多酚氧化酶的酶学性质及其应用研究[1].pdf

安徽农学通报 An h u i A s h S c i B u l 1 2 0 0 6 1 2 1 2 2 9 3 0 多酚氧化酶的酶学性质及其应用研究 张莉 陈乃富 皖西学院化学与生命科学系 安徽六安2 3 7 0 1 2 摘要 多酚氧化酶 P P 0 广泛分布于各种生物体中 它引起食品的褐变 严重损害食品的感官质量 本文介绍 了多 酚氧化酶催化的反应及其在酶促褐变中的作用 着重阐述 了多酚氧化酶酶学性质研 究的主要 内容和现状 简要介绍 了控 制酶促 褐变的几种常用方 法 关键词 多酚氧化酶 P P O 酶学性质 酶促褐变 褐变控制 中图分类号Q 3 1 1 文献标识码A 文章编号1 0 0 7 7 7 3 1 2 0 0 6 1 2 2 9一 O 2 S t u d y o n E n z y ma t i c C h a r a c t e r i s t i c o f P o l y p h e n o l Ox i d a s e P P O a n d i t s A p p l i c a t i o n i n C o n t r o l o f En z y m a t i c Br o wi ng Z h a n g L i C h e n N a i f u D e p a r t m e n t o f C h e m i s t r y a n d L i f e S c i e n c e We s t A n h u i U n i v e r s i t y L i u a n 2 3 7 0 1 2 c h i n a Ab s t r a c t r h e d i s t ri b u t i o n c a t a l y r e a c t i o n a n d f u n c t i o n o f e n z y ma t i o n b rowi n g o f P P O a r e r e v i e we d i n t h i s p a p e r E s p e c i Ml y p o i n t s o u t t h e ma i n r e s e a r c h c o n t e n t t h e r e c e n t p r o g r e s s o f P P O c h a r a c t e ris t i c a n d t h e a D p l i c a t i o n o f c o n t rol l i n g e n z y ma t i c b r o wi n g T h e u s i n g me t h o d o f c o n t r o l l i n g e n z y ma t i c i s s i mp l y i n t r o d u c e d t o o Ke y w o r d s P o l y p h e n o l o x i d a s e P P O E n z y ma t i c c h a r a c t e ri s t i c E n z y m a t i o n b row i n g c o n t r o l l i n g b r o w i n g 多酚氧化酶 邻一二酚 氧 氧化还原酶 E 1 1 0 3 1 是一类广泛存在的含铜金属酶类 已知多酚氧化酶 不仅广泛分布于植物 中 如蔬菜 水果 烟草 中 还存在 于微生物及 动物体 内 多酚氧化 酶 P o l y p h e n o l O x i d a s e 简称 P P O 对于果蔬加工 和保鲜 的重要性主要是涉 及到新鲜 冷冻 干制和罐藏产 品的褐变 称之为酶促褐 变 P P O引起的褐变常常是严重地损害食品的感官质 量 因此 在食品科学领域特别重视对它 的研究 近年 来人们从 生物学本身多方位地对 P P O开展了研究 虽然 至今 P P O的生理 功能还是一个谜 但是对植物 P P O的组 织和细胞定位 植物 P P