高敏乙肝病毒检测临床意义

高敏HBV检测临床意义及产品考评工作汇报,珀金埃尔默医学诊断孙祥杰 电话Our mission 愿景.,.for a healthier today and an even better tomorrow,Dedicated to improving the health and safety of people and the environment致力于改善人类的健康和促进我们生活环境的安全,国际治疗路线,HBV优化治疗路线图策略,* 由美国坦福大学医学中心Keeffe教授（专家组）提供,各指南推荐的治疗终点,美肝会指南,2008年美国肝病协会CHB防治指南：持久消除HBV是乙肝的治疗终点，HBV DNA病毒载量尽可能小于或等于10 IU/ ml。,欧洲肝病研究学会EASL2010年指南指出：将HBV DNA病毒载量尽可能控制在10-15 IU/ ml，能有效防止疾病的复发。,欧肝会指南,乙型肝炎病毒定量检测试剂注册申报技术指导原则,乙型肝炎病毒（HBV）DNA定量检测试剂注册申报技术指导原则,行业标准,专家意见,庄辉、鲁凤民等，慢性乙型肝炎病毒DNA定量检测的临床意义2012年,临床一线对超灵敏检测试剂需求旺盛,传统定量产品满足不了临床需求,临床用核酸提取试剂,乙肝定量kit48测试/盒国食药监械（准）字2013第3402077号2013年11月,丙肝定量kit24测试/盒国食药监械（准）字2011第3400554号2011年5月,核酸提取kit32测试/盒沪青械备20140045号2014年12月,高灵敏：HBV 检测下限：20 IU/ml (2013年11月已拿到新证)HCV 检测下限：15 IU/ml (预计16年3月拿到新证),国家CFDA技术审评中心HBV DNA/HCV RNA 定量试剂技术审评指导原则中指出： HBV DNA最低检测限应 30IU/ml HCV RNA最低检测限应 50IU/ml,PKI临床高敏定量检测产品,HBV产品性能,高敏乙肝试剂对比试验开展单位,北京大学医学部上海仁济医院湖北省人民医院上海第三人民医院温州医科大附属第一医院东营胜利油田中心医院昆明医学院第一附属医院沧州传染病医院中山大学附属第一医院北京三零二医院,高敏乙肝试剂对比试验开展单位,浙江PCR培训班现场评价重庆PCR培训班现场评价广州PCR培训班现场评价烟台PCR培训班现场评价,一、北大医学部,临床血清盘评价,线性范围评价,Day 1:,Genotype A Panel: WHO HBV Standard（NIBSC code: 10/264）稀释均采用HBV 阴性人EDTA抗凝血浆：HBsAg negative and anti-HBcAb negative,Day 2 & 3: repeat the above testing pattern,1. WHO 标准血清盘可溯源性检测方案,该HBV定量试剂具有良好的溯源性,PKI HBV定量试剂对WHO标准品溯源性检测结果,灵敏度 WHO标准品（A亚型）,Day 1:,Genotype B:卫生部临床检验中心（GBW09150）Genotype C:中国药品生物制品检定研究院Genotype D: SeraCare公司（ WWHD301-10 ）,Day 2 & 3: repeat the above testing pattern,2. HBV B/C/D亚型的重复性比较方案,PKI HBV定量试剂对HBV B/C/D亚型标准血浆检测精密度评价,该HBV定量试剂具有良好的重复性,重复性 临检中心标准品（B亚型）,3. 线性范围评价方案,改良Doumas法,该试剂的线性范围可达到（201E+09）IU/ml,线性范围分析,改良Doumas法,线性范围图,4. 临床血清盘评价,双盲法对比测试84例临床样本符合率100%其中2例样本低于两种检测试剂的检测下限20 IU/ml，两种试剂均可检出。Deming regression（图）分析结果显示：两中试剂的相关性较好（r=0.968，p0.0001）；二者关系为PKI=0.340+0.975*Roche；,Correlation with Roche,该HBV定量检测试剂在溯源性、精密度及线性范围方面均有良好表现，临床样本检测与进口试剂具有良好的相关性。,试剂考评结论,二、上海仁济医院,Genotype A Panel: WHO HBV Standard（NIBSC code: 10/264）稀释均采用HBV 阴性人EDTA抗凝血浆：HBsAg negative and anti-HBcAb negative,1. WHO 标准品准确度检测方案,该HBV定量试剂具有良好的溯源性和准确度,PKI HBV定量试剂准确度检测结果,Day 2 & 3 & 4: repeat the above testing pattern,2. 重复性比较方案,Day 1: 直接测试16次,批内重复性检测结果,该HBV定量试剂具有良好的重复性,(Coefficient of Variance),批间重复性检测结果,该HBV定量试剂具有良好的重复性,3. 线性范围评价方案,改良Doumas法,该试剂的线性范围可达到（201E+09）IU/ml,线性范围分析,Correlate,4. 临床样本评价方案,8次方浓度样本8个,PKI,3次方浓度样本8个,7次方浓度样本8个,2次方浓度样本8个,6次方浓度样本8个,5次方浓度样本8个,4次方浓度样本8个,1次方浓度样本8个,Roche,对比,临床对比结果,临床对比结果,5. 