第七章 农药及其代谢产物的测定

第七章 农药及其代谢产物的测定,农药（pesticides）是指一大类主要用于防治农作物病虫害和杀灭林业、畜牧业、公共场所、建筑物和家庭虫害的化学物。, Introduction - Definition,A pesticide is any substance or mixture of substances intended for preventing , destroying , repelling , or mitigating any pest. A pest is any harmful, destructive, or troublesome animal, plant or microorganism. （the U.S EPA）,分类（用途）,杀虫剂 杀螨剂 杀鼠剂 杀菌剂 除草剂 脱叶剂 植物生长调节剂等,有机磷类 有机氯类 氨基甲酸酯类 按成分和分子结构 脒类 有机氟类 无机类 拟除虫菊酯类,第一节 有机磷农药第二节 有机氯农药第三节 拟除虫菊酯类杀虫剂第四节 杀虫脒,有机磷农药大多为磷酸酯类 (organophosphates)或硫代磷酸酯类 (thio-organophosphates)化合物包括磷酸酯类、硫代磷酸酯类、磷酰胺类、硫代磷酰胺类、焦磷酸酯类和硫代焦磷酸酯类等化合物。,第一节 有机磷农药,R2,R1,O(or S),P,X,有机磷农药的通式,结构与其生物活性有一定关联：如碱性基团中乙氧基比甲氧基毒性大；酸性基团中强酸根比弱酸根毒性大，磷酸酯可直接与胆碱酯酶共价结合，毒作用迅速，而硫代磷酸酯，须经代谢、氧化脱硫，才能与胆碱酯酶结合发挥毒作用，毒作用相对较弱，但往拄持续时间较长。,碱性基团：烷氧基、苯基、烷胺基等,酸性基团：-F、-CN、-OCN、-SCN、烷基、烷氧基、硫代烷基、芳香基、芳氧基等,商品化的有机磷农药有近百种，一半以上是有机磷农药与其他农药的混合制剂。有机磷农药绝大部分为杀虫剂，少数为杀菌剂、除草剂等。,我国目前生产的有机磷农药主要品种有对硫磷、甲基对硫磷、马拉硫磷、乐果、氧乐果、敌百虫、敌敌畏、内吸磷、甲胺磷、乙酰甲胺磷、杀螟硫磷、辛硫磷、三唑磷和久效磷、稻丰散、异稻瘟净、磷胺、草甘磷等。,一、理化特性,有机磷农药多数为淡黄色或棕黄色油状液体，少数为白色结晶，有大蒜样臭味。大部分有机磷农药沸点较高，但是在常温下即可挥发、产生蒸气，逸散入空气。 一般难溶于水，易溶于有机溶剂和植物油。多数在水中易发生水解，尤其在碱性条件下；对光、氧、热较稳定。,The WHO Recommended Classification of Pesticides by Hazard,我国农药急性毒性分级标准,二、代谢和生物监测指标,有机磷农药可经消化道、呼吸道和皮肤吸收，可分布在肝、肾、肺、脂肪中。 有机磷农药在体内主要通过氧化、还原、水解和结合等方式进行代谢转化，少量可与蛋白质共价结合 。,有机磷农药的氧化作用包括 脱硫作用、脱烷基作用、脱烷酰基作用、脱芳香基作用，硫酯基的氧化和单链氧化作用。氧化作用的后果往往使农药的毒性增强。 有机磷农药的水解作用常使农药的毒性降低。,在氧化、水解之后进一步在转移酶的作用下可以结合上羧酸、醇、酚、氨基，亚氨基等基团而排泄。主要由尿、少量由粪便、呼出气排出。,有机磷农药的生化作用主要是 对胆碱酯酶的抑制。中毒表现: 中枢及周围神经系统障碍。,体内有两类ChE乙酰胆碱酯酶(AChE) 亦称真性ChE，具有水解Ach的特殊功能。