细胞蛋白质纯化

蛋白质纯化,概述,蛋白质的分离纯化是研究蛋白质结构、化学组成和生物功能的基础。蛋白质在自然界中存在于复杂的混合体系中，而且许多重要的蛋白质在细胞中的含量极低。 要把蛋白质从复杂的体系中分离出来，同时又要防止其组成、结构的改变和生物活性的丧失，显然是有相当难度的。,蛋白质的性质,配体结合能力金属离子结合能力可逆性缔合翻译后修饰特异性序列或结构非寻常性质基因工程构建的纯化标记,大小形状电荷等电点电荷分布疏水性溶解度密度,分离方法,硫酸铵沉淀法,硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。,有机溶剂沉淀法,原理 极性强的有机溶剂能破坏蛋白质的水化层而使蛋白质沉淀。在等电点时沉淀效果更好。常用的有机溶剂：丙酮、乙醇 注意事项： 常温下有机溶剂可使蛋白质变性，低温条件下可减慢变性速度。因此用有机溶剂沉淀蛋白质时应在低温条件下进行。如利用丙酮沉淀蛋白质时，必须在04低温下进行，在温度为10时蛋白质在有机溶剂中容易变性。,凝胶过滤法,凝胶过滤层析(gel filtration chromatography)法又称排阻层析或分子筛方法，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分离。一种利用带孔凝胶珠作基质，按照分子大小分离蛋白质或其它分子混合物的层析技术。 一般是大分子先流出来，小分子后流出来。,凝胶过滤法,凝胶过滤示意图,凝胶过滤填料,离子交换法,离子交换层析（Ion Exchange Chromatography简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。,阴离子交换示意图,常用离子交换树脂,疏水作用层析,固定相由非极性物质(如烃类、苯基等)组成的层析。非极性分子间或分子的非极性基团间具有吸引力，不同分子的非极性基团与固定相非极性物质结合的强弱不同，从而达到分离。多用于蛋白质分析和分离。离子强度（盐浓度）越高，物质所形成的疏水键越强。影响疏水作用的因素包括：盐浓度，温度，pH，表面活化剂和有机溶剂。疏水层析的应用与离子交换层析的应用刚好互补，因此，可以用于分离离子交换层析很难或不能分离的物质。,疏水作用示意图,亲和层析,在生物分子中有些分子的特定结构部位能够同其他分子相互识别并结合，如酶与底物的识别结合、受体与配体的识别结合、抗体与抗原的识别结合，这种结合既是特异的，又是可逆的， 改变条件可以使这种结合解除。生物分子间的这种结合能力称为亲和力。基因工程表达的蛋白即重组蛋白，一般带有亲和标签，使表达的目的蛋白纯化更方便、容易。,亲和层析示意图,蛋白质性质与分离方法,1、分子大小,透析和超滤透析在纯化中极为常用，可除去盐类（脱盐及置换缓冲液）、有机溶剂、低分子量的抑制剂等。透析膜的截留分子量为5000左右，如分子量小于10000的酶液就有泄露的危险，在纯化中极为常用，可除去盐类、有机溶剂、低分子量的抑制剂等。超滤一般用于浓缩和脱色。,1、分子大小,离心分离置换缓冲液许多酶富集于某一细胞器内，匀浆后离心得得到某一亚细胞成分，使酶富集1020倍，再对特定的酶进行纯化。差速离心，分辨率较低，仅适用于粗提或浓缩。速率区带法，如离心时间太长所有的物质都会沉淀下来，故需选择最佳分离时间，可得到相当纯的亚细胞成分用于进一步纯化，避免了差速离心中大小组分一起沉淀的问题，但容量较小，只能用于少量制备。等密度梯度离心常用的离主介质有蔗糖、聚蔗糖、氯化铯、溴化钾、碘化钠等等。,1、分子大小,凝胶过滤这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一，注意使要离的蛋白质分子量落在凝胶的工作范围内。