欧米加-3-酸乙酯检验规程.doc

题目：欧米加-3-酸乙酯检验规程文件号 Document No.QJ/XH0201107A原文件号 Supersedes-编写人/Prepared by（QC）：审核人/Reviewed by（QC / QA）：批准人/Approved by（QC）：1 主题内容与适用范围 本标准规定了欧米加3酸乙酯（USP）的技术要求、检验方法、检验规则，并描述了更改信息。 本标准适用于本公司自产欧米加3酸乙酯（USP）的出厂质量检验，留样观察检验，不适用于用户验收。 2 引用标准USP现行版3 技术要求表1 质量规格检验项目质量标准性状浅黄色液体，鱼油特有腥味鉴别GC：主峰与对照品保留时间一致含量DHA-EE（%）34.740.3EPA-EE（%）43.049.5DHA+EPA（%）80.088.0总-3（%）90.0未知杂质单个未知杂质（%）0.5总未知杂质（%）2胆固醇（mg/g）3.0低聚物（%）1.0酸值（mg KOH/g）2.0茴香胺值15过氧化值（meq/kg）10.0紫外吸收（=233nm）0.55重金属Pb（ppm）0.1Cd（ppm）0.1As（ppm）0.1Hg（ppm）0.1二噁英和多氯联苯二噁英（pg/g）1多氯联苯（ppm）0.5a-生育酚（%）0.40残留溶剂乙醇（%）0.5正己烷（%）0.0294 检验方法：4.1 性状：取样品适量，置于比色管中，在自然光下观察比较，本品为浅黄色液体，具有鱼油特有腥味，。4.2鉴别： 在含量测定项下，本品的GC图谱的主峰保留时间与二十二碳六烯酸乙基酯（DHA-乙酯）和二十碳五烯酸乙基酯（EPA-乙酯）标准品一致。 4.3 酸值：精密称取样品约15.0g至250ml锥形瓶中，加入100ml等体积的乙醇和乙醚（1:1）（用0.01N 氢氧化钾中和后），加入数滴酚酞指示剂，用0.01N的氢氧化钾滴定至粉红色（震摇30秒后），判定为终点，记下消耗氢氧化钾的体积（ml）。 样品的酸值按下式计算：酸值=56.11VN/W V：消耗氢氧化钾的体积（ml）； N：氢氧化钾摩尔浓度（0.01）； W: 样品称样量（g）；4.4 茴香胺值：溶液A：精密称取样品约0.500g至25ml容量瓶中，加入异辛烷定容至刻度，摇匀，即得。溶液B：精密移取溶液A 5.0ml，加入1ml2.5g/L-茴香胺的冰醋酸溶液，摇匀，避光保存，即得。标准溶液：精密移取异辛烷 5.0ml，加入1ml 2.5g/L-茴香胺的冰醋酸溶液，摇匀，避光保存，即得。测量过程：用异辛烷作空白，记录溶液A在350nm下的吸收值；用标准溶液作参比，记录溶液B在350nm下的吸收值（放置10min后）；样品的茴香胺值按下式计算： 茴香胺值=25（1.2As-Ab）/m As：溶液B在350nm下的吸收值； Ab：溶液A在350nm下的吸收值； m: 样品称样量（g）；4.5 过氧化值：精密称取样品约5.0g至250ml锥形瓶中，加入30ml冰醋酸和二氯甲烷（3:2），震摇，溶解，加入0.5ml饱和碘化钾溶液，震摇1min，再加入30ml水，用硫代硫酸钠滴定液（0.01mol/L）滴定，溶液由黄色滴至淡黄色，再加入5ml淀粉试液，继续滴定，溶液由蓝色滴至无色，记下硫代硫酸钠滴定液（0.01mol/L）的体积VT（ml）。平行测两次。空白除不加样品按上述方法测定,记下空白消耗硫代硫酸钠滴定液（0.01mol/L）的体积VB（ml）。 样品的过氧化值按下式计算： 过氧化值=1000(VTVB)NWN: 硫代硫酸钠滴定液的浓度； W: 样品称样量（g）；4.6 紫外吸收（233nm）：准确称取300mg样品至50ml容量瓶中，立刻用异辛烷稀释定容。