O基因的克隆和表达 卜 也 都进行了深入研究 本 文主要对 P P O催 化的反应 P P O 动力学性质研究的现状及其在控 制酶促褐变中的应用作 一 介绍 l 多酚氧化酶催化的反应 多酚氧化酶以氧为受氢体 是一种末端氧化酶 它能 催化两类反应 一类是一元 酚羟基化 生成相应 的邻一二 羟基化合物 第二类是催化邻二酚氧化生成邻醌 两类反 应都需要分子氧参与 在 P P O催化邻二酚转变成邻醌 后 无需酶的催 化将 自动进一 步聚合形成褐色素或黑色 素 这就是食品发生酶促褐变 引起食品色泽发变化 的主要原因之一 水果和蔬菜中含有许多种类的酚类化合物 其 中有一 部分酚类可以作为多酶氧化酶 的底物 果蔬 中 P P O最丰 富的基质底物是邻二酚类 和一元酚类 反应最快 的是邻 羟基结构的酚类 对位二酚类也可氧化 但间二酚则不能 被氧化 甚至对多酚氧化酶还有抑制作用 邻二酚羟基的 取代衍生物也不能被 P P O所催化 如愈疮木酚 邻 甲氧基 苯酚 及阿魏酸等 2 P P O的酶学性质研究主要 内容 对 P P O的酶学性质研究主要包括 酶的分 离与纯化 酶促反应速度 的测定 影响酶促反应速度的各种 因素等 2 1 酶的分离与纯化P P O的分离一般是将生物材料加 入适宜的缓冲液进行打浆或研磨提取酶蛋 白 然后通过离 心 高速冷冻离心 分离得到粗酶液 再通过分级盐析 葡 聚糖凝胶 S e p h a d e x 层析及 D E A E纤维素离子交换层析 等方法进行纯化 可得 比活大 纯度高的 P P O酶液 以 进行若干酶学性质研究 2 2 P P O活性测定P P O活性测定从理论上讲可以测定 底物消耗速度或产物生成速度 但现在人们通常采用测定 产物生成速度 不论哪种方法测定的都应是初速度 测定产物生成速度 初速度 一般 采用分光光度法 即在一定波长下测定从醌生成 的色素的吸光度 A或 0 D 值 根据吸光度来定义酶活性 如文献 以及作者 对蕨菜多酶氧化酶 的活性测定 均是用分光光度法测 定 0 D值并进行酶活性定义 的 不过对 不同来 源的 P P O 活性测定人们所采用的波长 底物 反应时间以及具体酶 活性定义常常有一定差异 从而导致不同的人研究 的 P P O 活性往往无法进行直接比较 2 3 影响酶促 反应速度 因素 的研究 影响 P P O反应速 度 的因素主要有 p H值 不同温度 不同底物 同一底物不 同浓度 抑制剂 激活剂 等 文献 圳 以及作 者对 蕨菜 P P O 酶学性质的研究 均对这些影响酶促反应速度 的因 素进行 了研究 作者简介 张莉 1 9 7 3 一 女 安徽六安人 讲师 在读硕士 主要从事食品资源开发利用研究 收稿 日期 2 0 0 6一 l O一 2 8 维普资讯 3 0 对比牛蒡P P O 华北落叶松 P P O 蕨菜 P P O 无核 白葡萄 P P O 草霉 P P O 2 5 梨和莲藕 P P O 等主要酶 学特性发现各种不同来源的 P P O以邻苯二酚为底物 的产 物最大吸收波长都在 4 1 0 4 2 0 n m范围内 邻苯二酚 二 元酚 焦性没食子酸 三元 酚 是普遍适宜的底物 而酪 氨酸 愈创木酚等一元酚不是他们最适宜的底物 同一底 物的不同浓度对多酚氧化酶影响可用米氏方程给予描述 除牛蒡 P P O的最适温度较高为 5 O 外 其余的最适温度 皆在 2 O一 3 5 范围 各种来源的 P P O耐热性一般都较 差 通常在7 O 以上短时高温处理即可有效钝化酶的活 性 V c N a H S O L C y s E D T A对各种来源的 P P O的活 性都有抑制作用 P P o的最适 p H值在 6 0 7 4范围 大 多在 7 0 7 4范围 另外发现一定浓度蔗糖 S D S 对蕨 菜 P P O有激活作 用 但对其 他 P P O则未见有此作 用 异 V c 钠 苯甲酸钠等食 品添加剂对蕨菜 P P O表现 出一定的 抑制作用 3 P P O的酶学性质在控制酶促褐变中的应用 3 1 食品发生酶促褐变的条件食品发生酶促褐变大多 是不利的 甚至会带来严重的不 良后果 