选择不同的分子量凝胶可用于脱盐、置换缓冲液及利用分子量的差异除去热源。,2、形状,蛋白质在离心通过溶液运动时，或通过膜、凝胶过滤填料颗粒或电泳凝胶中的小孔运动时，都会受到形状的影响：对两种相同质量的蛋白质而言，球状蛋白质具有较小的有效半径（斯托克半径），通过溶液沉降时遇到的摩擦力小，沉降较快而显得比其它形状的蛋白质大；反之，在体积排阻色谱时，斯托克半径较小的球状蛋白质更容易扩散进入凝胶过滤填料颗粒内部，较迟洗脱出来，因而显得比其它形状的蛋白质要小。,3、溶解度,利用蛋白质的溶解度的差别来分别各种蛋白质常用的方法。影响蛋白质溶解度的外界因素很多，其中主要有：溶液的pH、离子强度、介电常数和温度，但在同一的特定外界条件下，不同的蛋白质具有不同的溶解度。适当改变外界条件，控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度。,3、溶解度,pH控制和等电点沉淀 蛋白质在其等电点一般较不易溶解。蛋白质的盐溶和盐析有机溶剂分级法温度 不同的蛋白质在不同的温度具有不同的溶解度和活性。大多数蛋白质在低温下比较稳定，故分离操作一般低温下进行。,4、等电点,电泳 不仅是分离蛋白质混合物和鉴定蛋白质纯度的重要手段，而且也是研究蛋白质性质很有用的方法。 等电聚焦分辨率很高，pI有0.02pH的差异就能分开。 2D-PAGE分离蛋白质分辨率已经发展到100000个蛋白点。,4、等电点,离子交换层析 改变蛋白质混合物溶液中的盐离子强度、pH和（阴、阳）离子交换填料，不同蛋白质对不同的离子交换填料的吸附容量不同，蛋白质因吸附容量不同或不被吸附而分离。 洗脱可采用保持洗脱剂成分一直不变，也可采用改变洗脱剂的盐度或pH的方法洗脱，后一种可分分段洗脱和梯度洗脱。梯度洗脱一般效果好，分辨率高，特别是使用交换容量小，对盐浓度敏感的离子交换剂，多用梯度洗脱。控制洗脱剂的体积（与柱床体体积相比）、盐浓度和pH，样品组分能从离子交换柱上分别洗脱下来。 蛋白分子暴露在外表面的侧链基团的种类和数量不同，故在一定的PH值和离子强度的缓冲液的所带的电荷不同,5、电荷分布,电荷的氨基酸残基可均匀地分布于蛋白质的表面，既可以适当的强度与阳离子交换柱结合也能以适当强度与阴离子结合，因多数蛋白质都有不能在单一的溶剂条件下同时与两种类型的离子交换柱结合，故可得用此性质纯化；电荷的氨基酸残基亦可成簇分布，使某一区域带强正电荷而另一区域带强负电荷，呈强酸性或强碱性，只能在极端pH与阳离子交换树脂或阴离子交换树脂结合，如钙调蛋白只能在pH2时与阳离子交换树脂结合。,6、疏水性,多数疏水性的氨基酸残基藏在蛋白质的内部，但也有一些在表面。蛋白质表面的疏水性氨基酸残基的数目和空间分布决定了该蛋白质是否具有与疏水柱填料结合从而利用它来进行分离的能力。 因其廉价和纯化后的蛋白质具有生物活性，是一种通用性的分离和纯化蛋白质的工具。高浓度盐水溶液中蛋白质在柱上保留，在低盐或水溶液中蛋白质从柱上被洗脱，故特别适用于浓硫酸铵溶液沉淀分离后的母液以及该沉淀用盐溶解后的含有目标产品的溶液直接进样到柱上，当然也适用7mol/盐酸胍或8mol/L脲的大肠杆菌的治疗蛋白质提取液直接进样到柱上，在分离的同时也进行了复性。,7、密度,多数蛋白质的密度在1.31.4g/cm3之间，分级分离蛋白质时一般不常用此性质，不过对含有大量磷酸盐或脂质的蛋白质与一般蛋白质在密度上明显不同，可用密度梯度法离心与大部分蛋白质分离。,8、基因工程构建的纯化标记,通过改变 cDNA在被表达的蛋白的氨基端或羧基端加入少许几个额外氨基酸，这个加入的标记可用来作为一个有效的纯化依据。