L苯丙氨酸生产菌株的构建代谢调控和发酵条件优化2

L-苯丙氨酸生产菌株的构建、代谢调控和发酵条件优化,王凯,1,实验背景及意义,2,实验内容,3,主要框架结构,4,实验创新点与难点,实验可行性分析,一、研究背景及意义,基于L-Phe广泛的应用前景，近年来L-Phe成为氨基酸行业单品中产量增长最快的一种。发酵法生产L-Phe，国外报道最高产量为50 g/L，L-Phe在我国还未实现大规模生产，只有十多家公司利用微生物发酵法生产L-Phe。随着L-Phe市场需求的增长，国内供需缺口必须及时得到缓解。,1.1 应用现状及存在的问题,国内外研究人员在微生物发酵法生产L-Phe的研究中进行了大量的工作并取得了一些重要研究成果，一些改良的菌株及技术已成功应用于L-Phe的工业化生产中。然而，相比于其它种类的氨基酸，L-Phe的生产得率仍然较低，已有很多研究者尝试了不同的方法，但目前仍停留在理论研究或实验室规模的发酵阶段。,1.重点在于筛选高产菌株，及如何防止菌株的退化而导致产能下降问题。 2.由于产物抑制和副产物的过量合成等原因，以糖类为主要碳源的发酵法生产苯丙氨酸时的产物对底物的转化效率仍然比较低。 3.用于工业生产的大肠杆菌经常会感染噬菌体病毒。,1.2 课题的提出,针对以上出现的问题有必要通过代谢工程手段构建一个抗噬菌体污染并能高效生产 L-Phe的重组大肠杆菌，并用发酵工程的方法提高菌体生产 L-Phe 的能力，以此获得高产稳定的工程菌来满足生产需求。,BACK,二、实验内容,实验内容,发酵生产L-Phe的重组质粒的构建,抗噬菌体大肠杆菌的筛选,1. L-苯丙氨酸的合成途径和关键酶调控,在研究中，我们从E. coli 抗-2-噻吩丙氨酸的突变株中获得一个新的pheAfbr基因，该基因将有可能为CM-PDT对L-Phe的反馈抑制敏感性机制的研究提供有用的信息，并有助于改进菌株生产L-Phe的能力。分析其突变位点和方式，并在低拷贝、温度诱导表达的质粒中克隆、表达该基因和aroF基因以促进L-Phe的过量合成。,2. 抗噬菌体大肠杆菌的筛选,导致上述构建的重组菌发酵生产L-Phe异常的主要原因是噬菌体污染。为克服噬菌体污染，我们进行了抗噬菌体并能高产L-Phe的E. coli菌株的选育工作并对突变菌株在外源添加噬菌体条件下的摇瓶和发酵罐水平的发酵能力进行了考察。,3.诱导温度对重组菌发酵生产苯丙氨酸的影响,温度作为发酵过程的重要因素之一，影响与生长代谢相关酶类的催化反应速率及稳定性，从而调节微生物的生长和代谢产物的合成。本章考察不同的诱导温度对重组菌生产L-Phe 的影响，并分析发酵动力学参数的变化趋势，在此基础上提出并应用了分阶段诱导温度的控制策略以提高 L-Phe 的生产效率。,三. 研究的主要框架结构,一 发酵法生产 L-Phe 的重组质粒的构建NTG 诱变及抗-2-噻吩丙氨酸突变菌株的筛选重组质粒的构建 转化子的筛选与鉴定,重组质粒的序列分析重组大肠杆菌的培养酶活性检测质粒稳定性检测L-Phe 产量的测定,二 噬菌体的分离、纯化及抗噬菌体大肠杆菌的筛选噬菌体 BP-1 的分离、纯化NTG 诱变处理大肠杆菌以及筛选大肠杆菌感受态制备及质粒的转化方法,对上述构建的重组菌进行发酵参数检测（菌体浓度、葡萄糖浓度和 L-Phe 产量测定）结果与讨论,三 诱导温度对 重组抗噬菌体菌发酵生产 L-Phe 的影响培养重组的抗噬菌体菌株在培养过程中改变培养温度（设三个温度梯度）分析不同的诱导温度发酵动力学参数的变化趋势。（酶活、L-Phe产量、菌体浓度、质粒的稳定性等）结果分析,四. 研究创新点及难点,实验难点,BACK,五.实验可行性分析,1.通过大量查看有关于发酵法生产苯丙氨酸的资料，对其发酵代谢途径有了比较深刻的认识，对接下来研究提供理论基础帮助。2.实验用的大肠杆菌可通过自行培养获得，培养方便，成本低。