《医学高级职称论》PPT课件.ppt

5 Aza CdR对人食管癌细胞株生物学行为及TFPI 2mRNA表达的影响 5 Aza CdR对人食管癌细胞株生物学行为及TFPI 2mRNA表达的影响作者 杜雅冰 邵应举 樊青霞 孙桢 王琳 赵培荣作者单位 郑州大学第一附属医院肿瘤内科 河南郑州450002 摘要 目的探讨5 氮杂 2 脱氧胞苷 5 Aza 2 deoxycytidine 5 Aza CdR 干预对食管鳞癌细胞株Eca9706生长增殖及其组织因子途径抑制物2 tissuefactorpathwayinhibitor 2 TFPI 2 基因表达的影响 方法选取食管鳞癌细胞株Eca9706 并用不同浓度的5 Aza CdR处理该细胞株 MTT法检测干预前后细胞增长率的变化 FCM法检测干预前后细胞凋亡率的变化 RT PCR技术检测干预前后Eca9706细胞TFPI 2基因mRNA的表达 免疫组化检测干预前后Eca9706细胞TFPI 2蛋白的表达 结果食管鳞癌细胞株Eca9706存在TFPI 2基因超甲基化状态 经5 Aza CdR处理后 超甲基化状态解除 细胞增殖受到抑制 细胞凋亡率明显提高 P 0 05 细胞中TFPI 2蛋白表达明显增强 同时mRNA的表达水平也较处理前明显提高 P 0 05 结论食管癌细胞系TFPI 2基因超甲基化可抑制其mRNA表达 当其超甲基化解除后 细胞增殖受到抑制 同时细胞凋亡率相应提高 关键词 食管癌 组织因子途径抑制物 2 5 氮杂 2 脱氧胞苷 甲基化 免疫组化 逆转录聚合酶链反应 凋亡ABSTRACT ObjectiveToexploretheeffectsof5 Aza 2 deoxycytidine 5 Aza CdR interventiononthegrowthandproliferationofEca9706celllineandproteinexpressionoftissuefactorpathwayinhibitor 2 TFPI 2 MethodsEca9706celllinewastreatedby5 azaCdRofdifferentconcentrations MTT flowcytometry immunohistochemistryandRT PCRwereusedtodeterminethecellgrowth apoptosis andtheexpressionofTFPI 2geneanditsprotein ResultsEca9706celllinehadhypermethylationofTFPI 2 Afterdemethylationby5 Aza CdRtreatment theproliferationofEca9706wasinhibited theapoptosisratewasalsoincreasedsignificantlyintheconcentration dependentmanner RT PCRdetectedthatmRNAexpressionofTFPI 2geneinEca9706celllinerecoveredsignificantly P 0 05 Conclusion5 Aza CdRcanslowthegrowthofEca9706cell increasetheapoptosisrate reactivatetheTFPI 2genetranscriptionandproteinexpressionbydemethylation KEYWORDS esophagealcarcinoma tissuefactorpathwayinhibitor 2 5 Aza CdR methylation immunohistochemistry RT PCR apoptosis 组织因子途径移植物2 tissuefactorpathwayinhibitor TFPI 2 是丝氨酸蛋白酶抑制物 在调控肿瘤细胞浸润转移方面起着重要作用 目前 关于TFPI 2在食管癌中的基因表达情况的分析研究尚少 本研究旨在探讨TFPI 2基因的失活机制 并寻找食管癌治疗的新靶点 1材料与方法1 1材料RPMI 1640培养基购自北京索莱宝生物科技有限公司 标准胎牛血清购自天津市灏洋生物制品科技有限公司 Trizol试剂购自MBI公司 RT PCR试剂盒购自MBI公司 5 Aza CdR购自Sigma公司 人食管癌细胞株Eca9706由郑州大学肿瘤生物学研究室惠赠 1 2细胞培养和药物处理人食管癌细胞Eca9706以含10mL L胎牛血清的RPMI 1640培养基 37 50mL LCO2培养箱培养 每2 3d消化传代1次 1 3MTT法检测干预前后细胞增长率的变化取对数生长期细胞 调整密度至5 104 mL接种于96孔板 按5 Aza CdR浓度分为6组 0 0 4 1 6 6 4 25 6 102 4 mol L 每组复设5个孔 待细胞贴壁后 