主要分布于神经系统及红细胞表面(由神经细胞及幼稚红细胞合成)，对神经传导起作用的是真性ChE丁酰胆碱酯酶(BuChE) 也称假性（拟）ChE，存在于血清、唾液腺及肝脏中(在肝脏中合成)，分解丁酰胆碱的作用较强，分解丙酰胆碱及乙酰胆碱的作用较弱 有机磷中毒时，两类ChE都可被抑制,Ach和ChE的生理,（2）AChE有两个活性中心 阴离子部位和酶解部位阴离子部位与Ach中带有正电荷的氮(N)结合酶解部位与Ach中的乙酰基中的碳原子(C)结合，形成胆碱和乙酰化胆碱酯酶乙酰化胆碱酯酶在乙酰水解酶的作用下水解，乙酰基形成乙酸，胆碱酯酶恢复原来状态,AchE分解Ach示意图,-,（3）有机磷对ChE的抑制作用,有机磷化合物,+,ChE,磷酰化胆碱酯酶,Ach蓄积,毒蕈碱样症状,烟碱样症状,中枢神经系统症状,有机磷酸酯对ChE活性的抑制示意图,对硝基酚,O-对硝基苯基,-,-,-,M样作用 兴奋M受体， 心血管抑制，腺体分泌增加，平滑肌痉挛，瞳孔缩小，膀胱及子宫收缩，肛门括约肌松弛等,N样作用 N受体受到兴奋，作用与烟碱相似，小剂量兴奋，大剂量抑制、麻痹,中枢神经系统功能紊乱。 主要是使大脑先兴奋后抑制，突出表现为惊厥、昏迷和对呼吸中枢的抑制。,生物检测标志物,血液中有机磷农药的浓度可作为有机磷农药的接触生物标志物。,由于有机磷农药进入生物体内后能很快抑制胆碱酯酶活性，并具有一定的特异性。故常用胆碱酯酶活性来反映机体与有机磷农药的接触程度，或中毒深度。,三、样品采集及保存,1.血液中有机磷农药测定 肘静脉血 + 0.1mol/L盐酸溶液，冰冻贮存2.血液中胆碱酯酶活性测定 FeCl3比色法，DTNB光度法 取末梢血 + pH7.4磷酸缓冲液，混匀、加塞。4冰箱保存，尽快测定。,四、血液中有机磷农药的测定,GCHPLCGC-MS,气相色谱法,1原理 血液中有机磷农药在酸性条件下被环己烷萃取，经PT-C18色谱柱净化，浓缩后，再以2%SE-30为固定相、氮气为载气的玻璃填充柱分离，FPD检测，保留时间定性，峰高或峰面积定量。,2.色谱条件 p115,3.样品处理和测定 用丙酮将100g/ml的有机磷农药标准溶液配制成0.40、2.0、4.0g/ml的标准溶液系列，进样2l。以保留时间定性，峰高或峰面积定量，绘制标准曲线。 将酸处理过的血样从冷藏箱中取出，恢复至室温，取8.0ml（相当于2ml血样），置于10ml具塞刻度离心管中，加2ml环己烷振荡萃取，于2000r/min离心10min，收集上清液，将上清液通过已用环己烷处理过的PT-C18色谱预处理柱净化，再重复萃取、净化二次，收集净化液，在氮气流下挥发定容至0.10ml。取15l进样。从标准曲线（色谱图）上查得农药种类和浓度。,注意事项,1.SE-30为弱极性化合物，可作为有机磷农药通用的固定相。 2.采用SPME(固相微萃取)直接将经环己烷处理过的微量固相萃取器萃取头插入血样，平衡2min30min(视血样有机磷农药浓度而定)，然后将SPME针管插入气相色谱仪的进样口。可免去繁琐的萃取净化过程，且可减少采血量。3.色谱柱也可用宽口径石英毛细管色谱柱。,固相微萃取关键在于选择石英纤维上的涂层（吸附剂），要使目标化合物能吸附在涂层上，而干扰化合物和溶剂不吸附，一般是：目标化合物是非极性时选择非极性涂层；目标化合物是极性时选择极性涂层。 采样方法是将固相微萃取针管（不锈钢套管）穿过样品瓶密封垫，插入样品瓶中。然后推出萃取头，将萃取头浸入样品（浸入方式）或置于样品上部空间（顶空方式），进行萃取。萃取时间大约2-30min，以达到目标化合物吸附平衡为准。最后缩回萃取头，将针管拔出。,五、全血胆碱酯酶活性的测定,乙酰胆碱酯酶（真性胆碱酯酶） 丁酰胆碱酯酶（拟胆碱酯酶）有机磷农药中毒时，主要是乙酰胆碱酯酶活性受抑制。