再移取2.0ml至50ml容量瓶中，用异辛烷稀释并定容。照紫外可见分光光度法，以异辛烷作空白在233nm处测定上述测定液的吸收度不得过0.55。4.7 含量及有关物质：4.7.1色谱条件a)色谱柱：DB-WAX毛细管柱（30m*0.25mm*0.25um）；b)载气：N2；c)检测器：FID；d)FID 温度：270 ；e)进样口温度：270 ；f)线速度：1.0 mL/min；g)温度程序：180 保持2分钟，然后以3 /min升至240，保持15分钟。；h)分流比：50：1；i)进样量:0.5 l；4.7.2 溶液配制：4.7.2.1抗氧化剂溶液配制：精密称取二丁基羟基甲苯约50.0mg至1000 mL异辛烷中，摇匀，即得。4.7.2.2内标溶液：精密称取二十三酸甲酯约700.0mg至1000mL容量瓶中，加入抗氧化溶液定容至刻度，摇匀，即得。4.7.2.3系统适应性溶液：精密称取棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯、花生酸甲酯（二十烷酸甲酯）、山嵛酸甲酯各30mg于10ml容量瓶中，用抗氧化剂溶液溶解并稀释至刻度。4.7.2.4标准溶液：精密称取二十二碳六烯酸乙基酯（DHA-乙脂）30mg至50mL容量瓶中，加入内标溶液定容至刻度，摇匀，即得DHA标准溶液。 精密称取二十碳五烯酸乙基酯（EPA-乙脂）45mg至50mL容量瓶中，加入内标溶液定容至刻度，摇匀，即得EPA标准溶液。当DHA与EPA对照品中无干扰时，标准溶液可如下配制：精密称取二十二碳六烯酸乙基酯（DHA-乙脂）30mg、二十碳五烯酸乙基酯（EPA-乙脂）45mg于50ml容量瓶中，加内标溶液定容至刻度，摇匀。4.7.2.5 样品溶液精密称取本品约0.125g，加内标溶液稀释至50.0mL，摇匀，即得。4.7.2.6 样品溶液精密称取本品约0.125g，加抗氧化剂溶液稀释至50.0mL，摇匀，即得。4.7.3 测定：4.7.3.1 仪器准备：按照气相色谱仪操作规程设定好参数，平衡后，依次将系统适应性溶液取0.5uL进样，棕榈酸甲酯，硬脂酸甲酯，花生酸甲酯，山嵛酸甲酯的面积百分比依次为：24.37%、24.84%、25.23%、25.56%，各组分峰的拖尾因子在0.8-1.5；系统适用性合格后才能进行样品分析，如不合格，及时排除异常，合格后再继续进样。4.7.3.2 依次取DHA标准溶液、EPA标准溶液、样品溶液、样品溶液，分别进2针，记录色谱图，以内标法计算DHA、EPA及总-3含量，以面积归一化法计算有关物质。4.4 计算公式：式中：DHA-乙酯或EPA-乙酯的校正因子；内标峰的峰面积；DHA-乙酯或EPA-乙酯标准品的称重，mg；DHA-乙酯或EPA-乙酯标准品的含量；标准溶液中DHA-乙酯或EPA-乙酯的峰面积；样品溶液中DHA-乙酯或EPA-乙酯的峰面积；样品的称重，mg。总欧米加-3酸乙酯含量%=式中：代表根据美国药典的相对保留时间计算供试品溶液中其他5种欧米加-3酸乙酯峰面积之和（包括C18:3 n-3，C18:4 n-3，C20：4 n-3，C21:5 n-3，C22:5 n-3）EPAee 代表EPA-乙酯的含量。DHAee 代表DHA-乙酯的含量。rEPAee 代表样品溶液中EPA-乙酯的峰面积。rDHAee 代表样品溶液中DHA-乙酯的峰面积。总杂质含量%=其中：Ai：代表所有定性杂质总和。rT：代表除溶剂峰，BHT（抗氧化剂）和内标峰外所有峰总和。4.8 胆固醇：4.8.1色谱条件：a) 色谱柱：DB-5英毛细管柱（固定相：5%二苯基-95%二甲基聚硅氧烷，30m0.25mm，0.25um）；b) 检测器：FID； c)载气：氮气；d)流速：1.3ml/min； e)柱温：170 保持1min，以4/min的升温速率升至300，保持5min。