基本技术学时

第一章 基本技术,1实验室设置,2 基本技术,3 培养基及其配制,4 外植体接种培养,第一篇 植物细胞工程,细胞工程,1.1 实 验 室 设 置,实验室设置的基本原则 科学、高效、经济、使用满足3个基本需要实验准备无菌操作 控制培养,细胞工程-植物细胞工程,实验室组成,基本设备配置,培养容器与用具,细胞工程-植物细胞工程,1.1 实 验 室 设 置,细胞工程实验室的基本要求,实验室布局示意图,细胞工程-植物细胞工程,1.1 实 验 室 设 置,基本实验室准备室 准备室的功能就是进行一切与实验有关的准备工作。要求宽敞明亮，通风条件好。接种室 接种室的功能是进行无菌操作。要求封闭性好，干燥清洁，能较长时间保持无菌。为了保持清洁，接种室应防止空气对流。培养室 培养室的功能是对离体材料进行控制培养。其首要要求是要能控制光照和温度，其次为防止微生物感染，培养室应保持干燥和清洁。,细胞工程-植物细胞工程,1.1 实 验 室 设 置,辅助实验室实验室 其功能是对培养材料进行细胞学鉴定和研究。要求清洁、明亮、干燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。摄影室及暗室 其功能是进行培养材料的摄影记录和胶片冲印。在有条件的情况下可建立此实验室。生化分析室 在以培养细胞产物为主要目的的实验室中，应建立相应的分析化验实验室，以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查。,细胞工程-植物细胞工程,1.1 实 验 室 设 置,基本设备配置,基本设备,灭菌设备,光照培养室与设备,无菌操作设备,细胞学鉴定设备,细胞工程-植物细胞工程,1.1 实 验 室 设 置,天平 ，冰箱 ，酸度计 ，纯水器,细胞工程-植物细胞工程,1.1 实 验 室 设 置,基本设备配置,活性成分过滤灭菌,接种工具随时消毒,培养基灭菌,玻璃器皿灭菌,细胞工程-植物细胞工程,1.1 实 验 室 设 置,基本设备配置,细胞工程-植物细胞工程,1.1 实 验 室 设 置,基本设备配置,细胞工程-植物细胞工程,1.1 实 验 室 设 置,基本设备配置,倒置显微镜,研究显微镜,激光共聚焦,显微操作仪,细胞工程-植物细胞工程,1.1 实 验 室 设 置,基本设备配置,培养容器与用具玻璃容器塑料容器金属用具塑料用具,细胞工程-植物细胞工程,1.1 实 验 室 设 置,基本设备配置,洗涤技术,灭菌技术,培养技术,细胞工程-植物细胞工程,1.2 操作基本技术,洗涤剂,合成洗涤剂,铬酸洗涤液,细胞工程-植物细胞工程,1.2 操作基本技术,常用的铬酸洗涤液配方,细胞工程-植物细胞工程,1.2 操作基本技术,洗涤剂,洗涤剂玻璃器皿洗涤：新的玻璃器皿（1%盐酸浸泡一昼夜、合成洗涤剂洗刷，清水反复冲洗，蒸馏水冲洗1-2次，干燥）；已使用过的试管、烧杯、三角瓶；吸管、滴管等内径狭小的玻璃制品（先放入铬酸洗涤液中浸泡2小时以上，取出后流水冲洗半小时，蒸馏水冲洗1-2次，干燥）。塑料用品洗涤：一般用合成洗涤剂洗涤，因其附着力较强，因此冲洗时必须反复多次，最后用蒸馏水冲洗。 金属用品洗涤：金属用品一般不宜用各种洗涤液洗涤，需要清洗时，一般用酒精擦洗，然后火焰干燥。,细胞工程-植物细胞工程,1.2 操作基本技术,灭菌技术:培养基：湿热灭菌（高压高温蒸汽灭菌），过滤除菌。玻璃器皿：湿热灭菌或干热灭菌，即在烘箱中加热至160-18040分钟，或1202小时。金属器皿：干热灭菌。接种室：接种室常采用定期熏蒸，熏蒸剂常用甲醛加高锰酸钾，一般每100ml甲醛加5g高锰酸钾为一个使用单位，一般每20平方米的范围内放置1个单位剂量。熏蒸期间应该封闭3-5天。,细胞工程-植物细胞工程,1.2 操作基本技术,培养基体积与灭菌时间的关系,细胞工程-植物细胞工程,1.2 操作基本技术,灭菌技术:,培养技术-植物细胞和组织: 从健康植株的特定部位或组织，如根、茎、叶、花、果实、胚珠、花药和花粉等，选择用于组织培养的起始材料，称之为外植体。 用一定的化学药剂，最常用的有次氯酸钠，升汞和酒精等对外植体表面消毒，建立无菌培养体系。严格控制无菌条件，这是获得培养成功的重要一步。 外植体块在培养基上形成疏松的愈伤组织，由愈伤组织分化出芽并可诱导形成根的小植株。