Daam1蓬乱蛋白相关形态形成活化因子-1TC

蓬乱蛋白相关形态形成活化因子-1 （Dishevelled associated activator of morphogenesis-1，Daam1） 对心脏发育是必须的,报告人： 唐超 2012-3-19,背景简介,蓬乱蛋白相关形态形成活化因子-1（Dishevelled associated activator ofmorphogenesis-1，Daam1）， 是形成素（formin）蛋白家族成员之一。在人体各类组织中广泛表达 。并在介导线性肌动蛋白的装配来调节肌动蛋白细胞骨架中起着重要的作用。,早期研究表明在非洲爪蟾Daam蛋白主要对原肠有重要作用(Habas et al., 2001)而果蝇中DAAM突变表现出气管缺陷(Matusek et al., 2006).这些早期的研究结果表明，Daam1影响的组织形态。但在哺乳动物中Daam1的生理功能迄今都了解不多,作者研究发现,作者发现，Daam1在小鼠发育中的器官内高效表达，包括心脏。研究使用Daam1-缺陷小鼠显示，Daam1对于心脏形态发育是必不可少的在亚细胞水平，Daam1对于丝状肌动蛋（F-肌动蛋白）组配和肌原组织以及细胞粘和定位是必须的。,材料与方法,一、小鼠胚胎心肌细胞和成纤维细胞培养二、 RT-PCR 和原位杂交三、免疫印迹western blot四、免疫荧光,五、细胞伤口愈合试验分析,六、超声心电图分析,七、 RhoA, Rac1 and Cdc42结构域活性分析 通过GST pulldown 技术八、用基因诱捕构建的Daam1基因缺陷的小鼠模型1、胚胎干细胞系(cell No.: RRT390)2、带各种筛选、报告基因的诱捕载体,基因诱捕(gene trap)是基于小鼠胚胎干细胞、报道载体(诱捕载体)建立的一种基因突变方法。诱捕载体在整合位点利用内源基因调控元件模仿内源基因表达, 使其表达终止。,LTR 报告基因，由上游启动子起始表达；SA, 剪接受体; GFNR, 绿荧光硝基还原酶基因;pPKG, PKG 启动子; neo, 新霉素抗性基因。,基因诱捕载体系统(ROSA- GFNR)结构示意图,本文作者首先得到一个在Daam1处插入了突变型小鼠胚胎干细胞的细胞株(cell No.: RRT390)，可以接受报告载体的整合。构建了一个lacZ及新霉素筛选位点，融合进入ES，导入C57BL/6J品系小鼠内繁殖的第一代即为基因缺陷型小鼠。,结果,图A-a ：基因诱捕载体示意图 图A-b：蛋白印迹和DNA电泳图 16.5d胚胎，Het为Daam1等位基因，Mut为纯合突变,图B:DNA电泳和蛋白印迹图。 16.5d胚胎各器官，Het为Daam1等位基因，Mut为纯合突变,1、表明Daam1基因缺陷的小鼠模型构建成功 2、Daam1在小鼠各处器官均有表达,Daam1在正常小鼠中的表达谱,A-a-c：8.5-10.5d小鼠胚胎原位杂交检测Daam1的表达d-e：10.5d切片分析AVC，房室垫; EC，心内膜; EPC，心外膜;,图B：8.5-10.5d Daam1在心脏和脑中PCR检测,Daam1突变小鼠中用半乳糖苷酶染色切片分析发现Daam1在小鼠全身表达，在心脏处高表达10.5d表达强烈,发育的心脏和神经管用免疫荧光染色E12.5胚胎冰冻切片。WGA：麦胚凝集素特异性染心肌细胞膜DAPI：特异性然细胞质,Daam1gt/gt小鼠的心脏表型和功能特性。,切片分析 E14.5 d、f：DORV畸形 h、I VSD畸形,切片分析 P0 d、f、h：DORV畸形 j： VSD畸形,2月龄Daam1小鼠的病理分析图C：Daam1突变小鼠左心室壁出现脑回沟疏松结构（箭头所示）图D-a：心脏与身体的比重。图D-b：超声波心电图分析。表明Daam1突变型小鼠LV心肌变厚。,Daam1gt/gt 拯救小鼠,通过NKx2.5Cre小鼠与Daam1gt/gt小鼠杂交获得Daam1拯救型小鼠。图A：基因示意图图B: E10.5 半乳糖苷酶染色表明拯救成功,E14.5胚胎组织切片Daam1gt/gt/Nkx2-5Cre/+胚胎（B，D，F）表现出正常的心脏结构,1周龄小鼠组织切片。daam1gt/+（A，D）和Daam1gt/gt/Nkx2-5Cre/+（C，F）小鼠表现出正常的室壁和小梁。Daam1gt/gt突变小鼠（B，E）显示心室致密。,作者发现Daam1缺陷病不影响心肌细胞分化，增殖或凋亡通过Nkx2-5, Tbx20 and Gata4心脏早期发育基因, 形态发生蛋白 BMP10心室标志性基因MLC2A 、 MLC2V都无显著差异表达,图A：只有Daam1gt/gt小鼠饥饿后F-肌动蛋白明显降低表达 图B：E12.5心脏中 肌动蛋白荧光分析表明，只有 Daam1gt/gt小鼠肌动蛋白表达量很低,以上结果表明：在心肌细胞中肌动蛋白细胞骨架的形成和横纹肌组织的形成是需要Daam1的,Daam1gt/gt小鼠在心肌细胞中横纹肌的形成受到干扰,图A:E12.5 Daam1gt/gt小鼠心肌细胞的粘附蛋白 -catenin和N-cadherin 表达明显混乱图B： Daam1