细胞破碎技术

细胞破碎技术 孙万儒 中国科学院微生物研究所 前 言 细胞破碎是了解细胞组成和结构 ,获得细胞内含物的必要手段。 胞内的生物活性物质的稳定性差 ,条件不适极易失活。特别是微生物细胞十分微小 ,细胞壁结构比较紧密 ,一般方法不易将细胞打破 ,有些技术虽然可以 ,但条件严苛 ,胞内生物活性物质在此条件下很易失活 ,限制了一些技术的应用。 在一定程度上细胞破碎仍是生物技术产业化关键技术。 破碎细胞的方法和技术 细胞破碎方法 物理法 化学法 渗透 超声 高压 球磨 研磨 碱处 酶法 有机 表面 休克 波法 释放 法 法 理法 溶剂 活性 法 法 法 剂法 细胞壁的组成和结构 微生物细胞外膜使细胞具有刚性的外形 ,由胞质膜和细胞壁组成 ,其结构影响着细胞破碎。 胞质膜保持着细胞内外的物质浓度梯度 ,主要由蛋白质和脂类组成。没有细胞壁时 ,膜对渗透休克敏感 ,对 其它破碎方法影响较小。 细胞壁是破碎的主要障碍 ,其 组成和结构对细胞破碎有重要影响。细胞壁的组成和结构与遗传和环境因素有关 ,但在微生物的种属中也存在总结构上的相似性。 细菌细胞壁的组成 1964年 Salton首次利用机械破碎法破碎细菌细胞，对细菌细胞壁组成、结构和功能进行研究。对格兰氏阳性菌和格兰氏阴性菌的细胞壁结构有了较为全面认识。 除了菌质和一些 L-型和嗜盐菌以外，几乎所有的细菌的壁的较坚硬部分都是由短肽交联的糖原链，即粘肽构成，围绕着细胞形成连续的网状结构，使细胞具有一定的形状和强度。 细菌细胞壁的组成 细菌粘肽结构示意图 N-乙酰基胞壁酸 (M)和 N-乙酰基葡萄糖胺 (G)交替形成糖原束 , 由 M 引出的纵点代表四肽单元的氨基酸残基，横点代表肽交联桥 细菌细胞壁的组成 不同物种的 N-乙酰基胞壁酸在其侧链基团上的取代有变化。但对糖原链的三维结构没有明显影响。 N-乙酰基胞壁酸残基的乳酸基与肽链结合，将糖原链联结起来形成网状结构。 至少 N-乙酰基胞壁酸残基的乳酰基部分可为四肽单元取代，相邻的糖原链由肽桥交联。大肠杆菌大约有 50%的四肽单元未交联，其它的仅作为二聚体交联。在嗜酸乳酸菌中，大约有 90%的四肽单元交联，约 30%的四肽单元作为三聚体交联。 细菌细胞壁的组成 虽然几乎所有的细菌都含有基本的粘肽网结构，但格兰氏阳性和阴性细菌的壁结构有明显不同。格兰氏阳性菌的壁相当厚，约 15-50 nm，含有 40-90%的由基础多糖和磷壁酸质组成的粘肽， 一些种属的细胞表面有规律地排列着蛋白质亚基。 格兰氏阴性菌细胞壁由薄的粘肽层 (1.5-2.0nm)和在电子显微照片上看如同胞质膜一样的外膜组成，粘肽层上还共价结合有脂蛋白，一些种属在外膜上另外还有一层规律排列的蛋白质亚基。 酵母细胞壁 酵母细胞壁结构更难加以说明。总的结构要比格兰氏阳性菌的厚些。面包酵母细胞壁大约为 70nm，且随培养时间的增加细胞壁加厚。 酵母细胞壁含有大量葡聚糖 ， 甘露聚糖和蛋白质 ，但不清楚以怎样的方式结合形成基本结构 。 在葡聚糖链上有 (1,3)和 (1,6)键联结的分支链结构 。 酵母细胞壁的甘露聚糖主要是由 (1,2)糖苷键和少量的 (1,3)糖苷键联结的甘露糖组成 ， 另外 ， 也有通过 (1,6)糖苷键联结的甘露寡糖侧链 ， 在甘露糖残基上有时也有磷酸二酯键 。 在酵母细胞壁上发现的蛋白质主要是与甘露糖复合 ， 多数是酶 ， 而不是结构组分 。 酵母细胞壁 格兰氏阳性 (a)和阴性 (b)细菌的细胞壁的横断面图 CM代表胞质膜 ; CW为细胞壁结构 ; SU为有规律排列的亚基 ; PG为粘肽层 ; OM为格兰氏阴性菌的外膜；类型不同，亚基可能存在也可能不存在。 