蛋白序列测定

第三节蛋白质的一级结构,蛋白质的相关概念肽的命名、书写及特点测序过程,一、相关概念,1.蛋白质的一级结构（Primary structure）:又称为共价结构或化学结构。它是指蛋白质中的氨基酸（残基）的种类、排列顺序及连接方式。,特点：具有部分双键的性质,不可以旋转肽键比一般的碳-氧键短；与肽键相连的氢原子和氮原子呈反式；,2.肽键(peptide bond) 一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基缩水形成的酰胺键（共价）键，称为肽键。,3.肽(peptide)一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基缩水形成的化合物，称为肽。在蛋白质分子中，氨基酸借肽键连接起来，形成肽链。,肽和肽键的形成,肽单位,肽键,4.残基(residue) 肽链分子中的每一个氨基酸，由于相互连接而失去一分子水，与原来的结构相比，分子稍有残缺，因此通常把肽链分子中的每一个氨基酸单位称为氨基酸残基(128/110).,二、 肽的命名及书写1.命名：习惯：按数量的多少、按来源系统：某氨基酰某氨基酰某氨基酸2.书写：从N(H)到C (OH) ，具方向性三字母符号或单字母符号表示，中间用“”或“-”表示。例如:Gly-Glu-Lys-Ala (甘氨基酰谷氨基酰赖氨基酰丙氨酸),当两个氨基酸通过肽键相互连接形成二肽，在N端仍然有游离的氨基和C端有游离的羧基，每一端连接更多的氨基酸。氨基酸能以肽键相互连接形成长的、不带支链的寡肽和多肽。,多肽仍然有游离的-氨基和-羧基。 少于10AA称为寡肽，多于10AA称为多肽或聚肽。 分子量大于10000d称为蛋白质，小于10000d称为多肽。,在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。但是，也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在。这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为活性肽。实例：谷胱甘肽(glutathione,GSH) 短杆菌肽;脑啡肽； 促甲状腺素释放因子（TRH） -天冬氨酸-苯丙氨酸甲酯（甜味剂） 激素类多肽；抗生素类多肽；蛇毒多肽等。,重要的肽,GSH的作用,解毒作用：与毒物或药物结合，消除其毒性作用；参与氧化还原反应：作为重要的还原剂，参与体内多种氧化还原反应；保护巯基酶的活性：使巯基酶的活性基团-SH维持还原状态； 维持红细胞膜结构的稳定：消除氧化剂对红细胞膜结构的破坏作用。,3.肽的理化特点：肽键的酰氨氢不解离，肽的酸碱性质主要决定于肽键中的游离末端-NH2、-COOH及侧链R基上的可解离基团；肽中末端-羧基的pKa值比游离氨基酸的大，末端 -氨基的pKa值比游离氨基酸的小(?)；游离的-氨基、 -羧基和R基可发生与氨基酸中相应的类似反应，如茚三酮反应等；蛋白质部分水解后所得的肽若不发生消旋，则具有旋光性，短肽的旋光度约等于组成氨基酸的旋光度之和，较长的肽的旋光度则不是简单加和。,二、蛋白质一级结构测定步骤,测序前提：样品必须是均一的(纯度大于97%)必须知道它的相对分子量，其误差允许在10%以内,1.测定蛋白质分子中多肽链的数目 2.拆分蛋白质分子的多肽链 3.断开链内二硫键 4.分析每条多肽链的氨基酸组成比及数目 5.鉴定多肽链的N、C瑞残基 6.裂解多肽成小的肽段 7.测各肽段的氨基酸序列 8.重建完整多肽链的一级结构 9.确定二硫键的位置,测序过程,(一)N末端测定,二硝基氟苯（DNFB）法：肽游离末端NH2与DNFB反应生成DNP-肽黄色DNP-氨基酸,丹磺酰氯（DNS）法：用DNS取代DNFB，生成DNS-氨基酸,苯异硫氰酸（PITC）法：生成PTH-氨基酸，从肽上断裂下来,氨肽酶法：外切酶，但效果不好,氨肽酶法氨肽酶是一类外切酶，它从肽链的N末端逐个向里切。 