对食品中的酶 促褐变通常是要防止的 人们通过对 P P O研究发现许多 条件能影响酶促褐变的发生 必需具备的条件有三个 底 物 多酚类物质 氧和多酚氧化酶 这三个条件 缺一不 可 有些果蔬如桔子 柠檬 西瓜等 由于不含多酚氧化 酶 所以不会 发生酶促褐变 但是如前所述 P P O分布 广泛 酶促褐变也很普遍 因此控制褐变的发生条件 从而 控制 抑制褐变显得十分重要 实际操作 中从食品中除去 P P O的底物 多酚类 物质 不仅困难 而且不 现实 因此 比较有效的是抑制 P P O活性 其次是防止与氧接触 3 2 控制酶促褐变的常用方法 3 2 1 热处理法短时高温处理可使食物中所有酶活性 被钝化 P P O当然也不利外 所以短时高温处理是最广泛 使用的控制褐变方法 7 0 c c以上的短时高温即可有效钝 化 P P 0活性 作者在研究热处理法钝化苔干 P P O及蕨菜 P P O活性时发现 无论热水烫漂还是沸水蒸汽处理 或微 波处理 均能十分有效地钝化 P P O活性 7 O 以上热水 烫漂 2 5 ra i n 沸水蒸温处理 1 ra i n 微波处理 1 ra i n均能 使 P P O的 9 0 以上活性丧失 加热处理的关键是要在最 短时间内达到钝化酶的要求 否则易因加热过度而影响质 量 相反 如果热处理不彻底 热烫虽然破坏了细胞结构 但未钝化酶 则反而有助酶和底物接触而促进褐变 3 2 2 酸处理法 大多 P P 0最适 p H值在 6 0 7 4范 围 在 p H值降至 4 0以下 P P O几乎完全失去活性 因此 利用调酸降低 p H值的方法抑制果蔬褐变 是果蔬加工中 常用的方法 可采用加入适量的柠檬 酸 苹果酸 醋酸等 降低 p H值 3 2 3 加入抑制剂 如前所述 V c 异 V c钠 L C y s皆 表现出极强的抑制效果 V c 不仅可降低环境 p H值 它与 异 V c 钠既能抑制 P P O本身 的催化 作用 同时又能还 原 P P O形成的产物醌为酚 并且还能消耗反应体系中的氧 而 L C y s 既能与醌形成无色的聚合物 又是醌的还原剂 还原醌为酚 另外 E D T A可与酶分子 中 c u 络合抑制酶 活性 甚至饱和 N a C 1 也能显著抑制酶活性 因此 适量加入这些抑制剂来抑制 P P O活性是控制酶促褐变 的 有效途径之一 3 2 4 S O 及亚硫酸盐处理s 0 及亚硫酸盐是集防腐 漂白 抗氧化三者于一身的物质 在食品工业中常做漂 白 剂使用 但 也是 P P O的强抑制剂 在蘑菇 水果等加工 中常用作护色剂 S O 防止褐变 的机理一般认 为一方 面是 S 0 抑制多 酚氧化酶的活性 并把醌还原为酚 另一方面与羰基加成 而防止了羰基化合物的进一步聚合 S O 处理的优点是 使用方便 效力可靠 成本低 残 留 s 0 易于通过抽真空 炊煮除去 不足之处是残留会腐蚀铁包装 容器 有令人不 舒服的嗅感与味感 残留过高还会危 害人体健康 因此 S O 及亚硫酸盐必需是在安全合理的范围内使用 3 2 5 驱除氧气或隔绝氧气法将去皮切开的的水果 蔬菜用清水 盐水 糖水浸泡 以达到除氧或隔绝氧气的 目 的 食 品真空包装也是除氧的有效途径 另外 从理论上讲将食品中酚类改性 使得 P P O不再 催化其变化可有效防止褐变 也可在食品中加人P P O底 物类似物来竞争性地抑制多酚氧化酶活性 从而控制酶促 褐变 但这在实际应用上存在一定局限性 故不是控制食 品褐变的常用方法 参考文献 1 黄明 彭世清 植物多氧化酶研究进展 J 广西师范大学学报 自然科学版 1 9 9 8 1 6 2 6 5 7 0 2 王璋编 食品酶学 M 北京 轻工业出版社 1 9 9 2 2 5 4 2 7 8 3 宁正祥 赵谋明编著 食品生物化学 M 广州 华南理工大学 出版社 1 9 9 5 2 9 8 3 0 1 4 雷东峰 冯怡 梅建生 烟草中多酚氧化酶 P P O 的特征 J 西 北植物学报 2 0 0 4 2 4 1 1 6 1 1 6 6 5 郑校先 戚晓玉 周培根等 乌贼墨中多酚氧化酶的分离与纯化 