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色谱分析法概述摘要：色谱法发展至今已经成为一种很重要的分离分析方法并应用于很多领域。本实验主要介绍了当前的一些色谱法的研究现状及前景，色谱法的原理及色谱法在一些领域中的应用。关键字：色谱法 研究现状 原理 应用 前景1前言20 世纪末至今，是中国色谱学科全面快速发展的重要时期。伴随着生命科学、材料科学、能源科学、环境科学等学科的不断发展，特别是功能基因组学、蛋白质组学、代谢组学和糖组学等组学研究的兴起，色谱学科得到了更加密切的关注和更加广泛的运用，我国色谱工作者也在上述方面取得了显著的成绩，一些研究成果在国际上具有一定的影响力。色谱技术的出现及发展至今已将近110 年。在此期间，色谱理论全面快速发展，色谱技术积累了大量的应用方法，得到了极其广泛的运用。从自然科学的划分上看，色谱归属于分析化学中的一个分支，但其影响力和应用范围已经远远超出了分析化学本身的范畴。无论是自然科学的基础研究，还是国民经济的发展建设，色谱技术都在其中发挥着越来越重要的作用。目前，人们对复杂体系的高分辨、高选择、高精度、高灵敏和高通量的分离分析提出了更高的要求。在这种情况下，色谱作为一种强大的分离分析手段，始终为推动生物医学和人类健康、环境监测与保护、国家安全等领域的发展提供着解决问题的关键技术。随着生命科学、环境科学、药学等学科研究的新领域不断涌现和深入发展，色谱技术在生物制药、蛋白质组学、生物分子的分离分析方面都发挥着越来越重要的作用。在我国，色谱学科也经历了从无到有、从初步创立到广泛应用的发展历程。尤其是在20 世纪末至今，在我国色谱工作者的共同努力下，中国色谱学科在色谱基础理论、分离分析方法与技术、新型色谱柱和富集材料、新型色谱分析仪器设备以及相关开发与应用等方面取得了诸多有价值的研究成果，在国际上的整体影响力亦愈发明显。Web of Science 数据库和中国科技期刊数据库“中国期刊全文数据库”和“万方数据库”的检索数据( 2011 年9 月25 日检索) 表明， 1990 年至2010 年我国科技工作者在美国科学情报研究所科学引文索引收录期刊( 即SCI 期刊) 和中国科技期刊上发表色谱相关论文132 604 篇( 其中SCI 期刊论文27 381 篇，中国科技期刊数据库论文105 223 篇) ，数量逐年递增。其中涉及毛细管电泳( CE) 、气相色谱( GC) 和高效液相色谱( HPLC) 方法的论文数量的增长态势呈上升趋势。以论文中色谱方法所涉及的领域来考察，以SCI 扩展版( SCI-EXPANDED)、社会科学引文索引( SSCI) 、艺术与人文科学引、文索引( A HCI) 、科学技术会议录引文索引( CPCI-S) 和社科及人文会议录引文索引( CPCI-SSH) 为统计源，色谱方法应用于化学领域的论文数量占46%，生物化学与分子生物学领域的占21%，食品科学与技术领域的占5%，材料科学、工程学、微生物学领域的各占4%，环境科学、光谱学和药理学领域的各占3%，上述领域之外的论文比例为8%。1990 年至2010 年，中国科学家所发表的色谱领域论文总数以28 062 篇的数量居世界第三位( 第一名: 美国，71 008 篇; 第二名: 日本，35 035 篇) 。2010 年发表论文4 146 篇， 2011 年发表4 574 篇，排名跃居世界第一。这些数据反映了色谱方法和技术的研究与应用在中国的迅猛发展。2色谱分析法的基本原理色谱过程的本质是待分离物质分子在固定相和流动相之间分配平衡的过程，不同的物质在两相之间的分配会不同，这使其随流动相运动速度各不相同，随着流动相的运动，混合物中的不同组分在固定相上相互分离。根据物质的分离机制，又可以分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶色谱、亲和色谱等类别。 色谱理论研究是色谱方法发展的重要基础和来源。我国色谱工作者基于前人的理论，结合实际工作，将研究的重点放在色谱保留方程以及模型的建立、新型固定相的保留机理研究、物理化学常数和酶反应动力学常数计算等方面。这些研究结果对不同类型色谱固定相保留行为的研究以及对新型固定相和色谱柱的制备具有一定的指导意义。在色谱理论计算方面，反相高效液相色谱( RPHPLC)的保留因子通常被认为由保留过程中的分子间相互作用决定，可以视为线性自由能关系( LFERs) 的化学分子描述符。梁鑫淼等在比较了十八烷基键合硅胶( ODS) 、氰基键合硅胶( CN)和苯基键合硅胶( Ph) 三者的线性溶剂自由能关系( LSERs) 后，建立了一个用ODS 柱、CN 柱及Ph 柱上的RP-HPLC 保留因子作为变量来评价土壤吸附因子的新的线性自由能模型; 将该模型用于预测化合物的保留值时准确性较高。