酵母细胞壁 酵母细胞壁结构示意图 外层甘露聚糖 (M)通过磷酸二酯键与蛋白 (P)结合，内部蛋白含有交联的糖原 (G) 真菌细胞壁 大多数真菌的细胞壁是由多糖和少量的蛋白质及脂类组成，但组成变化很大，只有个别的真菌细胞壁作了较详细研究。正如细菌和酵母一样，多糖是构成细胞形状和耐受破碎的主要结构物。 真菌细胞壁组成和结构的多样性， 不能将一个种属的结果推广到另一个种属上。从影响细胞破碎的角度看，有其共同点，就是菌丝体生长过程中细胞壁的变化对细胞破碎的影响。 细胞壁组分与真菌分类 关键多糖 分类组 纤维素，糖原 集胞 (粘 )菌纲 (Acrasiomycetes) 纤维素， -葡聚糖 卵菌目 (Oomycetes),水霉目 (Saprolegnicales) 霜霉目 (Peronosporales),水节霉目 (Leptomitales) 纤维素，壳多糖， 卵菌目 (Oomycetes),水节霉目 (Leptomitales) -葡聚糖 纤维素，壳多糖 丝壶菌目 (Hyphochytridiomycetes) 去乙酰基壳多糖， 接合菌目 (Zygomycetes) 壳多糖 壳多糖， -葡聚糖 壶菌目 (Chytridiomycetes), 子囊菌目 (Ascomycetes),除了半子囊菌亚纲 (Hemiascomycetidae), 担子菌纲 Basidiomycetes)除 了掷孢酵母科 (Sporobolomycetaceae) 甘露糖 ,-葡聚糖 半子囊菌纲 (Hemiascomycetidae) 甘露糖 ,壳多糖 红酵母科 (Rhodotorulaceae) 真菌细胞壁 粗糙脉孢菌的细胞壁结构示意图 层次组成： (a)最外层由 -和 -葡聚糖混合组成 , (b)葡聚糖组合在蛋白类材料中的糖蛋白网络 ,(c)主要是蛋白质类物质 ,(d)内部的壳多糖类物质区，嵌镶在蛋白类物质中的微原纤维壳多糖。 真菌细胞壁 裂褶菌 (Schizophyllum commune)细胞壁的组分虽然与之不同，但具有相同的层次结构。三种聚合物 (R)-葡聚糖， (S)-葡聚糖和壳多糖大约占细胞壁干重的 70%， (R)-葡聚糖是一个高分枝聚合物，分支点为 (1,3)和 (1,6)，且与壁的惰性层中的微原纤维壳多糖复合。 真菌细胞壁的强度与聚合物的网状结构有关，至少含有的纤维状的壳多糖和纤维素对细胞强度有增强作用。 细胞壁结构与破碎 微生物细胞壁的形状和强度与壁内结构聚合物的结构和它们彼此之间交联及与其它组分的交联程度有关。为达到破碎细胞目的，必须打破这种共价结合的网状结构。这种结构不仅与其遗传特性有关，也与其生长环境和生长阶段有关，而真菌的细胞壁结构还和发酵时的机械作用有关，因此表现为极其丰富的多样性。 利用机械破碎细胞时，细胞的形状和大小，细胞壁结构聚合物的交联程度均是决定破碎难易的重要因素。要预知各种微生物细胞对机械破碎的耐受能力也有困难。 细胞壁结构与破碎 利用化学法和酶法破碎细胞时，了解细胞壁的组成和结构对选择具体方法显得十分重要。由于在网状结构之上覆盖有保护层，掌握它们的结构组成和非结构组成是选择酶和化学方法的依据。然而，有关这些方面的知识还十分有限，还需使用其它方法对这种精细结构进行更有效的研究。 破碎分析 破碎细胞的目的主要有二，一是获得细胞的内含物，二是获得细胞膜物质。不论是那一种目的，获得最大的破碎率是所有破碎技术追求的目标。 为了检测破碎过程和破碎结果，需要快速、简捷的细胞破碎程度的分析技术。细胞破碎率可直接利用完整细胞计数法或质量检测法，也可利用细胞释放出来的特定组分间接测定。 直接测定法是标准化法，间接测定法可能更有用，更有价值。