《工具酶和基因载体》PPT课件.ppt

第三节工具酶和基因载体 2 3 1基因工程的工具酶 限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 碱性磷酸酯酶 S1核酸酶 逆转录酶 能在特定部位限制性地切割DNA分子 在识别的序列中如果存在甲基化碱基 不能切割 2 3 1 1限制性核酸内切酶 粘性末端 粘性末端与平末端 限制性内切酶进行酶切时 两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置如果是交错的 产生的DNA片段末端的一条链多出一到多个核苷酸 这样的末端称为粘性末端 两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置如果是平齐的 这样的末端称为平末端 平末端 1限制性内切酶的分类 IIIIII作用底物双链DNA双链DNA双链DNA识别序列特异特异特异切割位点距识别部在识别部位内部距识别部位位1000bp25 27bp功能切割 修饰切割切割 修饰能量需要不需要需要举例EcoBEcoKEcoRIEcoPI 2II型限制性内切酶的命名原则 1 限制性内切酶的基本名由3个字母组成 第一个是该酶所属微生物属名的第一个字母 大写 斜体 第二个和第三个字母是该酶所属微生物种名的第一和第二个字母 小写 例如 大肠杆菌EscherichiacoliEco流感嗜血菌haemophilusinfluenzaeHin 2 如同一种菌有不同的菌株或不同的品系 把菌株或品系的名称写在基本名的后面 如从大肠杆菌R品系中分离到的酶 记做EcoR 3 同一种菌有几种不同的酶时 用罗马数字表示 如在大肠杆菌中R品系中分离到了5种酶 分别叫EcoRI EcoRII EcoRV 4 如同一属中不同种的种名前两个字母相同时 取种名较靠前的字母表示 HaemophilusparainfluenzaeHarHaemophilusparahaemlyticusHph 识别双链DNA分子中4 8对碱基的特定序列 大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧 识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构 5 GCTGAATTCGAG 3 3 CGACTTAAGCTC 5 EcoRI的识别序列 EcoRI的切割位点 3II型限制性内切酶的识别位点和切割特性 EcoRI等产生的5 粘性末端 EcoRI37 5 G C T G OHP A A T T C G A G 3 3 C G A C T T A A POH G C T C 5 退火4 7 5 G C T GA A T T C G A G 3 3 C G A C T T A AG C T C 5 OH P OH P PstI等产生的3 粘性末端 5 G C T C T G C A G G A G 3 3 C G A G A C G T C C T C 5 PstI37 5 G C T C T G C A OHP G G A G 3 3 C G A G POH A C G T C C T C 5 退火4 7 5 G C T C T G C AG G A G 3 3 C G A GA C G T C C T C 5 OH P OH P 连接便利 粘性末端的意义 i 不同的DNA双链 只要粘性末端碱基互补就可以连接 ii 同一个DNA分子内连接 通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子 这比连接两个平齐末端容易的多 补平成平齐末端 凸出的3 端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴 如AAA或TTT等 造成人工粘性末端 5 末端标记 凸出的5 末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记 粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端 PvuII等产生的平头末端 5 G C T C A G C T G G A G 3 3 C G A G T C G A C C T C 5 PvuII37 5 G C T C A G OHP C T G G A G 3 3 C G A G T C POH G A C C T C 5 识别位点的序列相同的限制性内切酶 同裂酶 Isoschizomers Hind 5 A AGCTT 3 3 TTCGA A 5 HsuI5 A AGCTT 3 3 TTCGA A 5 识别的序列不同 但能切出相同的粘性末端 如BamHI Bgl BclI Xho 等 