,细胞工程-植物细胞工程,1.2 操作基本技术,培养技术-动物细胞和组织,细胞工程-植物细胞工程,1.2 操作基本技术,培养技术-细胞融合技术（体细胞杂交技术）,细胞工程-植物细胞工程,1.2 操作基本技术,培养技术-细胞器移植技术,277次乳腺细胞核移植实验；获得29个发育为8细胞的“胚”；13头代孕母亲；1996年7月5日，羊羔6LL3，被命名为“多莉”。,细胞工程-植物细胞工程,1.2 操作基本技术,培养技术-预想的克隆人技术路线,细胞工程-植物细胞工程,1.2 操作基本技术,培养技术染色体工程技术 染色体工程是按人们的需要来添加、削减或替换生物的染色体的一种技术。主要分为动物染色体工程和植物染色体工程。,细胞工程-植物细胞工程,1.2 操作基本技术,培养技术胚胎工程技术体外受精胚胎移植技术胚胎分割技术,细胞工程-植物细胞工程,1.2 操作基本技术,培养基基本成分培养基配方培养基配制,细胞工程-植物细胞工程,1.3 培养基及其配制,培养基基本成分,水,大量元素,微量元素,激素,其它,有机成分,无机盐,细胞工程-植物细胞工程,1.3 培养基及其配制,培养基基本成分-无机盐类,大量元素：使用量一般大于0.5mmol/L。大量元素包 括C、H、O、N、P, K、Ca、Mg、S。氮、硫、磷是蛋白质、氨基酸、核酸和酶的主要成分。微量元素：用量一般低于0.5mmol/L。植物所需的微量元素有Fe、Cu、Zn、B、 Mo、Mn、Co。对于蛋白或酶的生物活性十分重要，并参与生物过程的调节。,0 1/10,2 1,MS,细胞工程-植物细胞工程,1.3 培养基及其配制,培养基基本成分有机成分糖：不可缺少的碳源；维持培养基的渗透压。最常用的碳源是蔗糖。一般试管苗生长与繁殖常使用 的蔗糖浓度，但在大多数植物的幼胚培养中蔗糖浓度可使用到 。某些特殊培养中，蔗糖浓度甚至可提高到 。葡萄糖和果糖也是较好的碳源。麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在组织培养中也有应用。,蔗糖浓度分别为0、1%、5%,细胞工程-植物细胞工程,1.3 培养基及其配制,培养基基本成分有机成分氨基酸：是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。培养基中最常用的氨基酸是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。通常采用蛋白质水解产物（包括酪蛋白水解物）、谷氨酰胺或氨基酸混合物。,细胞工程-植物细胞工程,1.3 培养基及其配制,培养基基本成分有机成分维生素：以各种辅酶的形式参与多种代谢活动，对生长、分化等有很好的促进作用。虽然大多数的植物细胞在培养中都能合成所必需的维生素，但在数量上不足，通常需加入一至数种维生素。常用的维生素包括：VB1、VB6、Vc、有时还使用生物素、叶酸、VB12等。VB1对愈伤组织的产生和生活力有重要作用，VB6能促进根的生长。Vc有防止组织变褐的作用。,细胞工程-植物细胞工程,1.3 培养基及其配制,培养基基本成分有机成分肌醇：本身没有促进生长作用，但在糖类的相互转化、维生素和激素的利用等方面具有重要的作用；因而能促进培养物快速生长；能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成。对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用，对细胞壁的形成也有作用。腺嘌呤：合成细胞分裂素的前体物质之一。添加腺嘌呤能促进细胞合成分裂素，有利于细胞的分裂和分化，促进芽的形成其它：天然提取物，如酵母提取物，番茄汁。,细胞工程-植物细胞工程,1.3 培养基及其配制,培养基基本成分植物激素植物激素(Phytohormone)：是植物自然状态下产生的、对生长发育有显著作用的微量有机物。能影响生长和分化。在个体发育中，不论是种子发芽、营养生长、繁殖器官形成以至整个成熟过程，主要由激素控制。植物体内的激素与细胞内某种称为激素受体的蛋白质结合后，影响DNA、RNA和蛋白质的合成，并对特殊酶的合成起调控作用，从而表现出调节代谢的功能。,细胞工程-植物细胞工程,1.3 培养基及其配制,培养基基本成分生长素(auxin)生长素是由色氨酸通过一系列中间产物形成的。