分别于24 48 72h后加入MTT液 4h后弃去上清液 每孔加DMSO150 L 在490nm波长测定各孔吸光度值 absorbance A 细胞增殖抑制率 cellularproliferationinhibitionrate CPIR 按公式计算 CPIR 1 实验组A均值 对照组A均值 100 1 4流式细胞仪 FCM 检测干预前后细胞凋亡率的变化取对数生长期细胞 按5 105 mL的密度接种于6孔板内 待细胞贴壁后加药 分组如下 对照组 0 mol L 1 6 mol L5 Aza CdR组 25 6 mol L5 Aza CdR组 102 4 mol L5 Aza CdR组 每组均于5 Aza CdR作用48h后消化收集细胞 700mL L冰乙醇固定 流式细胞仪进行细胞凋亡测定 1 5RT PCR技术检测TFPI 2基因mRNA的表达分组同FCM 每组细胞均5 Aza CdR作用48h TFPI 2的上 下游引物分别为5 GTCGATTCTGCTGTTTTCC 3 和5 ATGGAATTTTCTTTGGTGCG 3 合成产物为440bp actin作为内参照 上下游引物分别为5 AGGCATTGTGATGGACTCCG 3 和5 AGTGATGACCTGGCCGTCAG 3 合成产物为301bp 按照试剂盒说明书 用Trizol试剂提取细胞总RNA 经紫外分光光度计分析后 按Sigma公司RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit说明书操作 先逆转录制备单链cDNA 再以逆转录产物为模板 用上 下游产物进行PCR反应扩增目的基因 反应条件为 94 预变性3min 然后94 变性30s 51 退火30s 72 延伸30s 循环30次 最后72 延伸5min 4 保温 扩增片段经20g L琼脂糖凝胶电泳鉴定 1 6免疫组化方法检测TFPI 2蛋白的表达取对数生长期细胞 按5 104 mL的密度接种于经预处理的盖玻片上 待细胞贴壁后加药 分组同RT PCR 培养48h后加入40g L多聚甲醛溶液固定30min 30mL LH2O2封闭内源性过氧化物酶 室温下10min 100mL L动物血清封闭 室温下10min 滴加1 100的稀释的TFPI 2抗体4 过夜 二抗室温下1h 滴加辣根酶标记链霉卵白素 37 孵育30min DAB显色 苏木精复染 脱水透明封片 另取爬片滴加PBS液代替一抗作为阴性对照 结果判定 TFPI 2蛋白阳性信号均呈棕黄色颗粒样物质 位于细胞质内 光镜下随机选取10个视野 每个视野观察细胞数不少于100个 按阳性细胞所占百分比进行结果判定 阳性率 阳性细胞数 1000 100 1 7统计学处理应用SPSS16 0软件进行统计学处理 实验数据采用均数 标准差 x s 表示 采用单因素方差分析加LSD两两比较法进行分析 检验水准 0 05 2结果2 1干预前后细胞增长率的变化经MTT检测 结果显示 实验组细胞抑制率明显高于未加药组 且随着作用时间的延长和浓度的增加而增加 表1 表1不同浓度的5 aza CdR对Eca9706细胞增殖的影响 2 2干预前后细胞凋亡率的变化流式细胞仪分析可见 经不同浓度5 Aza CdR诱导48h后 Eca9706细胞各处理组凋亡率分别为 13 76 0 47 26 97 0 39 41 03 0 19 与5 Aza CdR诱导浓度成正比 与对照组 1 39 0 27 比较差异有统计学意义 P 0 05 且各浓度组间比较差异亦有统计学意义 P 0 05 图1 以上实验重复5次 2 3干预前后Eca9706细胞mRNA的表达情况扩增产物经琼脂糖凝胶电泳显示 Eca9706细胞中TFPI 2mRNA表达在各用药组和未用药组之间有明显差异 TFPI 2mRNA在未用药组细胞中未见表达 经1 6 25 6 102 4 mol L5 Aza CdR处理后可见TFPI 2mRNA表达 表明在一定范围内随5 Aza CdR药物浓度的增加TFPI 2mRNA表达逐渐增强 图2 图1各组流式细胞凋亡散点图A 对照组 B 1 6 mol L5 Aza CdR组 C 25 6 mol L5 Aza CdR组 D 102 4 mol L5 Aza CdR组 图25 Aza CdR处理前后Eca9706细胞TFPI 2mRNA的表达M DNAmarker actin 301bp TFPI 2 440bp 1 对照组 2 102 4 mol L组 3 25 6 mol L组 4 1 6 mol L组 5 H2O对照组 2 4干预前后TFPI 2蛋白的表达情况免疫组化结果显示 经5 Aza CdR作用Eca9706细胞48h TFPI 2蛋白的阳性表达率增加 对照组 1 6 mol L组 25 6 mol L组 102 4 mol L组TFPI 2蛋白的阳性表达率分别为 2 10 1 42 9 31 2 70 14 72 3 50 68 20 3 