,体内的胆碱酯酶,当受一种以上有机磷农药影响、且又不明是何（几）种有机磷农药时，可考虑采用哪些测定方法？,全血胆碱酯酶活性的测定GC-MS,思考,测定方法：有简易测定法、滴定法、酸度法和比色法等，其中较为常用的是三氯化铁分光光度法 。电化学分析法、荧光法以及放射测量法,（一）三氯化铁分光光度法,1. 原理 乙酰胆碱 胆碱和乙酸剩余的乙酰胆碱 + 碱性羟胺 乙酰羟胺 + 三氯化铁 红棕色羟肟酸铁络合物,血液胆碱酯酶,水解,被水解的乙酰胆碱,酸性,终止反应后,剩余的乙酰胆碱,颜色深浅与剩余乙酰胆碱的量成正比，于波长520nm比色定量,反应式如下：,2.样品采集和处理,用血色素管取40I耳垂血，注入盛有pH7.4磷酸缓冲液的比色管中；若不能立即测定，则取0.50ml静脉血，注入预先含肝素钠抗凝剂的比色管中，混匀，置于4冰箱中可保存l周。,3.测定,（1）标准曲线的绘制（2）样品测定,P116中间,4.注意事项,1采血时不应挤压耳垂。因为本法是同时测定血球真性胆碱酯酶和血清假性胆碱酯酶；测得的血液胆碱酯酶活性值中，真性胆碱酯酶占85。2.乙酰胆碱水解的温度和时间对测定结果影响很大，应严格控制。 T：370.5 时间：准确反应30min,3加碱性羟胺溶液和1+2盐酸时，必须严格控制振摇时间，使反应彻底，否则影响测定结果。 4加三氯化铁溶液形成的棕色羟肟酸铁络合物易褪色，故必须在20min内比色完毕。 5计算胆碱酯酶活性百分数，应以本地区正常人全血胆碱酯酶活性为基准。各地区测定正常值，例数不应少于30人。,（二）DTNB分光光度法,1.原理 硫代乙酰胆碱 硫代胆碱 黄色化合物（412nm波长进行分光光度法测定）,胆碱酯酶,水解,乙酸,+ DTNB,5,5二硫代双（2硝基苯甲酸）,2.样品采集和保存,取10l末梢血，置于盛有3ml pH7.4的磷酸盐缓冲液的试管中，混匀、加塞，置冰瓶中运输，或在4冰箱中保存，宜尽快分析测定。,3.样品测定 4.注意事项 P117,第二节 有机氯农药,有机氯农药（Organochlorine pesticides）是指一类氯化烃类的农药，包括有机氯杀虫剂、杀螨剂和杀菌剂。,有机氯农药主要有三类，即滴滴涕(DDT)和DDT类似物；六氯苯类：六六六、林丹等；环戊二烯类：艾氏剂、狄氏剂、氯丹等,绝大多数性质稳定，在正常环境条件下不易降解，易于在生物体内蓄积。 危害主要表现在中枢神经系统和对肝脏的作用。 我国从1983年起禁止生产有机氯农药，1985年起禁止使用。,一、理化性质,多数为白色或淡黄色至棕黄色结晶或蜡状固体，氯丹为淡黄色液体。一般挥发性不大在正常环境条件下不易分解，有较高的化学稳定性，但遇碱易分解失效；水中溶解度极低，而可溶于有机溶剂、植物油和脂肪组织中。,表7-2 主要有机氯农药的理化性质,二、代谢和生物监测指标,有机氯农药可以通过呼吸道、消化道和皮肤吸收。有机氯农药在脂肪组织中浓度最高，且成为有机氯农药及其代谢物的主要蓄积场所。有机氯农药及其代谢产物的主要经肠道和泌尿系统排出，其次是泌乳。 生物监测样品常用血样、乳汁、耵聍和脂肪组织。,三、样品采集和保存,1血样 取肘静脉血样。皮肤经消毒后再用丙酮或己烷擦拭，待干后用干燥的1次性注射器或真空抽血管取血48ml，置干燥的具塞试管中，于冰瓶中送实验室。对急性过度暴露，一般应立即采样。如作为一般暴露监测，对采样时间没有严格要求。血样在冷藏条件下可保存3天。,2.人乳 人乳采集时需脱离污染环境，在无污染条件下采集。采样时先用75%酒精消毒乳房皮肤，再用丙酮或正己烷擦拭，待干后才取样。用清洁并已消毒过的吸奶器吸取乳汁，置干燥并消毒过的试管中。