同尾酶 Isocaudamers 5 G GATCC 3 3 CCTAG G 5 BamHI BclI 5 T GATCA 3 3 ACTAG T 5 5 A GATCT 3 3 TCTAG A 5 Bgl 5 U GATCY 3 3 YCTAG U 5 Xho U代表嘌呤 Y代表嘧啶 5 GATC 3 3 CTAG 5 Sau3A 同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别 5 G3 CCTAG GATCT 3 A 5 BamHI Bgl 5 GGATCT 3 3 CCTAGA 5 BamHI Bgl Sau3A 1 在特异位点上切割DNA 产生特异的限制性内切酶切割的DNA片段 5II型限制性内切酶的主要用途 2 建立DNA分子的限制性内切酶物理图谱 3 构建基因文库 4 用限制性内切酶切出相同的粘性末端 以便重组DNA 如果用不同的限制性内切酶酶解同一个DNA分子 然后用琼脂糖凝胶电泳的方法对酶解过的DNA片段的大小进行比较 最后将这一DNA片段上的限制性内切酶位点的顺序标出来 就可以制出酶切位点的物理图谱 DNA连接酶的基本性质 修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键 DNA连接酶 5 G C T C T G C AG G A G 3 3 C G A GA C G T C C T C 5 OH P OH P 5 G C T C T G C A G G A G 3 3 C G A G A C G T C C T C 5 nick nick 2 3 1 2DNA连接酶 1 必须是两条双链DNA 2 DNA3 端有游离的 OH 5 端有一个磷酸基团 P 3 需要能量 动物或噬菌体中 ATP大肠杆菌中 NAD 连接条件 DNA连接酶的基本性质 大肠杆菌DNA连接酶 只能催化双链DNA的互补黏性末端 以NAD 为能量T4噬菌体连接酶 黏性 平末端均可连接 以ATP为能量 DNA连接酶的基本性质 连接多个平头双链DNA分子 5 G C T C A G C T G G A G 3 3 C G A G T C G A C C T C 5 T4 DNA连接酶 连接酶连接缺口DNA的最佳反应温度是37 但在这个温度下 粘性末端之间的氢键结合是不稳定的 DNA连接酶的基本性质 因此连接粘性末端的最佳温度介于酶作用的最佳温度和末端结合速率最佳温度之间 一般认为4 15 是比较合适的 基因工程中常用的DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶I 全酶 2 大肠杆菌DNA聚合酶I大片段 Klenowfragment 3 T4噬菌体DNA聚合酶4 T7噬菌体DNA聚合酶及其改造的测序物5 耐热DNA聚合酶 TapDNA 6 末端转移酶 2 3 1 3DNA聚合酶 1 共同特点 把dNTPs连续地加到引物的3 OH端 2 主要区别 T7DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来 常用的DNA聚合酶的特点 持续合成能力和外切酶活性不同 常用DNA聚合酶的特性比较 大肠杆菌DNA聚合酶I DNApolI 5 3 的DNA聚合酶活性 5 3 的核酸外切酶活性 3 5 的核酸外切酶活性 大肠杆菌DNA聚合酶I的基本性质 3 G C T C A G C T G G A G A 5 5 C G A G T OH 5 pppdNTPMg2 3 G C T C A G C T G G A G A 5 5 C G A G T C G A C C OH DNApolI DNA聚合酶I的主要用途 用切口平移方法标记DNA 可作杂交探针 使用其5 3 外切核酸酶活性降解寡核苷酸作为合成cDNA第二链的引物 用于DNA分子的3 突出尾进行末端标记 用于DNA序列分析 大肠杆菌DNA聚合酶I大片段 Klenow Klenow酶的基本性质 大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理 获得N端 三分之二的大肽段 即为Klenow酶 Klenow酶仍拥有5 3 的DNA聚合酶活性和3 5 的 核酸外切酶活性 但失去了5 3 的核酸外切酶活性 Klenow酶的基本用途 补平由限制性内切酶切割DNA产生的3 凹端 用P32dNTP补平3 凹端 cDNA克隆中 用于合成cDNA第二链 在体外诱变中 用于从单链模板合成双链DNA 应用双脱氧链末端终止法进行DNA测序 对带3 突出端DNA进行末端标记 1 补平由核酸内切酶产生的3 凹端 5 G C T G OHP A A T T C G A G 3 3 C G A C T T A A POH G C T C 5 Klenow