20 不同浓度组之间以及用药组与对照组之间的差异均有统计学意义 P 0 05 图3 图3各组TFPI 2蛋白的表达情况3讨论人TFPI 2 hTFPI 2 基因定位于7q22区域 全长由8164个碱基组成 其cDNA全长为1222kb 其mRNA的启动子具有典型的管家基因特征 没有典型的TATA盒或CAAT盒 在推定的转录起始位点区域GC含量超过80 1 TFPI 2可在体内多种组织广泛表达 在这些组织内一旦出现肿瘤 TFPI 2的表达水平也会随之显著下降 2 有研究证实 在绒毛膜癌 乳腺癌 前列腺癌 神经胶质细胞瘤 纤维肉瘤和胸部恶性肿瘤组织中 与肿瘤产生相关的TFPI 2表达水平减少可能与其启动子的甲基化密切相关 1 3 5 启动子区cpG岛高甲基化在肿瘤形成机制中的确切作用尚不清楚 然而众多证据表明 肿瘤抑癌基因CpG岛异常的甲基化导致基因失活和转录抑制是肿瘤发生的重要机制之一 6 8 目前 有体外实验表明 DNA甲基转移酶抑制剂5 Aza CdR通过去甲基化作用可使多种含有CpG岛的高甲基化抑癌基因重新表达 从而恢复抑癌功能 9 本实验RT PCR结果显示 TFPI 2在Eca9706细胞中无表达 经过不同浓度的5 Aza CdR处理Eca9706细胞后 TFPI 2亦重新出现表达 且在一定范围内随药物诱导浓度的增大表达逐渐增强 MIZUNO等 10 研究表明 肿瘤细胞中DNMT的表达较正常的高4 12倍 也证实DNMT上调参与肿瘤发生 这与我们的实验结果一致 根据MTT实验可知 经过5 Aza CdR干预处理过的Eca9706细胞增殖明显受抑制 且随着药物浓度的增加 抑制作用越明显 从本实验结果分析 DNA启动子区去甲基化能较明显地抑制食管癌细胞增殖 并与其诱导剂量呈正相关 推测这种抑制作用与去甲基化后重新激活TFPI 2基因的转录和表达有着直接关系 此外可能与去甲基化后诱导细胞凋亡有关 进而通过流式细胞仪分析 结果显示 经不同浓度5 Aza CdR干预的Eca9706的细胞中 用药组与对照组相比细胞凋亡率凋亡率有所增加 并且与5 Aza CdR诱导剂量有依赖性关系 BENDER等 11 在同等条件下用5 Aza CdR处理恶性肿瘤细胞系和正常纤维细胞系时 发现肿瘤细胞增殖均被抑制 而纤维细胞增殖不被抑制 因此 5 Aza CdR对Eca9706细胞增殖的抑制及凋亡的增加不是药物的毒性影响 可能是因为使TFPI 2重新表达的结果 目前 国外以TFPI 2为药物研究靶点 就TFPI 2在肿瘤治疗 肿瘤临床诊断 促进伤口愈合和动脉粥样硬化治疗等领域中的应用 也正在进行广泛深入的研究 本研究用甲基转移酶抑制剂5 Aza CdR处理人食管癌Eca9706细胞株 检测TFPI 2基因表达的变化及其对细胞增殖和凋亡的影响 以期寻找治疗肿瘤的新靶点 参考文献 1 HUBEF REBERDIAUP IOCHMANNS etal CharacterizationandfunctionalanalysisofTFPI 2genepromoterinahumanchoriocarcinomacellline J ThrombRes 203 109 4 207 215 2 MIYAGIiY KOSHIKAWAN YASUMITSUH etal cDNAcloningandmRNAexpressionofaserineprotein5andtissuefactorpathwayinhibitor 2 J JBiochem 1994 116 5 939 942 3 RAOCN SEGAWAT NAVARIJR etal MethylationofTFPI 2geneisnotthesolecauseofitssilencing J IntJOncol 2003 22 4 843 848 4 KONDURISD SRIVENUGOPALKS YANAMANDRAN etal Promotermethylandsilencingofthetissuefactorpathwayinhibitor 2 TFPI 2 ageneencodinganinhibitorofmatrixmetalloproteinasesinhumangliomacells J Oncogene 2003 22 29 4509 416 5 STEINERFA HONGJA FISCHETTEMR etal Sequential5 Aza 2 deoxycytidi ne depsipeptideFK228treatmentinducestissuefactorpathwayinhibitor2 TFPI 2 expressionincancercells J Oncogene 2005 24 14 2386 2397 6 HERMANJG BAYLINSB Promoter regionhypermethylationandgenesilencinginhumancancer J CurrTop