可根据具体情况采用不同的测定方法。 1. 直接测定法 使用显微镜或用电子粒子计数器直接进行完整细胞计数 ,适合细胞破碎过程。然而，破碎释放的物质，如 DNA和其它聚合物组分会干扰计数。为进行显微镜计数，可进行染色，以便区分破碎和未破碎细胞。例如破碎的格兰氏阳性细菌会象阴性菌一样染色；如格兰氏染色法时，未破碎酵母细胞显紫色，而破碎细胞显亮红色。 对于量大的样品，显微镜计数法耗时，枯燥；电子粒子计数器虽可测定酵母细胞破碎率，但大的细胞破碎物可能有干扰；用于细菌破碎率的测定时 ,灵敏度较低。 2. 间接测定法 依据破碎过程中破碎的细胞释放的胞内物质量测算，如测定可溶性蛋白量或酶活性等，但需与破碎率达到 100%的标准进行比较。在使用酶活性测定法时需注意，由于粗酶提取物的酶动力学与完整细胞或纯化的酶可能有差别而产生误差。 当使用较浓的细胞悬浮液时，为获得准确结果，必须进行校正。这是由于破碎细胞释放胞内物质与水混合时会使体积增加。另外，稀释法并不适合在破碎过程中易失活的物质测定。因此需使用新的方法。 (1)稀释法 如果细胞破碎过程中失活不成为问题，可通过测定破碎样品 (Cu)和稀释样品 (Cd)的上清液中的可溶性蛋白来测定破碎率。使用公式可获得破碎样品的水相体积百分数 (Fd), Fd=(Vd/Vs)Cd/(Cu-Cd) Vd为加到体积为 Vs的破碎样品中的稀释剂体积。使用 Folin-Lowry法或双缩脲法测定蛋白质，通过下式可得破碎悬浮物中单位质量的细胞所含的蛋白质(Rp)， Rp=Fd(Cu/X) (2) X是以干物重为基础的细胞浓度。为计算细胞破碎率，必须测定相当于破碎率为 100%的 Rp值。 (1)稀释法 一般来说，水相体积百分数 Fd与样品的稀释量无关。这也说明蛋白质的溶解度不受样品的稀释的影响。但实际上，在多数条件下，稀释会影响蛋白质的溶解度，因此在采用稀释法之前，要检查稀释对蛋白质溶解度的影响。 (2)质量平衡法 破碎样品的水相体积分数 (F)与样品破碎前的水相体积分 (Fo)及完整细胞内的含水量 (质量分数 M)的关系为： F=Fo+(1-Fo)M R(Qc/Qaq) R为细胞破碎率， Qc为细胞密度，而 Qaq为水悬浮介质的密度。在上式中假设细胞内水释放会使水相体积分数增加。利用凯氏定氮法测定破碎样品水相 (Cn)和未破碎细胞 (Cno)的氮含量表示蛋白含量，它们与 F和 R的关系为： R=FCn/CnoX (2)质量平衡法 将两式合拚，删去 F项，得 R=Fo Cn/Cno X -(1-Fo)Cn M(Qc/Qaq) 当细胞浓度 (X)高时，用直接测定法测定细胞浓有困难，也可从样品的物理性质和固体质量分数计算得到。 X=Qc Qaq W(1-M)/W(Qaq-Qc) + Qc(1-M) 使用质量平衡法计算细胞破碎率时使用了几个假设，因此该方法的准确度有时比稀释法差。但是，当稀释影响蛋白的溶解度，不能使用稀释法时，可以使用质量平衡法测定细胞破碎率。 (3)电导测定法 电导测定法是依据细胞物质释放到水中会改变溶液电导的原理发展的一种快速测定方法。细胞悬浮液电导的增加与细胞破碎率成正比。 这种方法需要有其它方法作对比。因为电导与生物类型，保存条件，细胞浓度，温度，悬浮介质中的电解质类型和含量等有关。因此，在利用电导测定法测定细胞破碎率时，为了保证测定的准确，除破碎率以外 ,必须在保持的其它所有条件恒定的情况下进行。 渗透休克法 原 理 依靠细胞内外渗透压差突然加大造成细胞壁破裂 ,使胞内物质释放到溶液中。 