他们采用一系列不同类型的参照化合物进行检验后发现，多柱法比单柱法更能有效地评价土壤吸附系数; 实验中将标准土壤装填成液相色谱柱，所得到的化合物保留值与模型预测值一致，从而反映了该模型在色谱固定相研究和制备中的实用价值。张祥民等采用偏微分方程研究了制备色谱理论中单组分的理想分离模型，建立了以Langmiur等温吸附为基础的制备色谱梯度流出曲线理论模型; 将此非线性等温线用于计算一阶线性、多阶线性和多台阶梯度时的流出曲线形状，获得了与有限差分法( finite difference method) 非常一致的计算结果。与制备色谱领域普遍采用的有限差分法理论模型相比，所建立的新的理想模型方法简便、准确性高，在制备色谱预测与应用中具有重要意义。耿信笃等用计量置换理论( stoichiometric displacementtheory， SDT ) 与蛋白质分子定向( orientation of protein molecule，OPM) 相结合，提出了在混合模式色谱( mixed-mode chromatography，MMC) 中蛋白质等生物大分子的OPM-SDT 保留机理。只用SDT 一种理论就合理地解释了生物大分子在MMC 中“U-型洗脱曲线”的形成机理，又用SDT 中的第一组线性参数斜率Z 和截距logI 作图，呈线性则表明溶质与固定相的相互作用力为非选择性作用力反相高效液相色谱( RPLC) 和疏水作用色谱( HIC) 便属于此，否则便为选择性作用力，从而定量描述了“U-型洗脱曲线”的一半为选择性作用力的离子交换色谱( IEC) 机理，另一半为非选择性作用力的HIC 机理。依此还对-糜原蛋白酶在脲浓度变化条件下究竟是天然态变性体，还是蛋白折叠的中间态进行了辨别。此法可用于蛋白质组学研究中对变形态的功能蛋白质和非功能蛋白质的识别。 吸附色谱利用固定相吸附中心对物质分子吸附能力的差异实现对混合物的分离，吸附色谱的色谱过程是流动相分子与物质分子竞争固定相吸附中心的过程。分配色谱利用固定相与流动相之间对待分离组分溶解度的差异来实现分离。分配色谱的固定相一般为液相的溶剂，依靠图布、键合、吸附等手段分布于色谱柱或者担体表面。分配色谱过程本质上是组分分子在固定相和流动相之间不断达到溶解平衡的过程。离子交换色谱利用被分离组分与固定相之间发生离子交换的能力差异来实现分离。离子交换色谱的固定相一般为离子交换树脂，树脂分子结构中存在许多可以电离的活性中心，待分离组分中的离子会与这些活性中心发生离子交换，形成离子交换平衡，从而在流动相与固定相之间形成分配。固定相的固有离子与待分离组分中的离子之间相互争夺固定相中的离子交换中心，并随着流动相的运动而运动，最终实现分离。凝胶色谱的原理比较特殊，类似于分子筛。待分离组分在进入凝胶色谱后，会依据分子量的不同，进入或者不进入固定相凝胶的孔隙中，不能进入凝胶孔隙的分子会很快随流动相洗脱，而能够进入凝胶孔隙的分子则需要更长时间的冲洗才能够流出固定相，从而实现了根据分子量差异对各组分的分离。调整固定相使用的凝胶的交联度可以调整凝胶孔隙的大小；改变流动相的溶剂组成会改变固定相凝胶的溶涨状态，进而改变孔隙的大小，获得不同的分离效果。3色谱分离法在不同领域的应用3.1色谱分离法在药物分析中的应用现代药物分析方法的连续化、自动化、最优化、智能化、能以客观数据来判断结果等特征已成为药物分析科学发展的必然趋势，它推动了一种分离手段和一种检测手段相结合组成的多种联用技术的诞生。质谱法的主要特点是能给出化合物的分子量、元素组成、经验式及分子结构信息，具有高灵敏度、高定性专属性及检测快速的优点。因此，与具有高分离能力的色谱联用技术，迅速成为药物研究中不可缺少的方法。常用于药物分析的方法有气相-质谱法、液相色谱-质谱法。核磁共振是具有重现性较高、非选择性、用量少等优点的一门能够提供有关化合物最多结构信息的分析技术。高效液相色谱)核磁共振波谱#TURI ) CAD( 联用既能高效、快速地获得混合物中未知物的结构信息，又能为植物粗提取物化学成分的快速分离鉴定提供非常重要的在线信息。近年来，由于CAD 技术在灵敏度、分辨率、动态范围等方面的提高，以及不用或少用氘代试剂而降低实验成本，使得TURI-CAD 联用技术用于体内药物分析成为可能。该法必将成为药物代谢产物研究更为有效的新手段。气相色谱-傅里叶变换红外光PI- FG+D( 联用技术结合了气相色谱独特的分离能力与红外光谱的分子结构鉴定能力，检测灵敏度显著提高，可用于分离、鉴定各类复杂混合物。例如分析混合碳九时，PI ) AB 法不能分辨其中的同分异构体# 如二甲苯、三甲苯等，因为其同分异构体的质谱图非常相似；而PI - FG+D 法能够检测各物质，尤其是苯系物的同分异构物质( 官能团的特征性红外吸收峰，定性结果非常准确 ) FG+D 法可鉴别光学异构体及其他异构体，用于鉴别未知或谱库中不存在的组分及其所属的化合物类别。