离体培养中，生长素的主要生理作用是促进细胞分裂和生长，有利于外植体脱分化并启动细胞分裂，有利于形成愈伤组织。在离体培养的分化调节中，生长素促进不定根的形成而抑制不定芽的发生。在液体培养中，生长素还有利于体细胞胚胎发生。 常用的生长素有：吲哚乙酸（IAA）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）等。IAA活力较弱。NAA起动能力要比IAA高出3-4倍。IBA是促进发根能力较强的生长调节物质。NAA和IBA广泛用于生根，并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长。2，4-D起动能力比IAA高10倍，特别在促进愈伤组织的形成上活力最高，但它强烈抑制芽的形成。,细胞工程-植物细胞工程,1.3 培养基及其配制,培养基基本成分细胞分裂素（Cytokinin）细胞分裂素大多是嘌呤族衍生物，自然状态下分裂素主要在根中形成，茎端、萌发中的种子、发育中的果实和种子也能合成分裂素。生理作用主要是诱导芽的分化促进侧芽萌发生长、促进细胞分裂与扩大。多用于诱导不定芽的分化和茎、苗的增殖，而在生根培养时使用较少或用量较低。主要有激动素（KT）、6-苄基腺嘌呤（BA）和玉米素（ZT）等。其中最常用的是6-苄基腺嘌呤。其中ZT活性最强，但昂贵，常用的是6-BA。,细胞工程-植物细胞工程,1.3 培养基及其配制,培养基基本成分赤霉素类一类广泛存在于植物体内的激素，目前已发现的天然赤霉素有多种。自然植物体内的赤霉素具有促进细胞伸长生长、诱导花芽形成、打破种子休眠以及诱导单性结实等生理功能。商品生产的赤霉素多为赤霉酸（， ）。在离体培养条件下，赤霉素的主要作用是促进细胞的伸长生长，与生长素协调作用对形成层的分化具有一定影响，同时还能刺激体细胞胚进一步发育成植株。,细胞工程-植物细胞工程,1.3 培养基及其配制,培养基基本成分激素配比生长素/细胞分裂素： 高：有利于根的形成和愈伤组织的形成 适中：有利于根芽的分化 低：有利于芽的形成1956年，米勒（Miller）与斯库格（Skoog）一起提出了植物激素控制器官形成的观点,细胞工程-植物细胞工程,1.3 培养基及其配制,生长素：促进细胞分裂和生长，有利于外植体脱分化并启动细胞分裂，有利于形成愈伤组织,细胞分裂素：促进细胞分裂，调节器官分化，延迟组织衰老，增强蛋白质合成等。,BA(6-苄基腺嘌呤)分别为每升0、0.1、5.0mg,NAA(奈乙酸)分别为每升0、0.1、5.0mg,0,0.1,5.0,细胞工程-植物细胞工程,1.3 培养基及其配制,培养基基本成分激素配比,培养基基本成分水离体培养中，水既是培养基营养成分的溶剂，又是培养基的重要组成部分，它占培养基成分的95。根据培养类型及其研究层次不同，可选择使用不同处理级别的水。如原生质体培养、细胞培养以及分生组织培养一般应使用双蒸水或超纯水，以免水中残留的离子造成培养基成分的变化而影响培养效果。如果是大批量的快速繁殖培养，则可使用一般蒸馏水或纯净水以降低生产成本，提高生产效益。实验室存放各类试验用水的容器应使用塑料制品，不能使用金属容器。存放容器应定期清洗，避免青苔和微生物滋生。玻璃容器亦不适于存放蒸馏水或纯净水，因为良好的透光性常常极易使青苔生长。,细胞工程-植物细胞工程,1.3 培养基及其配制,培养基基本成分其它附加成分琼脂：一种来自海藻的多糖类物质，是组织培养中最常用的培养基凝固剂，常用浓度0.6-1.0%。活性炭：吸附剂，吸附有毒物质，常用浓度0.5%。,细胞工程-植物细胞工程,1.3 培养基及其配制,常用培养基配方,富盐平衡培养基： 是目前使用最广泛的一类，代表性的培养基有MS（Murashing and Skoog, 1962）培养基，LS培养基，BL培养基，BM培养基，ER培养基 特点:无机盐浓度高，微量元素种类齐全，浓度高；元 素间比例适当，离子平衡性好，具有较强的缓冲性，稳定性好；营养丰富，一般培养时无需再加入有机成分。,细胞工程-植物细胞工程,1.3 培养基及其配制,尽管植物生长所必需的营养物质具有高度的一致性，但不同类型的植物对这些营养成分需求的量则有较大差异。离体培养中，由于外植体不同，因而对营养成分的需求亦不同。,常用培养基配方,中盐培养基： 大多是在MS培养基基础上进行改良设计。 