将收集到的细胞用适当的缓冲液或生理盐水洗涤，除去细胞沾染的培养基或其它杂质，将其悬浮在含 10-30%蔗糖的适当缓冲液中，为了防止目的酶或蛋白质失活，若目的酶或蛋白质需要金属离子时，在缓冲液中加入金属离子；若金属离子会使目的酶或蛋白质失活，在缓冲液中需加入金属离子螯合剂，如 EDTA等。在低温下，使细胞悬浮液混合均匀，放置使细胞内外渗透压达到平衡。在低温下离心，收集细胞；在激烈的搅拌下将细胞快速加到较大体积的低浓度的缓冲液中，由于细胞外渗透压突然降低，使细胞破碎。 应用 用此法处理大肠杆菌，可使磷酸酯酶、核糖核酸酶 I以及脱氧核糖核酸酶等释放到溶液中。释放的蛋白质的量一般仅占细胞蛋白质的 4-7%。因此，后序的蛋白质分离纯化比较简单。此法对细胞壁外有着牢固的糖蛋白包裹层，使胞内渗透压不受严重影响的 格兰氏阳性菌 不适用。 在高渗透压环境下生长的细菌 , 如海洋细菌，嗜盐细菌，更适合该法。如可有效的将海洋发光细菌的细菌荧光素酶释放，酶释放率可达到 80-90%。 超声破碎法 设备和原理 超声破碎器由高频电发生器和产生高强度超声信号的电功率转换器构成，并把超声波传送到与其接触的溶液中。一般在频率 15-25KHz下进行操作，由声波的冲击和振荡，在溶液中产生空化作用，空化泡的急剧膨胀压缩和内向爆破产生冲击弹性波，将声能转化为机械能，形成粘性消散涡流，如果液体旋涡小于细胞尺寸，产生不同密度移动，当细胞的动能超过细胞壁强度时，至使细胞破碎。因此，细胞破碎率与输入功率大小，细胞大小，细胞壁强度，细胞形状和破碎时间有关。一般来说，超声破碎对球状或近球状细胞较有效，对丝状菌破碎效果较差。在输入功率为 60-195W的条件下，细胞破碎时的蛋白释放与细胞浓度无关，最大细胞浓度可达 60 mg/ml。 设备和原理 在破碎输入功率恒定条件下，对面包酵母破碎实验过程的理论分析得出以下关系式 : 1-Rp=exp-(kt) 这里 Rp为蛋白释放率， k为蛋白释放常数， t为破碎时间 (min)。在面包酵母浓度为 20mg/ml，超声波频率为 20KHz，输入功率 190瓦的条件下，蛋白释放常数 k与输入功率有如下关系 : k=b(p-po)/0.9 其中 b为常数， p是输入功率 (J/kg.s)， po是空化作用的最低界限输入功率。 应用与局限 最大问题是在超声过程中声波被溶液吸收产生大量热量，不能及时将热量移出，细胞悬浮液的温度急剧升高，导致酶和其它生物活性物质变性失活。因此，在实验室中往往采取间断破碎的方法，即经短时间破碎，冷却降温，再进行破碎，经多次反复达到破碎目的。 因此在细胞破碎过程中，有效冷却是关键。 也因大容量容器的声波传递和散热困难，限制了超声破碎的大规模应用。 应用与局限 超声破碎在实验室应用比较普遍，处理量小时比较方便。 超声波作用产生游离基， 超声波会造成蛋白质结构变化均会使之失活。 超声破碎法细胞较为彻底，细胞内含物全部释放，破碎细胞悬浮液粘稠，利用简单的过滤法难于回收含有目的产物的上清液，只有通过长时间离心回收上清液，使后序工艺复杂。 超声噪音污染环境，影响人们健康，应对操作人员加以保护。 应用与局限 在超声破碎细胞时，正确的方法是探头的下表面处于菌悬液表面下 0.3-1.0 cm处最好，深浅以不会使菌悬液产生大量泡沫为准。 超声破碎细胞的破碎率一般可达到 80-90%，如要进一步提高破碎率，需增加更多的破碎时间。因后期破碎率提高并不明显，且增加时间和能耗，更重要的是目的产物会因失活而使产物收率反而下降。从回收目的产物的角度看是不经济的。因此有必要通过破碎时间与破碎率和生物活性产物收率关系曲线确定最佳破碎时间。 