基因工程载体质粒.ppt

基因工程载体 南京农业大学陈溥言 概述 基因工程是利用酶学方法将不同来源的DNA或cDNA 在体外切割 修饰 连接插入到不同目的的基因工程载体中 进行扩增和表达 研究基因结构和功能 基因和蛋白质关系的一种分子生物学技术 载体 基因工程的十分重要的工具 载体DNA分子中是有一段生长扩增的非必需区 该区经人工改造后可插入外源的DNA 并可送入宿主细胞中 使外源DNA与载体DNA重组并共同扩增 目前的载体主要有 1 质粒 Plasmid 载体2 入噬菌体3 柯斯质粒 Cosmid 4 M13噬菌体5 杂交质粒6 病毒载体 包括穿梭载体 Shuttle 7 细菌人工染色体 bacterialartificialchromosome Shizuya 1992BAC 8 酵母人工染色体 yeastartificialchromosome Merry 1983YAC 9 来源于P1的细菌人工染色体 P1 derivedartificialchromosomePAC loannon 1994 10 哺乳动物人工染色体 MAC mamalartificialchromosome Farr 1991 11 人类人工染色体 HAC humanartificialchromosome Harrington 1997 12 植物人工染色体 PAC 质粒载体 Plasmid 一词最早是由Lederberg 1952年提出的 是双链 闭环DNA复制子 replicon 存在于细菌的细胞质中并独立于染色体之外 能自主复制的一类DNA 酵母的杀伤质粒 KillerPlasmid 是例外 它是一种RNA复制子 根据导链霉菌中存在线状质粒 质粒是细菌复制所非必须的 也就是说细菌失去质粒后仍可正常生长繁殖 但质粒可以赋于寄主某种新的有利的表型 质粒载体 质粒DNA的一般特点 质粒DNA可在宿主菌中自主复制 又是细菌复制非必须的 占总的基因组的1 3 所有原核生物都有质粒 赋于细菌一种表型 是菌株特性不是菌种特性 隐蔽质粒 Crypticplasmid 质粒都是双链闭环DNA复制子 酵母的杀伤质粒例外 RNA 质粒的一般生物学性质 1969年Rownd提出严紧型复制控制的质粒和松驰型控制的质粒 主要指在标准的培养基生长条件下 每个细菌中所含的质粒DNA的拷贝数多少划分的 严紧型质粒 一般分子量较高 每个寄主细胞中仅含10 60个拷贝的质粒 松驰型质粒 每个细菌中所含的质粒DNA的拷贝数高 一种质粒究竟属于严紧型还是松驰型并不是绝对的 往往与寄主状况有关 质粒的复制不仅受自身的制约 而且还受寄主菌的控制 氯霉素是蛋白质合成的抑制剂 一般在细菌生长的对数生长期后期 细菌达1 109细胞 mL 加入氯霉素或壮观霉素 细菌染色体和严紧型质粒复制停止 而松驰型质粒经过10 12小时 每个细胞中可多达几百个 甚至几千个质粒 每个细胞中可达50 以上DNA是质粒DNA 严紧型 Stringentplasmid 和松驰型 relaxedplasmid 质粒 PUC质粒都属松驰型质粒 PACYC184等质粒属严紧型质粒 根据需要使用严紧型还是松驰型质粒 如果插入外源DNA较大 或其产量过高会产生对宿主菌新陈代谢有干扰作用时 常选用严紧型质粒 反之选用松驰型质粒 2 质粒的不相容性 incompatibility 利用同一复制系统不同质粒不能稳定的和平共处的生存 称为质粒的不相容性 有时又称不亲和性 是指在没有选择压力情况下 两种亲缘关系密切的不同质粒 不能够在同一寄主细胞中稳定地共存现象 在细菌增殖过程中 其中一种质粒必然会丢失 分子克隆技术正基于质粒的不相容性质 在只带有一种质粒的细菌中 提取单一的DNA 3 质粒的转移性 革兰氏阴性细菌的质粒分为接合型质粒 Conjugativeplasmid 又叫自我转移质粒 它们既具有自我复制遗传信息 又具有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因 接合型质粒多属于严紧型质粒 非接合型质粒 non conjugativeplasmid 也叫不能自我转移的质粒 因为它们仅仅带有自主复制的遗传信息 非接合型质粒多属于松驰型质粒 1 质粒的类型 非接合型质粒的寄主细胞中同时存在一种接合型质粒 那么它们通常也是可以被转移的 这种由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程 叫质粒的迁移作用 mobiligation 又叫质粒的诱动 带有大肠杆菌素基因的Col质粒和带有抗菌素抗性基因的R质粒既有属于接合型的 也有属于非接合型的 