立即封口后送检。如不能立即检验则需冷藏，并于24h内检测完毕，否则需冷冻保存。,3.脂肪组织 脂肪组织样本一般均经由外科手术取样，或者取自实验动物，或尸体材料。通常取乳房或腹部的脂肪组织。取下后置于内部放有冰块的消毒小玻璃瓶中，并在30min内进行分析测定。如不能及时测定，则宜在零度以下保存。保存时间越久，所需保存的温度越低，最低保存温度可达-70。,4耵聍 在耳廓皮肤消毒后，用圆头小镊子直接经外耳道镊取耵聍，置于经消毒的小烧杯中，于冰瓶中送实验室。其他处理与脂肪组织样本相同。5.尿样 尿样的采集和保存方法参考第一章第二节有关内容。,三、样品采集和保存,四、人体组织和人乳中有机氯农药的测定,各种生物材料样品中有机氯农药的测定方法一般都采用气相色谱-电子捕获检测器法（GC-ECD）。,GC-ECD测定有机氯农药,1原理：生物材料中的有机氯农药经取样、有机溶剂浸提、净化、浓缩后，用色谱柱分离、ECD检测，以保留时间定性、峰高或峰面定量。,样品处理：,提取：浸渍法，捣碎法，索氏提取法，加速溶剂萃取法，液液萃取法，蒸馏法净化：柱色谱法，液-液萃取法，皂化法，磺化法，纸色谱法和薄层色谱法，固相萃取法，凝胶渗透色谱法浓缩：直接水浴浓缩法，气流吹蒸浓缩法，减压蒸馏浓缩法,2.仪器操作条件3.样品处理和测定 （1）样品处理 （2）样品测定（外标法定性定量； 内标法：二氯苯并葑酮）,1.人体组织,用组织捣碎机将人体组织（脂肪组织）样品绞碎，取绞碎均匀的样品2.00g置乳钵中，加约8g无水硫酸钠（以样品碾后呈干粉状为度）与样品一起碾磨。碾磨后移入100ml具塞锥形瓶中，加10ml石油醚，于震荡器上震荡30min。然后抽滤。残渣再用约10ml石油醚分3次洗涤，洗涤液并入滤液。,将滤液置于50ml分液漏斗中，加入2ml硫酸。振荡30s、静置、分层后弃去下层液。将上层液从分液漏斗上口倒入另一50ml分液漏斗中，用少量石油醚洗涤原分液漏斗，并入洗液。加入20ml 20g/L硫酸钠溶液，振荡30s、静置、分层弃去下层水溶液，用滤纸吸除漏斗颈内外水。然后将有机相通过一高约34cm、直径1cm，内置无水硫酸钠的小柱，最后再用3ml石油醚洗涤小柱，收集洗涤液，并用浓缩器浓缩至约0.5ml，再用石油醚溶解并稀释至1.0ml，供气相色谱测定。,2.耵聍,取20.0mg样品置于乳钵中，加约0.1g无水硫酸钠（以样品碾后呈干粉状为度）与样品一起碾磨。以下处理步骤除所用试剂相应减少外与脂肪组织相同。,3.人乳,取10.00g匀质奶样置于50ml离心管中，加入20ml 1：1丙酮/己烷溶液，用超声波振荡器振荡1min。以2000r/ min离心5min，分出有机相。在残渣中再用10ml 1：1丙酮/己烷溶液重复提取一次。合并提取液于50ml比色管中。在比色管中加入5g无水硫酸钠，不时颠倒搅混，以脱水。30min后用漏斗过滤，漏斗颈内填充玻璃棉，漏斗中铺无水硫酸钠适量。再依此重复过滤、脱水一次。,将滤液在45下，缓缓通入N2气，以挥去有机溶剂。所得残留物即奶脂。称重，并计算奶脂百分含量。用己烷分数次洗出奶脂（控制量约为50mg脂肪/ml己烷），定容至5.0ml。将5.0ml洗出液置具塞试管中，加入5ml浓硫酸，上下颠倒25次左右，去塞，用聚乙烯薄膜封口，离心（2000rpm）3分钟。取己烷层供色谱分析。,4.血液与尿液,血液与尿液样品的预处理方法基本上与人乳样品预处理方法相同，只是取样量和所用各种试剂量需根据样品用量按比例作相应改动。,（2）样品测定,取处理后的样品10l注入色谱柱。常采用外标法对样品进行定性定量测定。 