大规模应用的对策 大规模连续破碎细胞的超声破碎系统示意图 A 超声波转换器， B 细胞破碎腔， C 细胞悬浮液储存器， D 冷冻系统， E 高频电发生器 关键是破碎腔的设计。腔的大小及深度要能够被超声波覆盖，且料液无流动死角。操作要求严格控制细胞悬浮液和冷冻液的流速，以保证破碎流出物料的温度不超过控制水平。采用批式多次单循环或连续混合循环方式均可达到破碎细胞的目的。 高压释放匀浆法 设备与机理 高压释放匀浆法是一种有效的大规模破碎细胞技术。有各种类型的工业产品可供选择，主要由高压泵和释放阀两部分组成。高压泵一般是一级或二级的正向柱塞泵，细胞悬浮液在 40-350 Mpa的高压下通过阀座中心孔高速喷出，因针状调节阀的阻挡而改变方向，喷射在碰撞环上，细胞在高速喷射，湍流碰撞和急剧降压中，由于各种剪切力的作用致使细胞破碎。 高压释放阀示意图 A.控制卸压的手柄 , B.控制杆 , C.针阀 , D.阀座 , E.碰撞环 设备与机理 释放阀的结构，特别是阀座的形状对细胞破碎率有明显影响。在相同的操作压力下破碎啤酒母细胞时，刃式结构要比平式结构的破碎率高 20-25%。 .两种阀座结构的示意图 a.平式结构 , b.刃式结构 设备与机理 高压释放破碎细胞机理的研究表明，致使细胞破碎的原因比较复杂。对产元假丝酵母和啤酒酵母细胞破碎机理的研究发现由于高速流动造成的碰撞是细胞破碎的主要原因，而一般的应力切变造成的细胞破碎约只占总破碎力的 20%，其它的作用力较难估计。 碰撞和一般应力对细胞破碎的影响 碰撞 , 一般应力 影响破碎的因素 所有微生物细胞只有施加的压力达到某一水平时才开始破碎，继之细胞破碎率随着压力的增加而迅速增加。破碎为一级动力学过程： ln1/(1-R)=kNPa N为通过匀浆器阀门的次数， P为操作压力， k为与温度有关的速度常数， a为功率值，它与细胞破碎时需要克服的压力范围有关。 利用高压匀浆器破碎面包酵母的破碎曲线 温度为 30 , 温度为 5 影响破碎的因素 破碎过程中，在很宽的范围内破碎与细胞浓度(29-224 g/L的干细胞 )无关。面包酵母破碎时，不同酶的释放速度不同，集积在细胞壁和胞间质的酶的释放要比可溶性蛋白质快些，而在线粒体上的酶的释放与可溶性蛋白质具有相同的速度，在亚细胞颗粒上的酶的释放速度要慢些。 蛋白与酶释放的相互关系 A.酸性磷酸酯酶 , B.蔗糖酶 , C.葡萄糖 -5-磷酸 , D.醇脱氢酶 , E.碱性磷酸酯酶 , F.富马酸酶 . 影响破碎的因素 酵母细胞在 30 破碎的破碎率大约比 5 的破碎率高 1.5倍。因此 ,在不影响酶活力回收的前题下，适当提高破碎温度对破碎是有利的。 高压消耗的能量大部分转化为热量。在 200 MPa下压缩 1 ml菌悬液释放热量 47卡，可提高温度 47 。因此，在实际操作时，为防止温度过高，需要冷却控制破碎操作温度。 不同微生物细胞因其形态，大小，细胞壁结构不同，在破碎时需要的压力不同。下表列出了不同微生物细胞达到 50%破碎率所需要的压力。 影响破碎的因素 微生物 格兰氏菌 大小 (m) 破碎 50%所需压力(Pa) 大肠杆菌 阴性 2-4 0.5 1.5 107 枯草芽孢杆菌 阳性 1.5-3 0.5-0.8 2.4 107 干酪乳杆菌 阳性 4 0.4-0.7 3.1 107 粪链球菌 阳性 1.02 1.5 108 金黄葡萄球菌 阳性 1.0 1.9 108 酿酒酵母 阳性 7-12 5-8 1.5 108 破碎不同微生物细胞需要的压力 影响破碎的因素 细胞破碎率与培养条件和生长期有关。生长在合成培养基上的大肠杆菌要比生长在复杂培养基上的易破碎；对数生长期中期收获的细胞要比对数生长期后期收获的细胞易破碎。 