《半薄超薄切片技术》PPT课件.ppt

半薄 超薄切片技术 背景 半薄切片 超薄切片 一 超薄切片技术介绍 固定地好渗透包埋地好切地好载网膜做地好染地好 超薄切片的基本要求 超薄切片主要步骤 取材 固定 漂洗 脱水 渗透 包埋 超薄切片 超薄切片染色 每一步都是关键 任何环节的疏忽都会导致制片的失败 1取材 1 1取材的基本要求 1 动作迅速 取材后快速放入固定液中 2 体积要小 一般1 3 如果来不及 例如野外取材 也可将组织修成 1 1 2 mm大小长条形 之后再进行分割 3 减小损伤 切割器械锋利 操作轻 避免牵拉 挫伤与挤压组织 4 低温操作 最好在低温 0 4 下进行 降低酶的活性 所用器具和固定液都应预冷 5 取材部位要准确 1 2取材方法材料放在洁净的韧性较大的纸上滴上预冷的固定液用刀片将组织切下并修小用牙签或镊子将组织块移至盛有预冷的固定液的小瓶中 植物材料的取材可以先切成薄片 经适当固定后再切成小方块继续固定 2固定 抽气 2 1固定的目的 采用物理 化学等方法迅速杀死细胞的过程称之为固定 目的是尽可能使细胞中的各种细胞器以及大分子结构保持生活状态 牢固地固定在它们原来所在的位置上 不发生位移 良好的固定是获得精细结构的形态学图象的关键 2 2常用固定剂 1 四氧化锇 OsO4 OSMIUMTETRAOXIDE 强氧化剂 与氮原子有较强的亲和力 可较好的固定脂肪 蛋白质 磷酸脂蛋白 固定变性DNA及核蛋白 不能固定天然DNA RNA及糖原 具有固定和电子染色双重作用 样品图象反差较好 酶的钝化剂 不适合细胞化学的固定 与乙醇 醛类反应生产沉淀 漂洗 分子较大 渗透速度缓慢 但反应迅速 均匀固定深度0 25 固定时间一般为1 2小时 时间太长易使组织变脆 切片困难 锇酸固定液常用浓度 1 2 极易挥发 对粘膜 角膜毒性极大 操作要十分小心 2 戊二醛 C5H8O2 glutaraldehyde 有效保存组织细微结构 对蛋白质的固定效果好 渗透力强 渗透速度快 较好的固定糖原 核蛋白 微管 内质网和细胞基质 有丝分裂的纺锤丝及胞饮小泡等 保存某些酶的活力 较好保存抗原 适于细胞化学研究 对组织和细胞的穿透力比四氧化锇强 均匀固定深度 0 5 1mm 0 4 可长时间固定 几周甚至1 2个月 不会使组织变脆 可用于远离实验室的取材 缺点 不能保存脂肪 磷脂固定效果差 对细胞膜的显示较差 没有电子染色作用 3 甲醛 Formaldehyde 渗透组织的能力比戊二醛强 对于致密组织 种子 固定作用好 细胞精细结构保存质量不如戊二醛 但酶活性的保存优于戊二醛 缺点 不能较好的固定细胞基质 脱水后大部分细胞基质将丢失 常用多聚甲醛 戊二醛的混合固定液 4 高锰酸钾 强氧化剂 较好固定脂蛋白 对神经髓鞘 叶绿体及其他各种膜结构的研究均可作为固定剂 只用于某些常用固定剂难以固定的植物和酵母样品 且一般不需要用锇酸后固定 3漂洗 脱水 3 1漂洗漂洗的目的 组织固定后脱水前的漂洗 清除残留固定剂 减小固定剂和脱水剂之间的反应 避免沉淀物干扰超微结构的观察 双重固定中 在锇酸固定前的漂洗 避免锇酸与戊二醛反应生成细小而致密的饿沉淀 破坏细胞结构 3 2脱水目的将组织内的游离水彻底清除 保证包埋介质完全渗入组织内部 方法用一种和水及包埋剂均能相混溶的液体来取代水 常用的脱水剂是乙醇和丙酮 注意事项脱水梯度逐级进行 急剧脱水会引起细胞收缩 30 50 70 80 95 100 100 更换溶液动作要快 长时间暴露空气中会在组织内外产生微小气泡 影响渗透 