Nitsch (Nitsch and Nitch, 1969)培养基，H培养基，Miller培养基，Blaydes培养基 特点：大量元素无机盐约为MS的一半，微量元素种类减少，而含量增高，维生素种类比MS多，如增加了生物素、叶酸等。,细胞工程-植物细胞工程,1.3 培养基及其配制,常用培养基配方,低盐培养基：如White（White, 1934）培养基，WS培养基，HE培养基，HB培养基； 特点：无机盐含量低，有机成分含量相对也很低。多用作生根培养基。高硝态氮培养基： B5 (Gambor et al, 1968)培养基，N6 (朱至青，1974)培养基，SH培养基； 特点：硝酸钾含量高，氨态氮的含量低，含有较高的VB1。适合一些要求较高氮素营养，同时氨态氮对其生长又有抑制作用的植物培养。,细胞工程-植物细胞工程,1.3 培养基及其配制,培养基配制:大量元素配制成10-20 的母液；微量元素配制成100-200 的母液；激素单独配制成mg/ml的母液；培养时培养基根据需要按比例加入。,细胞工程-植物细胞工程,1.3 培养基及其配制,细胞工程-植物细胞工程,1.3 培养基及其配制,培养基配制:植物激素使用的浓度很低，因此，一般分别配制成浓度的溶液。由于植物激素多不溶于水，另外有些激素在水溶液中不稳定，因此，应根据激素性质确定适宜的母液配制方法。常用激素的配制方法如下。 ：先用少量乙醇使充分溶解，再加蒸馏水定容至需要浓度的体积。 ：可溶于热水中，也可采用与同样的方法配制。 ，：先用少量的 溶液充分溶解，然后，缓慢加入蒸馏水定容至需要浓度体积。 细胞分裂素类：和等细胞分裂素类物质均溶于稀盐酸，应先用少量的溶解后再用蒸馏水稀释至需要的浓度。 赤霉素：赤霉素的水溶液稳定性较差，一般用的乙醇配制成的母液低温保存，使用时再稀释。,培养基配制: 培养时培养基根据需要按比例加入：首先按大量元素、微量元素、铵盐及有机成分的顺序，依次吸取各母液的需要量于烧杯中，再加入终体积2/3-3/4的蒸馏水混匀，然后加入蔗糖溶解，用1mol/L NaOH或HCl调整pH5.8-6.0，再按照0.6-0.8%的比例加入琼脂，并搅拌加热，使琼脂完全熔化，用蒸馏水定容，混合均匀后分装到培养容器中。 固态培养基、液态培养基（支撑物，以试管为培养容器的可使用滤纸桥、底面积较大的培养容器，可选用脱脂棉以及某些性质稳定的无毒高分子材料等）。 培养基制备分装后，应该及时灭菌。,细胞工程-植物细胞工程,1.3 培养基及其配制,植物离体培养类型:组织培养器官培养细胞培养原生质体培养,细胞工程-植物细胞工程,1.4 外植体接种培养,植物材料的培养与外植体选取 外植体灭菌 接种培养及培养条件的控制,细胞工程-植物细胞工程,1.4 外植体接种培养,外植体的来源外植体（explant）是指用于离体培养的活的植物组织、器官等材料。用于外植体分离的母体植物材料一般有三种来源： 一是生长在自然环境下的植物（一般带有微生物，经过灭菌处理）；二是有目的地培育在温室控制环境条件下生长的植物；三是无菌环境下已经过离体培养的植物。,细胞工程-植物细胞工程,1.4 外植体接种培养,供体植株的管理 a. 避免昆虫为害：因为许多昆虫如蚜虫、螨类和飞虱等是许多植物病害的传播媒介，会引起植物组织的潜在感染；b. 注意防病：尤其是防止真菌和细菌病害的侵染；c. 正确浇水：给供体植株浇水时应从根部给水，避免从上部浇水，以免植株上部形成易于病原侵染的湿度环境；d. 控制环境湿度。e. 取材前应尽可能保持供体植株干爽。,细胞工程-植物细胞工程,1.4 外植体接种培养,外植体取材：a. 根据培养需求选择植物部位b. 多年生植物注意树龄和季节c. 在不影响培养目的的前提下尽可能选择自然繁殖器官作外植体,细胞工程-植物细胞工程,1.4 外植体接种培养,外 植 体 灭 菌,不同外植体在灭菌剂浓度、时间、程序上应有所区别,细胞工程-植物细胞工程,1.4 外植体接种培养,几种常用消毒剂的效果比较,细胞工程-植物细胞工程,1.4 外植体接种培养,外 植 体 灭 菌,次氯酸盐一般用于一些较软和较幼嫩的组织消毒；氯化汞一般用于种子、块根、块茎与较硬组织的灭菌。,所有消毒剂和处理时间及其方法是否得当，不仅影响灭菌效果，同时也影响外植体的生活力，进而影响培养效果。因此，外植体的灭菌处理，必须根据植物材料的性质，确定和优化消毒条件