如果在非接合型质粒的寄主细胞中同时存在一种接合型质粒 那么它们通常也是可以被转移的 这种由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程 叫质粒的迁移作用 mobilization 又叫质粒的诱动 ColE1是一种可以迁移但属于非接合型质粒 2 F因子 F因子是最有代表性的接合型质粒 又称致育因子 fertilityfactor 或性质粒 Sexplasmid 它在寄主细胞中有三种存在方式 独立于染色体之外 闭环双链DNA形式存在 这种细胞称F 细胞 独立于染色体之外 闭环双链DNA形式存在 但其DNA上还携带有寄主菌染色体基因或DNA区段 这种细胞称之为F 细胞 以线性DNA形式 从不同位点整合到寄主菌染色体上 这种细胞称为Hfr细胞 高频重组细胞 F因子是雄性决定因子 F 细胞表面可以形成一种叫做性须 pilus 的结果 它促使F 经性须进入F 细胞 F 细胞则变为F 细胞 F因子可以通过接合作用自我转移 也能够带动寄主染色体一道转移 但F因子的这种整合过程是可逆的 在一定条件下 Hfr细胞又可重新变为F 或F 细胞 基因工程多选用非接合型质粒 主要安全角度考虑 人工质粒要素 1 质粒的基因组小好 不影响生物学功能前题 转化入细菌的转化率与质粒大小呈反比 当质粒大于15kb时 转化率将成为限制因素 质粒大 拷贝数越低 2 质粒应易于转化 3 质粒应有较多的拷贝数 4 选择标记 5 质粒DNA可插入结合较大的外源DNA 大肠杆菌质粒分子的结构示意图 环形染色体DNA 环形质粒分子 大肠杆菌细胞 抗菌素抗性基因 控制质粒DNA转移的基因 质粒DNA 质粒主要包括几个组成部分 复制子 reilcator 复制起始位点 replicationoriginsite 多克隆位点 Polylink MCS 辅助序列 COS位点等 选择标记 LacZ 抗性等 pUC18和pUC19质粒图谱 质粒主要包括几个组成部分 一 复制子 reilcator 也就是基础复制子 basicreplicon 具有原质粒同样拷贝数的最小自主复制单位 一般约2kb 含一个复制起始部位Orgin Ori 拷贝数多少和携带有控制复制的基因信息 复制起始位点 replicationoriginsite 是富含A T区 双链DNA在此解鏈出现复制叉 紧靠富A T区的侧面富G C区 组成回文结构 是参与复制相关因子识别和结合位点 具备有多克隆位点 Polylink MCS 有数种限制性内切酶单一识别位点 便于插入外源DNA片段 易组建重组质粒而不影响质粒复制功能 有多用途的辅助序列如加入不同启动子序列 用于生产单链DNA或RNA 外源基因的大量表达 又加入COS位点 使载体能容纳更大的DNA片段等等 质粒载体的选择标记 外源DNA片段与质粒载体DNA连接 再转化入宿主菌 经培养后需筛选鉴定转化子 这就需要利用质粒载体的可选择标记 质粒载体的选择标记 最常用 主要有 四环素 Tet 氨苄青霉素 Amp 氯霉素 Cm 卡那霉素 Kan 新霉素 Neo 等 如质粒对氨苄青霉素有抗生时 则写成Ampr 反之则写成Amps 带有抗药性质粒称为R质粒 一个质粒载体通常有二种抗生素抗性基因 这样筛选质粒载体更可靠 外源DNA片段插入钝化了一个抗性基因 保留了另一个抗性基因 插入失活型载体 就是将外源DNA片段插入到会导致选择性基因 Ampr Tetr等 失活的位点 如PACYC184质粒的EcoRI上插入外源DNA片段 会导致氯霉素抗生基因失活 Cms 也有例外 如Villa Komaroff等1978年发现鼠胰岛素cDNA片段插入PstI切点 并未使Ampr基因失活 抗生素抗性基因选择标记 常用的是抗生素抗性基因的选择标记 主要有 四环素 Ter 氨苄青霉素 Amp 氯霉素 Cm 卡那霉素 Km 新霉素 Neo 等 如质粒对氨苄青霉素有抗生时 则写成AmPr 反之则写成AmPs 带有抗药性质粒称为R质粒 一个质粒载体通常有二种抗生素抗性基因 新的质粒还带有下列标记基因 使于筛选重组体 HA Luaferase GFP 便于检测的多肽 原理是具有四环素抗性的细菌对亲脂的螯合剂萎蔫酸 fusaricacid 极为敏感 因此 将外源性DNA插入到质粒载体的四环素抗性基因的酶切位点上 在含有萎蔫酸的培养基上筛选对四环素敏感的重组子 则是十分方便的方法 丢失四环素抗性标记的正选择体系 四环素抗菌机理是抑制细菌蛋白质合成 使细菌停止生长 但菌不死亡 环丝氨酸是氨基酸的类似物 在细菌的生长过程中 如加入环丝氨酸 则会参入到细菌新合成的蛋白质多肽链 使细菌死亡 