dATPdTTP 5 G C T G A A T T OHP A A T T C G A G 3 3 C G A C T T A A POH T T A A G C T C 5 2 DNA片段的同位素末端标记 5 G C T G OHP A A T T C G A G 3 3 C G A C T T A A POH G C T C 5 Klenow a 32P pppdATP 5 G C T G A A T T OHP A A T T C G A G 3 3 C G A C T T A A POH T T A A G C T C 5 基本性质 功能与Klenow片段相似 都具有5 3 聚合酶活性及3 5 外切核酸酶活性 但其3 5 外切酶活性对单链DNA的作用比对双链DNA的作用更强 T4噬菌体DNA聚合酶 T4噬菌体DNA聚合酶的主要用途 对带3 突出端DNA进行末端标记 补平或标记限制性内切酶消化DNA产生的3 凹端 标记用作探针的DNA片段 将双链DNA的末端转化成为平端 使结合于单链DNA模板上的诱变寡核苷酸引物得到延伸 T7噬菌体DNA聚合酶及其改造的测序酶 基本特性 3 5 外切核酸酶活性约为Klenow片段的1000倍无5 3 核酸外切酶活性 用途 复制长段模板的引物延伸反应快速末端标记 TaqDNA聚合酶 基本特性 5 3 的DNA聚合酶活性5 3 的核酸外切酶活性耐高温78 94度 用途 PCR扩增DNA序列测定 催化脱氧核苷酸添加到DNA分子的3 OH末端上 催化作用不要求有模板 但需有Co2 的存在 用途 给载体或cDNA加上互补的同聚尾DNA片段3 末端的放射同位素标记 末端转移酶 逆转录酶的基本特性 1 以RNA为模板聚合cDNA链 3 AAAAAAAAAAAAAA 5 mRNA 逆转录酶 Mg2 dNTP 5 TTTTTTTTTTTToligo dT 12 18 3 AAAAAAAAAAAAAA 5 mRNA 5 TTTTTTTTTTTTTT 3 cDNA 2 3 1 4依赖于RNA的DNA聚合酶 逆转录酶 逆转录酶的基本特性 2 双向外切DNA RNA杂合链中的RNA链 逆转录酶 3 RNA 5 DNA 3 5 3 RNA 5 DNA 3 5 逆转录酶 5 DNA 3 2 3 2基因工程载体 质粒 plasmid 植物病毒载体 噬菌体载体 黏性质粒载体或柯斯质粒 cosmid 表达载体 在基因工程操作中 把能携带外源DNA进入受体细胞 并在其中得以维持的DNA分子叫载体 1 载体 Vectors 载体的功能及特征 1 具有对受体细胞的可转移性 并在宿主细胞内能独立复制 2 有选择性标记 便于重组DNA分子的检测 3 有一段多克隆位点 2 基因工程对载体的要求 外源DNA插入其中不影响载体的复制 4 分子量小 拷贝数多 5 容易从宿主细胞中分离纯化 大肠杆菌的质粒 2 3 2 1质粒载体 1 分子小 1 质粒的一般生物学特性 1 500kb 2 编码基因少 2 3个中等大小的蛋白质 3 环形DNA分子 双链环状DNA 酵母的 杀伤质粒 是RNA 如抗菌素抗性 代谢特征等 赋予细菌一些额外的特性 非必须 4 质粒的空间构型 共价闭合环状DNA cccDNA 呈超螺旋 SC supercoil CovalentclosecircularDNA 线形DNA linear lDNA 一条链上有一至数个缺口 开环DNA opencircular ocDNA 1 具有复制起点 ORI 质粒载体必须具备的基本条件 2 应该有一个或多个选择标记基因 3 应该有用来克隆外源DNA的单一的限制性内切酶识别位点 是筛选的标志 理想的载体应该有两种抗菌素抗性基因 用来插入外源DNA片断 且插入后不影响复制功能 4 具有较小的分子量和较高的拷贝数 氨苄青霉素抗性 Ampr 卡那霉素抗性 Kanr 四环素抗性 Tetr 链霉素抗性 Strr 氯霉素抗性 Cmlr 2 质粒载体的选择标记 1 选择标记 抗菌素抗性 绝大多数质粒载体都是用抗菌素抗性标记 10 当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后 受体菌才能生长 不带有抗菌素抗性基因的受体菌不能在含有抗菌素的培养基 选择培养基 中生长 2 抗菌素选择原理 3 质粒载体的种类 1 高拷贝数的质粒载体 ColE1 pMB1派生质粒具有高拷贝数的特点 而且在没有菌体蛋白质合成的条件下 蛋白质合成抑制剂 氯霉素等存在下 仍能复制 达到每个细胞的拷贝数1000 3000个 适合大量增殖克隆基因 或需要表达大量的基因产物 2 低拷贝数的质粒载体 但有特殊用途 由pSC101派生来的载体特点是分子量小 拷贝数低 当有些被克隆的基因的表达产物过多时会严重地影响寄主菌的正常代谢活动 导致寄主菌死亡时 就需要低拷贝的载体 pLG338 pLG339 pHSG415等 