J 上海水产大学学报 2 0 0 1 1 0 2 1 5 4 1 5 7 6 夏栋 卞疆 龙虾多酚氧化酶的纯化及其部分生化特性 J 江苏 食品与发酵 2 0 0 0 1 l 6 1 9 7 C z a n i n s k i Y C a t e s s o n A M P o l y p h e n o l o x i d a s e s P l a n t s I n H a y a t M A e d E l e c ti o n M i c r o s c o p y o f E n z y m e s M N e w Y o r k Va n N o s t r a n d Re i n h o l d 1 9 7 4 6 6 7 8 8 V ang h n K C D u k e S O T e n t o x i n i n d u c e d l o s s o f p l a s t i d i c p o l y p h e n o l o x i d a s e J P l a n t 1 9 8 1 5 3 4 2 1 4 2 8 9 V a u g h n K C D u k e S O T i s s u e l o c a l i z a t i o n o f P P O i n S o u g h u m J Pmt o p l a s ma 1 9 8 1 1 0 8 3 1 9 3 2 7 1 O V a u g h n K c L a x A R D u k e S O P o l y p h e n o l o x i d a s e t h e c h l o r o p l a s t o x i d a s e w i t h n o e s t a b l i s h e d f u n c t io n J P h y s i o l P l a n t 1 9 8 8 7 2 65 9 6 6 5 1 1 1 S h ea r T H e n n i n g N G u t fi n g e r T e t 丑 1 T h e t o m a t o 6 6 3一k D p o l y p h e n o l o x i d a s e g e n e mo l e c u l a r i d e n t i f i c a t i o n a n d d e v e l o p me n t a l e x p r e s s io n J P l a n t C e l l 1 9 9 2 4 1 3 5 1 4 7 1 2 C a r l J W L a x A R r l u r k y WH c l 0 n m g a n d 下转 3 4页 维普资讯 3 4 出 1 1 1 个位 点 其 中多 态 性位 点 数 1 0 4个 占总 数 的 9 4 图1 2 4 个针叶树上的散斑壳属菌株的 R A P D扩增图谱 注 M代表 D N A M a r k e r D 2 0 0 0 从上往下分别是 2 0 0 0 b p 1 O 0 0 b p 7 5 0 b p 5 0 0 b p 2 5 0 b p l O O b p 1 4分别是引物S 3 3 S 1 0 4 2 9 8 4 1 3 1 2 4分别为针叶树生散斑壳属 2 4个菌株 见表1 由此可见 针叶树上 的散斑壳属部分种 内及种 间具 有丰富的遗传多样性 对所有菌株进行分析 得到的聚类 结果如图2 所示 图2 针叶树生上的2 4 株散斑壳菌株的 R A P D聚类图 从图 2 可以看出 针叶树上的散斑壳属各分离株之间 遗传距离变异范围在 1 9 8 4 8 7之 间 这表明此属各菌 株间遗传变异较大 在遗传距离 4 5 6处 将针叶树上 的 散斑壳属 2 4 个分离株分成 A B C D 4个类群 在 遗传 距离 4 5 6水平 同种的Lp i n a s t r i 包括 1 2 3 4 5 1 3 1 4 1 5 1 6 这9个菌株能很好的聚为一类 L p i n i e x c e