所以在含有四环素培养基上 环丝氨酸只杀死Tetr细菌 对停止生长的Tets菌则无致死作用 若经过环丝氨酸法多次重复处理Tets菌会富集 产量上可高出数倍 便于筛选重组子 环丝氨酸富集法筛Tets重组子 环丝氨酸富集法示意图 AmprTets转化子 带插入片段 转化混合物 氨苄青霉素选择 四环素 环丝氨酸选择 通常用 互补现象的检查 很多质粒载体DNA都有一段 来自大肠杆菌DNA 含 半乳糖苷酶基因 LacZ 的调控序列和该酶基因氨基端146个氨基酸编码信息 并在这个编码区中加入一个多克隆酶切位点 并不破坏阅读框 而宿主菌有编码半乳糖苷酶C端部分序列 宿主菌和质粒编码片段各自基因都不完整 都没有酶活性 当质粒转化入宿主菌后就会产生具有酶活性的蛋白质 加入生色底物X gal 5 溴 4 氯 3 吲哚 D 半乳糖苷 后会形成蓝色菌落 而插入DNA的重组子则破坏了LacZ的阅读框 不能使X gal变蓝 而产生白色菌落 这种LacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体 宿主菌 与带有完整的近操纵基因片段的 半乳糖苷酶阴性的突变体 质粒载体 之间实现互补 这种互补现象称为 互补 这样通过明显的颜色变化 挑选重组子则变得简单易行 往往在这过程中还要加入IPTG 异丙基硫化 D 半乳糖苷 作为酶反应催化剂 4 显色法筛选重组子 质粒DNA有一段 来自大肠杆菌DNA 含 半乳糖苷酶基因 LacZ 的调控序列和该酶基因氨基端146个氨基酸编码信息 在这个编码区中加入一个多克隆酶切位点 不破坏阅读框 宿主菌有编码半乳糖苷酶C端部分序列 宿主菌和质粒编码片段各自基因都不完整 都没有酶活性 当质粒转化入宿主菌后就会产生具有酶活性的蛋白质 加入生色底物X gal后会形成蓝色菌落 而插入DNA的重组子则破坏了LacZ的阅读框 不能使X gal变兰 而产生白色菌落 这种突变体 宿主菌 与质粒载体之间互补现象称为 互补 入IPTG作为酶反应催化剂 通过颜色变化筛选重组子 通常用 互补现象的检查 互补原理 质粒的LacZ仅编码 半乳糖苷酶的氨基端宿主菌的LacZ仅编码 半乳糖苷酶的羧基端 均无活性 各自编码的肽链可以融为一体 形成具有酶活性的蛋白 5 嗅 4 氯 3 吲哚 半乳糖苷 X gal 蓝色产物 半乳糖苷酶异丙基硫代 D 半乳糖苷 IPTG 蓝 白斑实验 构建的质粒人工载体 应用最广的是PBR322 分子量为2 6 106 含46332bp 含有选择标记抗氨苄青霉素 Apr 基因来自天然质粒RSF2124和抗四环素 Ter 基因来自PSC101质粒 复制子部分来自PMB9 一类Co1E1质粒 多克隆限制性内节切酶位点有9个 在PBR322的基础上已构建出第二代 第三代质粒载体衍生物 PUC系列 Pbluescript质粒 体积更小 具有更多的单一限制性内切酶位点 其拷贝数也比PBR322多10 20倍 可获得更多的DNA产量 质粒的消除有的质粒在自然条件下可以从宿主菌中消失 也可以在培养细菌时加入适当的理化因素使质粒消除 curing 质粒的消除剂有 吖啶橙 溴化乙锭 利福平 SDS 紫外线 高温等 不同载体的用途不尽相同 1 克隆 扩增外源基因 片段大小 质粒用于常规DNA克隆 COSmid和 噬菌体用于染色体 大的DNA片段克隆 2 外源DNA或cDNA在载体上进行改造 缺失 重组一般用质粒 3 序列分析 dsDNA或ssDNA测序 用质粒或M13以及一些新型质粒 4 制备探针 单链DNA或RNA利用质粒 制各单链DNA探针利用M13 5 表达原核基因的载体 质粒 入噬菌体 表呈技术 6 表达真核基因载体 包括病毒疫苗研制 质粒 酵母 病毒7 转移载体 将外源基因转入哺乳动物细胞中 建立稳定表达基因的细胞株 常用质粒和病毒载体 8 PCR产物克隆载体 T载体 Teasy载体 PCR 等 9 DNA疫苗载体10 研究基因结构功能的载体 如无启动子载体 载体如何选择 1 根据插入片段大小 及酶切位点 2 重组体的目的 作用 文库 表达 基因调控 探针 突变 3 筛选方便 探针 免疫学方法 抗性 显色 4 便于提纯 加入His 生物学 牛血清血蛋白BSA 不同载体用途不尽相同 一 克隆 扩增外源基因 片段大小 质粒用于常规DNA克隆 COSmid和入噬菌体 细菌人工染色体 酵母人工染色体 用于染色体 大的DNA片段克隆 二 外源DNA或CDNA在载体上进行改造 缺失 重组一般用质粒 三 序列分析dsDNA或ssDNA测序 用质粒或M13以及一些新型质粒 四 制备探针单链DNA或RNA利用质粒 制各单链DNA探针利用M13 五 表达