将色谱纯标准物质10.0mg分别用己烷溶解并稀释至10ug/ml有机氯农药，作为贮备液。临用时配制成0.5，2，10，50，200，1000 ng/ml的标准系列，取2l进样。,4注意事项,（1）所用玻璃器具需彻底清洗，最后用丙酮或己烷冲洗，以去除污染。（2）萃取处理后的样品要彻底脱水，否则在挥干时油水相混不易排除水分，要去除水分则要提高挥干温度，而使低沸点有机氯农药严重损失。（3）样品加硫酸净化量要足。操作时颠倒混合，不宜振荡混合，否则会产生胶状混悬物，不易离心分离。,第三节 拟除虫菊酯类杀虫剂,拟除虫菊酯类 (Synthetic pyrethroids) 是仿效天然除虫菊化学结构的合成农药，其分子由菊酸和醇两部分构成。,拟除虫菊酯主要用于农业、家庭用杀虫剂现我国使用的有20几种，常用的有氯氰菊酯、溴氰菊酯、氯氟氰菊酯、氯菊酯和胺菊酯等。,一、理化特性,绝大多数为粘稠油状液体，呈黄色或黄褐色，也有少数为白色结晶。易溶解于多种有机溶剂，难溶于水，大多不易挥发，在酸性溶液中稳定，遇碱则分解失效。在化学结构上包含多个异构体。,根据分子结构中是否含有氰基，可分为型（分子中不含-氰基）和型（在-碳原子位置含-氰基）,型化合物的基本结构,型化合物的基本结构,氯菊酯 氯氰菊酯,目前以型使用较多，属中等毒性；型因不含氰基，毒性低，被用作卫生杀虫剂，常配制成气雾剂或电热杀蚊剂。其它分类：构型顺式、反式 旋光性左旋、右旋,1.接触机会： 生产、分装、运输、销售及施药过程,二、代谢和生物监测指标,经呼吸道、皮肤及消化道吸收，迅速分布到各器官组织。主要经肝脏代谢后，生成水溶性代谢产物由尿排出，少部分以原型排出。反式异构体的代谢转化主要靠水解反应，顺式异构体的代谢转化则主要靠氧化反应。化合物的空间构型会影响拟除虫菊酯的降解速率：反式异构体被酯酶水解速度快，而顺式异构体被氧化酶水解的速度慢。另外含有氰基也使水解速度减慢。,2.代谢过程,生物标志物,拟除虫菊酯的原型排泄迅速，停止接触12h后尿中即难以测出，但拟除虫菊酯的代谢产物可检测出的时间则比较长。生物监测常用 尿中代谢物含量 推测拟除虫菊酯的接触量。因为体内代谢快，故只有大量接触时才检测血中的拟除虫菊酯浓度。,毒性,拟除虫菊酯类农药一般属中等毒或低毒类，但对鱼类毒性很高，有一定的蓄积性。有些品种还具有三致作用。 型主要中毒症状：T症候群 型主要中毒症状：C症候群拟除虫菊酯具神经毒性，使中枢神经系统兴奋性增高，毒作用机制尚未完全阐明。,三、样品采集及保存,经口途径的暴露或皮肤吸收：收集24h尿样一次接触大量拟除虫菊酯：采集静脉血分析。,四、尿中代谢物的GC-MS测定,1.原理： 尿样加入内标物2-苯氧苯酸，用硫酸酸化后，样本中拟除虫菊酯代谢物经C18固相萃取柱萃取，用甲醇、硫酸洗脱，然后用毛细管气相色谱-质谱仪进行分析。采用空白尿样配制标准浓度系列，用内标法工作曲线进行测定。,2.仪器操作参考条件,气相色谱条件：进样口温度为250。采用5%苯甲基聚硅氧烷柱(60m0.25mm, 膜厚0.25m)，保持柱前压为145 kPa（1086mmHg）。采用程序升温。质谱条件：采用选择性离子检测器对拟除虫菊酯代谢物的质量碎片进行检测。,3.样品处理和测定,取适量尿样（10ml）加入(200l)2-苯氧苯酸（2-PBA）应用液(10mg/ l)，再加入(2ml)浓)硫酸(95-97%)，在90（恒温箱）加热1h，以使结合的羧酸酸解。,然后把样本冷却至室温，使酸化的尿样通过事先已制备好的C18柱，用6ml去离子水洗涤柱子，然后将柱子真空干燥510min。,用3ml甲醇将样品洗脱至含有1ml 98%浓硫酸的小玻璃瓶中，把洗脱液放在水浴中加热至75，保温1h，使代谢物完全衍生化。