，获得粗提物，利用制备液相色谱进行纯化，采用真空冷冻干燥机进行最后的干燥纯化。获得的纯品经过纯度检验符合要求后采用液质联用和核磁共振获得谱图，然后进行结构解析。（二）类似化合物的合成和收集通过获得的结构，收集和合成类似化合物。（三）杀线虫活性结构的筛选对类似结构的化合物进行杀线虫活性测定，明确相关化合物的杀线虫特性。,6、可行性分析 对实验方案设计的分析 理论分析 研究手段方法分析 预实验结果分析 对相关条件的分析 所用特殊实验材料（试剂）的分析 对所具备的实验条件进行分析 对项目组成员搭配及其运用技术方法的能力分析,举例(1)关于建立差异cDNA文库： 老年性白内障晶状体上皮细胞与正常晶状体上皮 细胞是处在不同状态下的细胞，细胞基因表达的改变 是细胞蛋白功能等改变的基础。寻找这些有差异的基 因是探索细胞功能、状态变化原因的突破口。利用的 消减杂交技术是筛选差异表达基因的有效方法。改良 的消减杂交技术是我们研究组成员建立的方法，应用 此方法已经从脂多糖刺激前后的人牙髓细胞的差异表 达的基因中克隆到脂多糖刺激后特异表达的基因，其 中 5个为新基因，这一研究成果进一步证实了该方法 的可操作性，而且我们在运用此方法过程中也积累了 较丰富的经验，因此，本研究利用这一方法从两种状 态的晶状体上皮细胞中筛选差异表达的基因并建立 cDNA文库是可行的。,举例2：可行性分析：本项目在研究基础方面已经进行了必要的知识积累，本研究室具有20多年的线虫学研究基础，在大豆胞囊线虫、根结线虫和短体线虫方面已完成了多篇博士研究论文，通过国家自然科学基金的资助已经完成了杀线虫快速筛选体系的构建，靶标线虫的培养技术已经成熟，通过发酵液的筛选和纯化，获得了菌线克的粗提物，这些为本试验的完成创造了物质条件；沈阳化工研究院的张弘和宋玉泉与本研究室长期合作，因此，本项目的研究内容是切实可行的。例3：可行性分析申请者从事多年羊生产方面的教学与科研工作，课题组主要成员也具有较高的研究能力与专业水平，拥有从事科研的时间、精力，我们完全能胜任本课题的研究工作； 本课题具备研究工作基础，立项根据充分，设计合理，研究方法成熟可靠，研究方案切实可行； 本课题具有研究条件，分析测试中心的试验仪器和设备基本能解决指标测试问题；,7、创新性 存在问题： 对创新点提炼不够 把运用新技术、新方法理解为创新 与研究目标、研究内容相混淆 对创新的理解： 原始创新：填补空白或修改传统的理论 发明创造新技术、新方法 跟踪创新：补充、完善现有理论 修改、完善现有技术方法（112） 提炼方法：用逆向思维方法提炼创新点,例1：基因筛选方法上的创新： 首次采用改良的消减杂交技术建立白内障晶状体上皮细胞差异表达基因文库，并制备相应的基因芯片，利用此基因芯片筛选出老年性白内障相关基因。上述两种方法的有机结合使我们能快速、准确、定性、定量地获得多个白内障相关基因。通过分析这些基因的结构、研究它们的功能，揭示老年性白内障晶状体上皮细胞变化的分子生物学机制，为防治白内障提供新的思路。,例2；创新性 首次研究硫营养对辽宁绒山羊产绒性能的影响效果； 首次研究硫营养对绒山羊毛囊活性和形态、毛囊激素、 毛囊激素受体基因的影响； 本课题将筛选最优的硫源，并对硫的适宜绝对水平和 氮硫比同时进行研究，遵循绒山羊硫营养的调控机 理； 本课题将硫营养对辽宁绒山羊长绒期和非长绒期的生 产 性能分别进行研究，改变已有研究的片面性。 本课题从营养学、生理学、组织学、分子水平，深入研 究硫营养对产绒性能的影响及其机制，改变已有研究的 局限性。,例3 创新性 （1）杀线虫活性结构的解析；（2）在类似化合物中创制新型的具杀线虫剂活性的组分或结构。,例4：创新之处（1）利用蛋白质组技术研究葡聚寡糖激发子诱导黄瓜抗性相关蛋白质群及表达的基因，国内外尚未开展这方面工作。（2）通过黄瓜膜整合蛋白和胞内蛋白与抗性关系的研究，可最终确定位于膜表面或胞内的控制抗性的相关基因种类，为今后研究抗性信号转导、抗性基因克隆奠定基础。同时也为抗性品种分子辅助育种提供抗性相关基因资源和蛋白质标记。（3）从蛋白质群层面上，全面揭示葡聚寡糖激发子-黄瓜-病原菌互作的分子机制。,8、年度研究计划及预期研究结果 年度研究计划： 按年度列出研究内容及其阶段目标 拟组织的重要学术交流活动、国际合作与交流计划 预期研究结果： 理论成果：建立/丰富/补充/填补 . 技术方法：建立/完善 . 专 利：可望获得 论 文：国际、国内 人才培养：青年科技骨干、博硕研究生,四、研究基础 1、研究工作积累 存在问题： 内容