不适合大量扩增DNA用 3 失控的质粒载体 这是一类温度敏感型复制控制质粒 温度低 低于37oC 拷贝数很少 温度增加 40oC 时 拷贝数会很快增加到1000个以上 如pBEU1 pBEU2 runawayplasmidvectors 1979年B E Uhlin等构建 4 插入失活型质粒载体 载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部 如pDF41 pDF42 pBR329 抗菌素抗性 外源DNA 无抗菌素抗性 5 正选择的质粒载体 如pUR2 pTR262等 只有带有选择标记基因的转化菌细胞才能在选择培养基上生长 直接选择转化后的细胞 目前通用的绝大部分质粒载体都是正选择载体 Directselectionvectors pSP2124质粒的Ampr基因 A pBR322 1 元件来源 F Bolivar和R L Rodriguez人工构建载体 复制起点ori pMB1系列 来源于ColE1 的高拷贝型复制起点 Ampr基因 Tetr基因 pSC101的Tetr基因 4 常见的质粒载体 2 长度 4363bp 3 选择标记 氨苄青霉素和四环素抗性 4 克隆位点 其中9个会导致Tetr基因失活 如BamHI Hind SalI 3个会导致Ampr基因失活 ScaI PvuI PstI 24个克隆位点 5 pBR322的优点 双抗菌素抗性选择标记 插入失活 分两次先后选择 没有获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet中都死亡 获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet其中之一中死亡 外源基因 BamHI Amp中存活 但在Tet中死亡 外源基因 PstI Tet中存活 但在Amp中死亡 氯霉素扩增之后 每个细胞可达1000 3000copy 安全 失去了转移蛋白基因mob mobilization 不能通过接合转移 高拷贝数 分子小 克隆能力大 载体越小越好 10kb的DNA在纯化过程中容易断裂 B 质粒载体pUC系列 UniversityofCalifornia的J Messing和J Vieria于1978年 在pBR322的基础上改造而成 属正选择载体 pUC7 pUC8 pUC9 pUC10 pUC11 pUC18 pUC19 复制起点 pBR322的ori 但其上失去了克隆位点 Ampr基因 1 元件来源 lacZ的启动子 大肠杆菌 lacZ 基因 大肠杆菌lacZ的 肽链序列 是LacZ的氨基端片断 pBR322的Ampr基因 2 长度 约2 7kb 3 克隆位点 10个连续的单一限制酶切位点 位于lacZ 基因的5 端 pUC18 19 Ampicillin抗性和lacZ的 肽互补 蓝白斑 相结合 4 选择标记 蓝白斑选择原理 Xgal 5 Bromo 4 chloro 3 indolyl D galactoside 半乳糖苷酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5 溴 4 氯靛蓝 Xgal 半乳糖 5 溴 4 氯靛蓝 半乳糖苷酶 半乳糖苷酶Xgal显色反应 lacZ的 肽互补 1 肽 lacZ 半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断 11 41氨基酸 lacZ只有在4聚体的状态下才有功能 C端大部分 N端的11 41aa C端大部分 N端的11 41aa C端大部分 N端的11 41aa C端大部分 N端的11 41aa 4聚体 2 受体菌lacZ突变 lacZ M15 受体菌基因组的 半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失 缺失 肽 不能形成4聚体的活性酶 不能分解Xgal 受体菌株 JM系列 TG1 TG2 XL1 blue XS127 XS101 KK2186 MV1184 DH5a pUC质粒载体上的lacZ 编码 肽与这个缺失突变的 半乳糖苷酶 互补 使它能形成4聚体 又能分解Xgal 产生蓝色物质 C端大部分 N端的11 41aa pUClacZ 受体菌lacZ 3 载体lacZ 与 互补 4 互补的插入失活 pUC载体上LacZ 的5 端有一段多克隆位点 MCS 区 本身虽不干扰LacZ 的合成 但插入外源基因就会阻止LacZ 的合成 不能互补 lacZ 5 3 肽移码突变 lacZ 5 3 肽 不互补 互补 MCS 外源DNA IPTG的诱导作用 IPTG是乳糖的类似物 能诱导lac操纵子的启动转录 使受体菌基因组中的lacZ的C端部分和载体的lacZ 肽都表达 从而互补 但载体MCS上插入外源DNA后 