,8、基因工程构建的纯化标记,GST融合载体 使要表达的蛋白质和谷胱甘肽S转移酶一起表达，然后利用Glutathione Sepharose 4B作亲和纯化，再利用凝血酶、factor Xa切开或PreScission Protease。,8、基因工程构建的纯化标记,蛋白A融合载体 使要表达的蛋白和蛋白A的IgG结合部位融合在一起表达，以IgG Sepharose纯化。,8、基因工程构建的纯化标记,含组氨酸标记（Histidine-tagged）Chelating Sepharose 最通行的标记之一，是在蛋白质的氨基端加上610个组氨酸，在一般或变性条件（如8M尿素）下借助它能与Ni2+螯合柱紧紧结合的能力，用咪唑洗脱，或将pH降至5.9使组氨酸充分质子化，不再与结合Ni2+使之得以纯化。,9、亲和能力,结合效率高，分离速度快的特点。配基可是酶的底物、抑制剂、辅因子、特异性的抗体吸附后可改变缓冲液的离子强度和PH的方法，洗脱下来，也可用更高浓度的同一配体溶液或亲和力更强的配体溶液洗脱,9、亲和能力,金属螯合介质过渡金属离子Cu2、Zn2和Ni2等以亚胺络合物的形式键合到固定相上，由于这些金属离子与色氨酸、组氨酸和半胱氨酸之间形成了配价键，从而形成了亚胺金属蛋白螯合物，使含有这些氨基酸的蛋白被这种金属螯合亲和色谱的固定相吸附。螯合物的稳定性受单个组氨酸和半胱氨酸解离常数所控制，从而亦受流动相的pH和温度的影响，控制条件可以使不同蛋白质相互分离。,9、亲和能力,小配体亲和介质配体有精氨酸、苯甲酰胺、钙调因子、明胶、肝素和赖氨酸等等。抗体亲和介质即免疫亲和层析，配体有protein A和protein G，但protein A比protein G专一， protein G能结合更多不同源的IgG。外源凝集素亲和介质配体有刀豆球蛋白、扁豆外源凝集素和麦芽外源凝集素，固相外源凝集素能和数种糖类残基发生可逆反应，适合纯化多糖、糖蛋白。,10、非极性基团之间作用力,溶质分子中的非极性基团与非极性固定相间的相互作用力大小与溶质分子极性基团与流动力相中极性分子在相反方向上相互作用力的差异进行分离。因其流动相中的置换剂是极性小于水的有机溶剂（如甲醇、乙腈、四氢呋喃等），这些有机溶剂可能使许多蛋白质分子产生不可逆的变性；流动相中须有离子对试剂（如三氟乙酸、甲酸、磷酸等）存在才可使分离有效地进行和获得高的质量回收率；分离须在酸性介质中进行（一般pH在23之间），又有一些蛋白质会在后两种条件下产生不可逆的分子构象变化，故在生物大分子中人分离纯化中受到限制，但分子构象变化可逆的蛋白质而言是有效的方法。,11、可逆性缔合,在某些溶液条件下，有一些酶能聚合成二聚体、四聚体等，而在另一种条件下则形成单体，如相继在这两种不同的条件下按大小就可以进行分级分离。,12、稳定性,热稳定性大多数蛋白质加热到95时会解折叠或沉淀，利用这一性质，可容易地将一种经这样加热后仍保持其可溶性活性的蛋白质从大部分其它细胞蛋白质中分离开。蛋白酶解稳定性用蛋白酶处理上清液，消化杂蛋白，留下抗蛋白酶解抗性蛋白质。,13、分配系数,即利用双水相萃取分离，常用的生物物质分离体系有：聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（DEXTRAN）、PEG/磷酸盐、PEG/硫酸铵等。由于具有含水比例高、选用的聚合物及盐对酶无毒性、分离设备与化学工业通用等优点，在工业上目益受重视。,钙调蛋白的纯化,钙调蛋白,钙调蛋白是一种小分子量蛋白，能大量溶解于稀的中性水溶液中，带净负电荷，等电点为4.05，有钙依赖性疏水等性质。,纯化策略,分子量小，溶解度大 硫酸铵沉淀带净负电荷 阴离子交换钙依赖性疏水 疏水作用,纯化流程,纯化流程,纯化流程,纯化流程,基因工程表达的蛋白质纯化,重组蛋白,通过重组DNA技术获得的蛋白，通常为了便于目的蛋白的表达、检测、示踪及纯化，与目的蛋白一起融合表达一种多肽或蛋白。