,取出并冷却到室温后，加入2 ml 正己烷和3ml 饱和氯化钠溶液，盖上盖子，混和10 min，离心5min，把1.5ml己烷提取液转移至2ml小瓶中。,加入200ul甲苯，以保住易挥发的酯类，用缓速的N2气流使提取液体积减少至100ul。进样量为1ul。,各种拟除虫菊酯类代谢物的标准系列浓度范围为0.5200g/L。以各个拟除虫菊酯代谢物质量碎片峰面积之和与内标物（2-苯氧苯酸）质量碎片峰面积之和的比与对应的标准浓度绘制工作曲线。样品根据各质量碎片保留时间定性，以各质量碎片峰面积之和定量。,4.注意事项,1. C18固相萃取柱在通过每个尿样后，要用水淋洗，然后必须干燥后再洗脱，以防尿样水溶性基体对测定的干扰。2.也有使用国产X-5树脂柱处理生物材料样品、以毛细管气相色谱仪或气相色谱-质谱仪测定生物材料中（不包括尿液）拟除虫菊酯的方法。,第四节 杀虫脒,脒类农药(formamidines)是广谱杀虫、杀螨剂。 杀虫脒(chlordimeform) 双甲脒(amitraz) 单甲脒(mono-formamidine)。,杀虫脒,N-(2-甲基-4-氯苯基)-N，N-二甲基甲脒；氯苯脒；杀螨脒；克死螨,一、理化特性,杀虫脒剂型分基型和盐酸盐型。基型为白色结晶，有氨样气味，是中等强度的碱性物质，在强酸介质中相当稳定，遇弱酸、弱碱易水解成对氯邻甲苯胺。 盐酸盐型为白色或为黄色粉末状结晶。,二、代谢和生物监测指标,职业接触，主要通过呼吸道和皮肤吸收。在生活中，大多通过消化道摄入。,入体内主要分布在肝、肾、脂肪中。在甲酰胺酶的作用下，主要降解为对氯邻甲苯胺。杀虫脒和对氯邻甲苯胺主要从尿中排出，少量也可从胆汁及乳汁中排出。,杀虫脒属中等毒类，中毒症状以紫绀、嗜睡和出血性膀胱炎三大症候群为其特点。,接触杀虫脒的正常人，最初尿中无杀虫脒和对氯邻甲苯胺，接触4h后，则能普遍检出，接触8h到停止接触后12h为排泄高峰。故测定尿中杀虫脒和对氯邻甲苯胺的含量可作为生物监测指标。,三、样品采集及保存,采集班后尿样或者次日晨尿200ml，贮存于聚乙烯塑料瓶中，立即测定尿比重。尿液按1001 比例加入盐酸，于4冰箱内可保存2周。,四、尿中杀虫脒和对氯邻甲苯胺的测定,重氮-偶合分光光度法气相色谱法高效液相色谱法,（一）重氮-偶合分光光度法,1.原理 尿中的杀虫脒在碱性条件下水解为对氯邻甲苯胺，对氯邻甲苯胺经重氮偶合反应，生成红色偶氮染料，于550nm波长，用标准曲线法进行分光光度测定。,2.样品处理和测定,3 注意事项,(1)个别样品在萃取后经饱和氯化钠溶液洗涤仍有较多的泡沫状物时，就不宜再进行洗涤，可加入适量无水硫酸钠脱水，使醚层分出。放出醚层到另一分液漏斗中，再加适量石油醚洗涤无水硫酸钠12次，合并醚层，再作反萃取。,(2)样品置902水浴中进行水解时，应塞紧试管塞，以免蒸汽冲开管塞。试管从水浴中取出后，须冷至室温方可打开管塞，以防待测物逸失。(3)加亚硝酸钠溶液时不要沾污试管口，否则会因污染而产生混浊或黄褐色。,(二)气相色谱法,1.原理 在碱性条件下，尿样中结合态杀虫脒与对氯邻甲苯胺转化成基型，用石油醚定量萃取、经缓流速氮气吹干，用硝基苯作内标、正己烷溶解，经色谱柱分离后用氮磷检测器（NPD）分别测定杀虫脒与对氯邻甲苯胺含量。,2.仪器操作条件,色谱柱：lm2mm不锈钢柱。固定液；3% PEG-2OM：5 Ucon-50-HB-2000。担体：Chromosorb W-Hp 80-100目。柱温: 190。载气(氮)30ml/min。进样量1.0l。,3.样品处理和测定,在测尿样比重后取