f)进样口温度：320； g)检测器温度：300；h) 进样体积：1.0uli) 进样方式：不分流进样 4.8.2 内标储备液：精密称取5-胆甾烷30mg于10ml容量瓶中，加正庚烷溶解并稀释至刻度，摇匀。4.8.3 内标标准溶液：精密量取内标储备液5ml于50ml量瓶中，加正庚烷稀释至刻度。（新鲜配制）4.8.4 标准储备液：精密称取胆固醇30mg于10ml容量瓶中，加正庚烷溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml于10ml容量瓶中，加正庚烷稀释至刻度，摇匀。（当天配制）4.8.5 标准溶液： 精密量取标准储备液与内标标准溶液各1ml至15ml离心管中，后面步骤同供试品溶液自“在约50的温和氮吹除去溶剂后”起，照供试品溶液依法操作。4.8.6 -生育酚储备液：精密称取-生育酚20mg于10ml量瓶中，加正庚烷稀释至刻度，摇匀。（冰箱中保存12个月内稳定）4.8.7系统适用性溶液： 精密量取1ml标准储备液，1ml内标储备溶液与2ml-生育酚储备液至50ml量瓶中，水浴蒸干，加乙酸乙酯稀释刻度，摇匀，精密量取1ml至10ml量瓶中，加乙酸乙酯稀释至刻度。（冰箱中保存6个月内稳定）4.8.8供试品溶液：取本品100mg，精密称定，置15ml离心管中，准确加内标标准溶液1ml。在约50的温和氮吹除去溶剂后，加50%氢氧化钾0.5ml和乙醇3ml，用氮气充满离心管，密塞。在100水浴中加热60分钟，放冷10分钟，加水6ml，振摇1分钟，分别用2.5ml乙醚振摇提取4次，每次1分钟。合并萃取液，用5ml水洗涤（轻轻倒置），弃去水层，醚层加0.5M氢氧化钾5ml，小心混匀避免乳化。弃去氢氧化钾层，另外加水5ml小心混匀。将醚层转移至离心管中。（如果发生乳化，可加入少量氯化钠助分层。）小心加热并用氮气吹除去醚层至干后，加乙酸乙酯600uL溶解残渣，混匀，精密量取上述溶液200uL至2ml量瓶中，用乙酸乙酯稀释至刻度。4.8.9测定：（1）按照气相色谱操作规程，设定好仪器参数，等待仪器平衡后。取系统适用性溶液1uL进样，-生育酚与胆固醇之间的分离度应大于1.2。取标准溶液连续进5针，以5次进样色谱图的校正因子计算RSD，应不大于10%。系统适用性试验合格后，才能进行样品分析；如不合格，及时排除异常，重新进行系统适用性试验，合格后，才能进行样品分析。（2）分别取供试液1uL进样，记录色谱图，以内标法分别计算样品中胆固醇的含量。4.8.10 计算公式：f =；胆固醇含量(mg/g) = 注: : 样品图谱中胆固醇的峰面积；: 标准溶液图谱中胆固醇的峰面积；: 图谱中胆固醇的峰面积；: 配制标准溶液胆固醇的重量，（mg）；: 样品的重量，（g）。4.9 a-生育酚：4.9.1色谱条件：a) 色谱柱：DB-1英毛细管柱（固定相： 100%二甲基聚硅氧烷，30m0.25mm，0.25um）；b) 检测器：FID； c) 载气：氮气；d) 流速：1.0ml/min； e) 柱温：265保持35min；f) 进样口温度：300； g) 检测器温度：320；h) 进样体积：1.0ul； i) 分流比：20:1；4.9.2 内标溶液：精密称取正三十二烷10mg于100ml容量瓶中，加正己烷溶解并稀释至刻度，摇匀。4.9.3标准储备溶液：精密称取-生育酚100mg于25ml量瓶中，加内标溶液稀释至刻度。4.9.4 标准溶液：精密量取标准储备液1ml至10ml量瓶中，加内标溶液稀释至刻度。4.9.5供试品溶液：取本品1000mg，精密称定，置10ml量瓶中，加内标溶液稀释至刻度，摇匀。