最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶 也会遇到N末端氨基封闭，用焦谷氨酸氨肽酶处理。,C-末端测定,肼解法：最重要的化学方法，肽与肼反应，除C-末端氨基酸游离外，其他氨基酸转变为氨基酸酰肼化物,还原法：C-末端氨基酸用硼氢化锂还原成相应的-氨基醇,羧肽酶法：最有效、最常用,羧肽酶A,羧肽酶B,羧肽酶Y,羧肽酶C,氨基酸酰肼可以与苯甲醛作用变成水不溶性二苯基衍生物而沉淀 Gln Asn Cys等不易测出，末端Arg变成鸟氨酸,羧肽酶法,本方法目前最有效。从羧基端开始向里逐一水解蛋白质 羧肽酶A：释放除Pro，Arg和Lys以个的所有C-末端残基羧肽酶B：只水解以碱性Arg和Lys为C-末端的肽键羧肽酶C：羧肽酶Y：可以作用于任何一个C-末端残基,二硫键的断裂,氧化法：过甲酸,还原法：巯基化合物还原（-巯基乙醇，二硫苏糖醇等）,此外还需要加8mol/L 尿素或6mol/L的盐酸胍，使蛋白质变性。 生成的巯基要用碘乙酸等烷化剂保护。,(三)氨基酸组成的测定：,酸水解：是主要方法，同时辅以碱水解；所得氨基酸不消旋，但Trp全部被破坏，Ser，Thr，Tyr部分破坏，Asn和Gln的酰氨基被水解，生成Asp和Glu,同时释放出NH3；碱水解：多数氨基酸都被破坏，但Trp可定量回收,(四)多肽链的部分裂解,酶裂解,胰蛋白酶：专一性强，断裂Lys或Arg的羧基参与形成的肽键,糜蛋白酶：断裂Phe，Trp，Tyr，Leu等疏水氨基酸的羧基参与形成的肽键,嗜热菌蛋白酶：专一性差，断裂Val，Leu，Phe，Tyr，Trp等氨基参与形成的肽键,胃蛋白酶：在酸性条件稳定，肽键两侧均为疏水氨基酸。在确定二硫键位置时常用，专一性与糜蛋白质酶类似,化学裂解,溴化氰（CNBr）：只断裂Met羧基形成的肽键,羟氨（NH2OH）：在pH9时，专一断裂Asn-Gly之间的肽键，其它条件下不专一,今有一个七肽，经分析它的氨基酸组成是Lys，Pro, Arg, Phe, Ala,Tyr和Ser，该肽未经糜蛋白酶处理时，与DNFB反应不产生-DNP-氨基酸，经糜蛋白酶作用后，此肽断裂成两肽段。其氨基酸组成分别是Ala, Ser, Tyr和Lys，Pro, Arg, Phe。这两个肽段分别与DNFB反应可分别生成DNP-Ser和DNP-Lys。此肽与胰蛋白酶反应，同样能生成两个肽段，它们的氨基酸组成分别是Arg, Pro和Phe, Tyr, Lys, Ser, Ala。试问此七肽的一级结构序列是怎样？,(五)肽段的氨基酸测序,Edman化学降解法：用Edman试剂PITC与游离氨基作用生成PTH- 氨基酸，并可用各种层析技术分离；现改用蛋白质测序仪。,酶解法：利用氨肽酶和羧肽酶，局限性大，有困难,质谱法：质谱仪,由核苷酸序列推定法：mRNA，cDNA，推出 cDNA的核苷酸序列，然后推测出蛋白质的氨基酸序列,(六)肽段在多肽链中次序的决定,(七)二硫键位置的确定： 对角线电流法： 一般采用胃蛋白酶水解原来的含二硫键的蛋白质。一是胃蛋白酶专一低，切点多，得到含有二硫键的肽段较小，易分离鉴定；二是在酸性条件下，有利于防止二硫键发生交换反应。,对角线电泳过程 ：把水解后的混合肽段点到滤纸的中央，在pH6.5条件下进行第一向电泳，肽段将按大小及电荷不同分离开，然后 把滤纸暴露在过甲酸蒸气中，使S-S氧化成一对含磺酸基丙氨酸的肽。滤纸旋转90度，在与第一向完全相同的条件下进行第二向电泳。这时大多数氨基酸的迁移率未变，将位于滤纸的一条对角线上，而含磺基丙氨酸的成对肽段将比原来含二硫键的肽小而负电荷增加，结果它们都偏离了对角线。,问题： 有一个A肽，经酸水解分析得知由Lys、Asp、Glu、Arg、Ala、Val 和Tyr组成 。当A肽与DNFB反应后，得DNP-Glu，当用羧肽酶处理后得游离Asp。如果我们在实验中将A肽用胰蛋白酶降解时，得到三个肽，其中一种(Arg、Gln、Tyr),在pH6.4时净电荷为+1，另一种(Ala、Lys) 第三种为（Val和Asn）在pH6.4时，带电荷为零。此外，A肽用糜蛋白酶