其不足之处在于难以区分相似的同系物的红外光谱，当红外光谱图信噪比不够高时，得不到满意的图谱检索结果，故检测灵敏度难与PI -AB 法相比。3.2色谱分离法在食品中的应用高效液相色谱法（HPLC）按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。HPLC是目前常用于兽药残留检测的方法，可进行定性和定量分析，并可配套使用不同的萃取、提纯及柱前、后衍生和灵敏的检测系统，主要有紫外检测器、荧光检测器、示差检测器、质谱检测器以及安培计。李月欢等建立超高效液相色谱电喷雾串联四极杆质谱快速测定畜、禽肉中土霉素、四环素、金霉素的方法。土霉素、四环素、金霉素的最低检出限分别为0.1、0.1、0.5 g/kg，在5.080.0 ng/L的线性范围内，相关系数r均大于0.99，回收率82.6%111%。智若岚等8建立了测定猪肉组织中土霉素及金霉素残留量HPLC法，土霉素、金霉素标准品分别在0.11.0 g/mL、0.22.0 g/mL范围内线性关系良好；土霉素在3个不同浓度添加水平的回收率为78.06%87.21%，变异系数为3.02%7.72%；金霉素的回收率为76.45%85.62%，变异系数为3.46%6.32%。土霉素及金霉素的最低检出线分别为20 g/kg和10 g/kg。 食品中的糖组份传统上是用具有其相应误差的近似分析系统测定的。对各种糖的鉴定曾使用几种费时的和困难的技术。这些技术可能是酶促法或分光光度法, 也可能包含气液色谱法或纸上色谱法的应用。高性能液相色谱法(H PLC) 在最近几年的出现及其对分析化学许多方面的适用性, 现在已是食品中许多营养上重要糖类的快速鉴定法。用简单的样品制备即可在短时间内完成五种糖(果糖、葡萄、蔗糖、麦芽糖、乳糖)的H PLC分析方法的精度和准确度。很好采用H PLC的自动注射器, 还可在24小时内连续分析。当同时使用数据处理单元时, 样品分析和处理都是非常方便的。3.3色谱分离方法在工业中的应用 在已往的合成工艺中, 氧化反应终点的确定是采用氢氧化钾滴定测定总酸价的方法.由于氧化液中含有多种有机酸和未反应的原料, 各种有机酸的含量依赖于反应温度、物料滴加速度、保温时间和原料组成等因素的变化而不同, 滴定法不能测定出氧化液中每一种物质的含量, 无法确定反应的转化率和己酸的收率, 因此, 滴定法不适用于合成己酸工艺的控制分析和最佳工艺条件的探索. 建立一种更为有效的分析方法是必要的。在合成己酸的工艺中, 实际应用结果表明, 使用同一台仪器, 采用本方法即可以测定原料, 也可以测定氧化液、乙酸馏分和产品己酸, 样品的分析时间都在3 min 以内. 采用本方法测定氧化液, 己酸的相对标准偏差小于1% , 方法简便、可靠。采用本方法, 完全可以代替滴定法更好地确定合成己酸反应的终点. 利用本方法测定结果能够准确地计算出合成反应的转化率和己酸的收率, 实现了合成反应在最佳工艺条件下进行。本方法中, 有一个未知组分, 该组分的相对质量校正因子按1. 00 计算, 对分析结果影响不大。 4色谱分离方法的研究前景中国色谱研究已取得了世人瞩目的成就，实现了跨越式的发展，研究水平和国际地位得到巨大提升，特别是在国际学术期刊( 以SCI 期刊为代表) 发表论文数量上，继2010 年首次超过美国、日本、德国等国家之后，2011 年稳居第一位。从已发表的研究论文的特点分析，中国在色谱新原理、新理论、色谱关键技术与仪器等原始创新性的工作所占比例尚不高，高水平期刊发表文章数量和论文的平均引用率等与传统色谱强国仍有明显差距。然而令人欣喜的是，中国色谱领域的高水平研究成果越来越多，论文质量与数量同时快速增长，在原创性的研究方面已展示出相当大的潜力，特别是在色谱分离新技术和新方法、蛋白质组多维分离技术、代谢组学分析等已出现许多国际领先成果，显示了明显的优势和创新潜力。随着国家在基础研究、应用研究，尤其是科学仪器重大专项的巨大投入，相信更多的原始创新性的新理论、新原理、新方法、新技术和新仪器将出现在中国。参考文献：1 Goss K U，Schwarzenbach R P Environ Sci Technol，2001，35:12 Guo R B，Liang X M，Chen J P，et al Anal Chem，2002，74:6553 Hao W Q，Zhang X M，Hu F L Anal Chem，2007，79: 25074 Liu P，Yang H Y，Geng X D J Chromatogr A，2009，1216:74975 Ke C Y，Li J J，Liu Z L，et al Int J Mol Sci，2009，10: 6166 Qiu H，Takafuji M，Liu X，et al J Ch