4.9.6测定：（1）按照气相色谱操作规程，设定好仪器参数，等待仪器平衡后。取标准溶液连续进5针，以5次进样色谱图的校正因子计算RSD，应不大于10%。系统适用性试验合格后，才能进行样品分析；如不合格，及时排除异常，重新进行系统适用性试验，合格后，才能进行样品分析。（2）分别取供试液1uL进样，记录色谱图，以内标法分别计算样品中-生育酚的含量。4.9.7计算公式：f =；-生育酚(%) = 注: : 样品图谱中-生育酚的峰面积；: 标准溶液图谱中-生育酚的峰面积；: 图谱中-生育酚的峰面积；: 配制标准溶液-生育酚的重量，（mg）；: 样品的重量，（mg）。4.10 低聚物：4.10.1 色谱条件：a) 色谱柱：Mono GPC-100 7.8300mm，5um(300)，Mono GPC-100 7.8300mm，5um(100), Mono GPC-100 7.8300mm，5um(100)三根串联b) 流动相：四氢呋喃；c）检测器：示差折光检测器；d）柱温：30；e）流速：0.8ml/min；f）进样量：40ul。4.10.2系统适用性溶液：精密称取二十二碳六烯酸甘油单酯50mg，二十二碳六烯酸甘油二酯30mg，二十二碳六烯酸甘油三酯20mg于100ml量瓶中，加四氢呋喃稀释至刻度，摇匀。作为系统适用性溶液。4.10.3 供试品溶液的配制：称取样品50mg，精密称定，于10ml容量瓶中，加四氢呋喃稀释至刻度。每批样品制备1份。4.10.4 空白：四氢呋喃。4.10.5测定：（1）按照高效液相色谱仪操作规程准备仪器，平衡后，取系统适用性溶液40l注入液相色谱仪，出峰顺序为二十二碳六烯酸甘油三酯、二十二碳六烯酸甘油二酯、二十二碳六烯酸甘油单酯。二十二碳六烯酸甘油单酯与二十二碳六烯酸甘油二酯的分离度不低于2.0，二十二碳六烯酸甘油二酯与二十二碳六烯酸甘油三酯的分离度不低于1.0。（2）分别取空白溶液、供试品溶液40l注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液的色谱图中除溶剂峰与主峰以外，如显低聚物峰，其含量按面积归一化法计算。 （3）进样结束后用甲醇冲洗系统。4.10.6 计算公式： 式中： 供试品溶液中低聚物的峰面积之和；4.11 残留溶剂4.11.1色谱条件：a) 色谱柱：DB-624石英毛细管柱（固定相：6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷，30m0.53mm，3um）；b) 检测器：FID； c)载气：氮气；d)流速：3ml/min； e)柱温：50 保持3min，以20/min的升温速率升至250，保持5min。f)进样口温度：250； g)检测器温度：270；h) 分流比：50:14.11.2 顶空进样器条件：a) 炉温：85； b) 针温：105；c) 传输线温度：115； d) 平衡时间：10 min；e) 进样体积：1.0ml； 4.11.3标准溶液：以增重法精密称取正己烷0.15g（约0.22ml），乙醇2.5g（约3.1ml），于已加有少量N,N-二甲基甲酰胺的50ml容量瓶中，用N,N-二甲基甲酰胺稀释至刻度，摇匀，作为标准贮备液。精密量取1ml标准储备液至100ml容量瓶中，用N,N-二甲基甲酰胺稀释至刻度，摇匀，为标准溶液。精密量取标准溶液1ml，置20ml顶空瓶中，密封，同法制备6个。4.11.4供试液：取本品0.1g，精密称定，置20ml顶空瓶中中，准确加N,N-二甲基甲酰胺1ml，密封，每批制备2份。4.11.5空白溶液的配制：于20ml顶空进样瓶中，加N,N-二甲基甲酰胺1ml，密封。4.11.6测定：