l 包 括 2 1 1 7 1 8 1 9 4 个 菌株和 L p i n i b u n g e a n a e 包括 2 4 1 0 2 个菌株聚为一类 L c o n i g e l z u m 包括 1 1 9 1 2 这 3 个 菌株和 L k u m a u n i c u m 包括 7 8 6 这 3 个 菌株聚为一 类 L p e t r a k i i 包括 2 2 2 3 2 o 这 3个菌株能很好的聚为 一 类 这说 明 L c o n i g e n u m和 L k u m a u n i c u m遗传距离较 近 Lp i n i e x c e 1 和 Lp i n i b u n g e a n遗 传距 离较近 而 在 4 7 5 水平 A B C 3类群聚为 1 类 这说明这 3类间的 遗传距离较近 结果表明聚类结果与菌株形态学特征具有一定 的相 关性 9个形 态 学相 同的 Lp i n a s t r i 菌 株被优 先 聚类 L p i n i e x c e l s e a和 L p i n i b u n g e a n a e均 具小 型 的子 囊 果 并具黑 色细线 纹 稀少 被 聚为 一类 L c o n i g e n M m 和 L k u m a u n l c u m被聚为一类 其子囊果均具有部分 表皮下 生的特点 4个杉木生同一菌种 L p e t r a k i i 能很好 的聚为 一 类 A B C 3 类群的寄主均为松类 D类群的寄主为 衫木 因此 D类型与其它 3 类型关系较为疏远 这也证 明了寄主种类特 征在针 叶树 上散斑壳 菌分类 中的重要 性 参考文献 1 黄博 一些重要虫生菌的分子系统学研究 合肥 中国科学技 术大学 2 0 0 1 2 张维铭 现代分子生物学实验手册 北京 科学出版社 2 0 0 3 2 4 4 2 9 6 3 李娟 中国茶树核心种质的初步构建及其 R A P D分析 合肥 安徽农业大学 2 0 0 4 4 汪小全等 R A P D应用于遗传多样性和系统学研究中的问题 植物学报 1 9 9 6 3 8 1 2 9 5 4 9 6 2 5 林英任 松属植物上散斑壳菌鉴定的几个问题 安徽农学院学 报 1 9 8 8 1 5 3 5 9 6 4 6 M i n t e r D W L o p h o d e m i u m o n p i n e s M y c o 1 P a p 1 9 8 1 1 4 7 1 5 4 责编 张杨林 上接 3 0页 c h a r a c t e r i z a t io n o f c D N A c o d i n g f o r V i c i a f a b a p o l y p h e n o l o x i d a s e J P l a n t M o l B i o l 1 9 9 2 0 0 2 4 5 2 5 3 1 3 H u n t D M E a n n e t t a N T Y u H e t a 1 c D N A c l o n i n g a n d e x p r e s s i o n o f p o t a t o p o l y p h e n o l o x i d a s e J P l a n t M o l B i o l 1 9 9 3 2 1 5 9 6 8 1 4 B o s s P K G a r d n e r R C J a n s s e n B J e t a 1 An a p p l e p dy p h e n d o x i d a s e c D N A i s u p r e g u l a t e d i n w o u n d e d t i s s u e s J P l a n t M o l B i o l 1 9 9 5 2 7 42 9 4 3 3 1 5 赵光远 王璋 许时婴 浑浊苹果汁加工中苹果 P P O热失活条 件的研究 J 食品科技 2 0 0 3 7 8 4 8 7 1 6 毕阳 欧