脱水过程中应在70 脱水剂中4 停留或过夜 过度脱水不仅引起更多物质的抽提 而且会使样品发脆 造成切片困难 置换用脱水剂 环氧丙烷 Epon812 二甲苯 石蜡 4渗透和包埋 聚合 4 1渗透渗透就是利用包埋剂渗入到组织内部取代脱水剂的过程 包埋剂在单体状态时 聚合前 为液体 能够渗入组织内 当加入某些催化剂 经加温或其他条件 能聚合成固体 以便进行超薄切片 4 2包埋 聚合 包埋操作 将组织块包埋在多孔橡胶包埋模板中或胶囊中 一定条件下可聚合硬化 形成包埋块 包埋板 1 包埋管胶囊 常用的包埋剂 环氧树脂 epoxyresin 水溶性树脂 丙烯酸类树脂LRWhite Lowicryls GMA PEG等 适于进行组织化学和细胞化学研究的样品制备 适于低温包埋 通常用于免疫电镜样品的制备 包埋操作中的注意事项 所有试剂要防潮 最好存放在干燥器中 所用器皿应烘干 配包埋剂时 每加入一种试剂要搅拌均匀 包埋时动作要轻巧 防止产生气泡 盛放过包埋剂的容器要及时用丙酮清洗干净 皮肤尽量不要接触包埋剂 以免引起皮炎 5超薄切片 5 1修块削去表面的包埋剂 露出组织 然后在组织的四周以和水平面成45度的角度削去包埋剂 修成金字塔形 顶面修成梯形或长方形 每边的长度为0 2mm 0 3mm 5 2超薄切片超薄切片机 LEICAULTRACUTR超薄切片厚度 100nm 一般50 70nm 5 3载网和支持膜 载网 超薄 直径 2 3mm 厚度 0 03 0 02mm 5 3载网和支持膜 2 载网支持膜膜的要求 透明无结构 并能承受电子束的轰击 支持膜的种类 火棉胶膜聚乙烯醇缩甲醛膜 formvar膜 碳膜 膜的厚度 10nm 20nm 6超薄切片的染色 目的 增强样品的反差 提高图象的清晰度 常用染色剂 重金属盐各种染料 常用的染色剂 醋酸铀和柠檬酸铅 染色方法 1 组织块染色在脱水至70 乙醇时 将组织块放在用70 乙醇配制的饱和醋酸铀溶液中 染色时间2小时以上 或在冰箱中过夜 超薄切片染色 2 超薄切片后染色 醋酸双氧铀 柠檬酸铅双染 铀染 细胞核及结缔组织染色铅染 提高细胞质成分的反差 1 前固定 固定液体积是固定材料的十倍以上 材料不堆积 3 戊二醛in0 1MPBS ph7 2 室温5 6h 后4 C保存2 漂洗 0 1MPBSPh7 2充分漂洗3 4次 20 30Min 次3 后固定1 锇酸固定in0 1MPBS 4 Covernight4 漂洗 0 1MPBSPh7 2充分漂洗3 4次 20 30Min 次5 系列脱水 30 50 70 4 C overnight 可以停下 80 95 100 100 用丙酮置换乙醇 乙醇 丙酮 1 1 纯丙酮2次 每级20 30分钟6 渗透丙酮 树脂 2 1 1 1 可以停下了 overnight 1 22 3h 级纯树脂12h 换纯树脂12h 从进入树脂开始更要严格防潮 7 包埋聚合60 C24hr注意 免疫电镜时不用锇酸固定 树脂换成LRWhite等水溶性树脂 固定液可以是1 25 戊二醛 1 25 多聚甲醛in0 1MPBSPh7 2 超薄切片图片 二 半薄切片技术介绍 半薄切片主要步骤 取材 固定 漂洗 脱水 渗透 包埋 半薄切片 半薄切片染色 每一步都是关键 任何环节的疏忽都会导致制片的失败 FAA固定液 福尔马林5 冰醋酸5 70 酒精90 半薄 石蜡切片 一般固定根 茎 叶 花药 子房组织切片 幼嫩材料用50 酒精代替70 酒精 防止材料收缩 加入5 甘油可防固定液蒸发和材料变硬 卡诺固定液 渗透迅速 固定根尖