仍然不能产生 肽 IPTG 通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道是否有DNA插入 MCS无插入时 互补 蓝菌斑 MCS有插入时 不互补 白菌斑 IPTG诱导的结果 5 pUC系列载体的优点 更小的分子量 如pUC18为2682bp pUC8为2750bp 选择方便 Xgal显色 抗菌素双重直接选择 克隆便利 具有多克隆位点 MCS 使有两个不同粘性末端的外源DNA方便地插入 测序方便 pUC的MCS与M13噬菌体载体的MCS完全相同 便于把外源DNA转移到M13载体上测序 M13mp18的多克隆位点 C 酵母质粒载体 穿梭质粒载体 1 穿梭质粒载体的结构 人工构建的 具有两种不同复制起点和选择标记 可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体 shuttleplasmidvectors 2 穿梭载体的优点 也能利用其它细胞系统 酵母 枯草杆菌 哺乳动物细胞等 进行基因表达 可以自如地在两种不同寄主细胞之间来回转移基因 克隆 构建 表达 E coli Animalcell 利用大肠杆菌进行基因克隆 表达 2 3 2 3噬菌体载体 噬菌体是一类细菌病毒 Bacteriophage 1 噬菌体的特点 结构 蛋白质外壳内包裹着DNA 双链 单链 线性 环状等 singlelinearDNA about182 000bp T2GenomicDNA T4Bacteriophage 分为两种 1 溶菌周期 2 噬菌体的生活周期 感染细菌后立即在菌体内复制和合成蛋白质外壳 重新组装成噬菌体颗粒 并导致细菌细胞解体 释放出大量子代噬菌体 烈性噬菌体 virulentphage 感染细菌后 将自己的DNA整合到细菌的染色体DNA中 形成这一过程称为溶源化 lysogenization 整合到细菌染色体的噬菌体DNA称为原噬菌体 随细菌的染色体复制而复制 温和噬菌体 temperatephage 原噬菌体 prophage 2 溶源周期 1 长度为48502bp 2 双链线性DNA 3 在两端有cos位点 可以环化 DNA两端各有12bp的粘性末端 粘性末端形成的双链区域称为cos位点 1 DNA分子的特点 cos位点 cohensive endsite 3 噬菌体载体的构建 DNA进入细菌体内后 可形成双链环状DNA复制型 RF DNA 噬菌体和其DNA DNA上有至少61个基因 有一半是必须的 与自身的活动有关 成簇排列 其他约1 3是非必须基因 位于尾部合成至阻遏之间的区段 2 噬菌体的基因组特点 genome 48502bp 构建原理 3 噬菌体载体的构建 构建过程 用限制性内切酶去 DNA分子上的非必需区 在 DNA的非必需区内插入选择标记基因 噬菌体DNA上本身有5个EcoRI和7个HindIII切点 删除 噬菌体的非必需区 留出插入空间 DNA如质粒载体那样直接转化细菌时效率远比质粒低 在试管中与 噬菌体的头部和尾部蛋白人工装配成噬菌体颗粒 才能高效地感染细菌 把重组DNA注入受体菌中 必须利用噬菌体外壳的作用 体外包装 建立 DNA分子体外包装系统 人工构建的 噬菌体载体有两种类型 a 插入型载体 insertionvectors 只具有一个外源DNA插入限制酶位点 如 gt10 gt11 BV2 NM540 NM1590 NM607 1 免疫功能失活型 插入位点位于载体合成活性阻遏物区域 cI基因 内 EcoRI gt10 插入导致载体不能合成阻遏物 载体DNA不能进入溶源期 受体菌全部裂解 形成清晰的噬菌斑 没有外源DNA插入的 载体感染受体菌形成混浊噬菌斑 选择标记 如 NM1149载体的两个克隆位点 EcoRI和HindIII 都是位于cI基因内部 2 半乳糖苷酶失活型载体 在 基因组中引入了LacZ序列 其上含有一个EcoRI克隆位点 感染LacZ突变的大肠杆菌 经IPTG的诱导 利用Xgal的显色反应作选择标记 EcoRI Charon16A 选择标记 b 替换型载体 substitutionvectors 两个多克隆位点区以反向重复形式分别位于 DNA的非必须区两端 用酶切后 可以将中间的区段切下来 与用同样酶切成的外源DNA片断置换 可置换区 MCS MCS 如 EMBL4 Charon40等 EMBL4 EMBL4的可置换片断内部还有SalI酶切位点 以便于进一步消化中间片断 防止自我连接 左臂 可置换区 右臂 EcoRIBamHISalI SalIBamHIEcoRI SalISalI EMBL4 比一般的质粒载体的容量大的多 用在真核生物基因组文库的建立 Sau3A BamHI 4 DNA载体的优点 1978年J Collins和B Hohn等人发展出cosmidvector cossite