,亲和标签,（a）一步的吸附纯化（b）对三级结构和生物活性影响小（c）可方便且专一的去除以产生天然蛋白质（d）在纯化过程中重组蛋白的分析简便准确（e）适用于大量的不同蛋白质,亲和标签,多聚精氨酸标签(Arg-tag),精氨酸标签最早在1984年首次描述(Sassenfeld和 Brewer 1984)，通常由5或6个精氨酸组成。它已被成功用作蛋白C末端标签，产生的重组蛋白质纯度高达95，得率达到44。精氨酸是碱性最强的氨基酸，带5个精氨酸标签的蛋白质可以结合到阳离子交换树脂SP-Sephadex上, 而大部分杂蛋白不结合。,多聚组氨酸-标签(His-tag),固定化金属螯合层析（IMAC; 由Porath et al. 1975提出）的基础是固定在基质上的过渡态金属离子(Co2+, Ni2+,Cu2+, Zn2+)与特定的氨基酸侧链之间的相互作用。组氨酸是与固定化金属离子作用最强的氨基酸，组氨酸的咪唑环作为电子供体容易与固定的金属离子形成配位键。,谷胱甘肽S转移酶-标签,1988年首次描述了融合有谷胱甘肽S转移酶（GST）的多肽的一步纯化(Smith 和 Johnson 1988)。来自日本血吸虫（schistosoma japonicum）、26-kDa的 GST(Taylor et al. 1994)被克隆在大肠杆菌表达载体中。融合蛋白可从未经处理的裂解液中用固定化的谷胱甘肽亲和层析加以纯化。,Strep-标签,Strep-标签是一氨基酸肽开发来用于在链球菌抗生物素蛋白(streptavidin)柱上亲和纯化相应的融合蛋白。链球菌抗生物素蛋白(streptavidin)在特定位点第44, 45, 和47位的突变体与天然形式相比,对八肽Strep-tag II的亲和力更强。这一链球菌抗生物素蛋白突变体称为Strep-Tactin.Strep标签的蛋白质在生理缓冲液条件下结合到生物素结合区域中,并可用生物素衍生物温和洗脱。,FLAG-标签,FLAG-标签系统利用一短的亲水性8氨基酸肽并融合到目标蛋白（Hopp et al. 1988）。 FLAG肽可与抗体M1结合。这一系统的缺点是单抗纯化基质不如其他基质稳定如Ni2+-NTA 或者 Strep-Tactin。分离得到的蛋白质纯度在90%左右(Schuster et al. 2000)。为了改善FLAG标签的检测，已开发出3x FLAG系统。这一三联体FLAG抗原表位是亲水的，由22个氨基酸组成（表2）且可以检测表达低到10fmol水平的融合蛋白。,MBP(麦芽糖结合蛋白),40kDa的麦芽糖结合蛋白(MBP)由大肠杆菌K12的malE基因编码(Duplay et al. 1988)。1988年首次报导了通过与MBP融合的载体来促进外源蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化(Di Guan et al. 1988)。融合蛋白可通过交联淀粉亲和层析一步纯化。结合的融合蛋白可用10mM麦芽糖在生理缓冲液中进行洗脱。,串联蛋氨酸,半胱氨酸二肽和游离的蛋氨酸可通过Au-S 结合与固定在磁性颗粒内部的金纳米晶粒结合。于是，研究人员假设，未修饰的金磁珠（GMP）可用于纯化带有半胱氨酸或蛋氨酸标签的蛋白。将蛋氨酸数量从3个增加到4个，或用二至六个甘氨酸隔开三-蛋氨酸标签，可获得相当的结合效果，而洗脱效率却能显著增加。表现力最佳的标签是七个氨基酸序列MGGMGGM。,亲和标签,GST-ING1b融合蛋白表达及纯化的研究,ING1b,1、pGEX-ING1b转化至Ecoli. BL21中2、GST-ING1b融合蛋白的表达3、SD