检测限评价方案,Genotype A Panel: WHO HBV Standard（NIBSC code: 10/264）稀释均采用HBV 阴性人EDTA抗凝血浆：HBsAg negative and anti-HBcAb negative,Repeat 3,Repeat 4,检测限结果,三、湖北省人民全血测评结果 on Chemagic 360,相对于过柱法提取，磁珠方法提取全血有更高的得率,湖北省人民全血测评结果 on Chemagic 360,将全血原倍样本重复提取3次测试，并稀释5倍、10倍测试，结果表明磁珠方法提取全血具有更好的重复性、梯度关系,湖北省人民全血测评结果 on Chemagic 360,四、北京302医院精密度,四、北京302医院临床样本对比,四、北京302医院棋盘交叉污染测评,Unbeatable Solution,Magnet offRotation on,Magnet on,Magnetic Beads based on (PVA), 1 m,chemagic Separation Technology,BloodSaliva / SwabsPlasma(Pathogens),Standard Kits for:,Pre-NAT技术特点-3,转移磁珠而不采用转移液体的方式进行核酸提取，可以有效的减少气溶胶的产生几率，具有良好的防污染效果，而且可以极大的减少样本处理时间。,用旋转磁棒的方式进行液体搅拌，从而确保磁珠完全重悬并释放杂质。能够避免磁棒振动模式混匀、或者吹吸混匀的气溶胶产生的风险。通过电磁铁控制磁场，磁珠被转移到下一个提取组分中，无需转移液体。,防污染措施,1. 紫外灯消毒，有效防止交叉污染。2. 磁棒旋转式混匀，液面上升幅度小，可防止液体喷溅。3. 转移磁珠的方法，减少了液体/气溶胶暴露的机会，从而减少污染。4. 废弃枪头处理方式：直接打到专用垃圾袋，防止含病原体的枪头污染台面。5. 每次实验后进行仪器清洁：75%酒精擦拭台面。6. 使用滤芯枪头。7. MSM1排风口引到pre-NAT外部，防止气流回流造成污染。8. 设有移液回吸动作，防止阳性样本滴出造成污染。,表1 相对符合率分析,五、与国内煮沸法HBV 低于500 IU/ml 样本结果测评分析,简要分析：国产试剂HBV PCR试剂500IU/ml的样本50例，均报告阴性结果;使用Perkinelmer HBV PCR试剂只检出3例阴性，其余47例均有检测结果；20IU/ml浓度以上假阴性率达到64%以上，且个别结果达到E4 E5高浓度样本漏检；,可见普通煮沸法HBV 定量试剂临床漏检率特别高，给临床诊治带来错误的诊断治疗依据。,表2 相对符合率分析,与一步法 HBV PCR试剂 样本结果测评对比分析-1,一步法 HBV PCR试剂对比情况分析： PE与一步法平行对比HBV样本，总计286例；一步法定量下限500IU/ml，即有156个样本报阴性或无结果，PE定量下限20IU/ml，总计64个样本不报结果。实际有92个弱阳性标本被漏报，占总检测数量的32.17%，风险相当大；,国产：曲线平台期不明显，扩增效率低 重复性一般。,PE：曲线呈典型S曲线，扩增效率高 重复性非常好,一步法 HBV PCR试剂对比情况分析：两例样本结果两种试剂差异较大，复测；一步法HBV试剂检测准确性差，因杂质未去除，试剂抗干扰能力差，重复性差，不稳定。PE HBV 高敏试剂抗干扰能力强，稳定，重复性好。,与一步法 HBV PCR试剂 样本结果测评对比分析-2,超灵敏的PCR（即高效率）需要的各种条件较高:,(1+x)n=AF ，109 PCR产物分子,高灵敏的关键要素,PerkinElmer 全自动核酸检测反应体系构建系统-Pre-NAT,仪器型号：Pre-NAT条码扫描：原始管上机，条码扫描读取仪器大小：2300mm x 810mm x 950mm样本通量：196个样本处理体积： 最大1.2ml液体加样范围：5ul800ul处理时间：2小时完成96个样本的PCR体系构建加样器：4通道磁场控制：电磁铁提取方法：磁珠法-转移磁珠,Pre-NAT 工作流程,Pre-NAT 工作站核酸提取、扩增前PCR反应体系构建等过程无需人工操作将您从繁琐的操作中解放出来,Walk away,Pre-NAT 四大模块,Pre-NAT 操作界面,客户操作流程-全自动核酸提取工作站,启动客户端软件,点击开始按钮运行仪器,Pre-NAT完成试剂分装、样本提取、PCR反应液准备,根据软件提示完成1. 选择所需程序2. 摆放所需耗材及试剂3. 扫码工作,PCR扩增,约 510 min,约120min,约90min,人工操作,Walk away,Accusense（精确液面感应）技术,可以感应电离液和非电离液（如DMSO/甲醇等）。可以设置高，中，低等感应灵敏度。可探测的最小体积试管中100L微孔板中50L,每个通道取样头均具有液面感应功能，可独立探测液面并在Z轴方向独立运动，保证可同时操作具不同液面高度的离心管，减少一次性吸头外壁的吸附，精确移液。,Pre-NAT技术特点-2,JANUS 4道移液臂（Varispan Arm）：Varispan（移液头间距调整）技术,自动调节Tip头间的间距： 9 -20 mm (4 通道) 9 -40 mm (8 通道),Pre-NAT其他技术特点,Pre-NAT其他技术特点,模块化设计,模块化设计，通过智能计算模块位置