细胞类型和培养条件对破碎的影响 1.批式培养的产元假丝酵母 2.连续培养的产元假丝酵母 3.好气培养的啤酒酵母4.厌气培养的面包酵母 5.连续培养的枯草芽孢杆菌 影响破碎的因素 高压释放破碎细胞虽然也存在细胞破碎释放原生质物质使破碎物粘度不断增加，改变流变学性质的问题，但因不会发生细胞壁降解而形成更小的碎片和释放细胞壁糖原，避免了破碎物粘度的进一步增加，因此对后序工艺的影响较小 。 细胞破碎率与细胞悬浮液通过匀浆器的次数成正比，因每次破碎率有限，在实际操作中可以采用批式循环或混合循环方式。为控制破碎温度，需在细胞悬浮液储罐进行冷却降温。 在细胞悬浮液中加入细玻璃珠，或冷冻细胞悬浮液形成适当量的冰晶，可提高细胞破碎率。 冰冻压缩释放破碎法 设备与机理 冷冻的细胞悬浮液在低温低压力下不能流动，但提高压力时，水的结晶结构会发生相变，随着压力的增高，水的结晶内聚性降低，从不能流动的固相变成可流动的液相；在高压下发生流动喷射，使细胞破碎 。 压力与温度对水的相图的影响 设备与机理 冷压释放破碎器结构示意图 1.活塞， 2.尼龙壳， 3.园桶环， 4.柱塞，5.压缩腔内的细胞悬浮液， 6.O-型环， 7.园盘， 8.园盘支架， 9.固定栓， 10.空气阀， 11.螺旋弹簧， 12.网 . 设备与机理 破碎细胞操作中，物料从小孔喷射由压力控制。只有压力高于相变临界压力时，细胞悬浮液从固相转变为液相，发生喷射。而喷射的结果是压力急剧降低，低于相变临界压力，细胞悬浮液成为固相，喷射停止，压力再度升高超过相变临界压力，再次喷射，周而复始，完成细胞破碎。 在园盘小孔上安装调节控制压力阀，使破碎在更高压力下进行。如将细胞悬浮液冷冻到 -20 ，施以 200Mpa压力，可将酿酒酵母细胞一次破碎率达到 90%。 技术适用性 由于在低温下操作，对于热敏感的生物活性物质有利，破碎的活性收率要比其他破碎方法高。 利用该破碎技术破碎格兰氏阳性球菌和杆菌，分枝杆菌，放线菌，酵母和真菌提取酶均获得很好结果，说明微生物种类，细胞结构和形状对破碎影响较小。 该技术用于破碎原生动物，花粉，甚至动物细胞，也均获得理想结果。破碎兔皮提取透明质酸，不仅可避免与粗结构结合，还可减少产物降解。将粗的动物组织，如皮和健切成几毫米的小块，与等量的水混合冷冻也可破碎。像软组织，如肝，肾等也可直接进行冷冻压缩释放破碎。因此与其它破碎技术相比，其适用范围更宽。 影响破碎的因素 酵母细胞悬浮液在 -25 破碎过程：活塞以 0.95 cm/秒的速度向前推进， 1415秒后，压力达到 200 Mpa以上，细胞悬浮物液化在压力下通过释放孔，高速喷射，发出 嘭 的一声，压力降到几乎为零，测定的物料喷射速度高于 200m/秒， 0.15秒后，压力上升接近原来的 200 Mpa，再次重复这一过程。因此，脉动的时间间隔为 0.15秒，这段时间大部分是用于提高压力。整个破碎过程为不连续脉冲释放过程。 酵母细胞破碎过程的压力变化情况 影响破碎的因素 将酿酒酵母悬浮加入不同浓度的氯化钾，氯化钠和氯化钙，分别在 -15、 -25、 -35 下进行压缩破碎，发现在盐存在下，于 -25 和 -35 时破碎率较高；盐的作用主要是改变相变的共熔点，降低释放的临界压力 (Po)。氯化钙和氯化钠比氯化钾的作用明显，在破碎中的影响也较大。 在 -25 下，使用不同浓度的酵母细胞进行破碎，发现破碎率随细胞浓度的增加而增加，至少细胞浓度可达到 270mg/ml(干重 )。高浓度的酵母细胞使悬浮液粘度增加， 较低的相转移速度和平滑的流动会产生较高的破碎。 同时会延长脉冲的间隔时间。 大量破碎微生物细胞的方法 为了大量破碎微生物细胞和其它生物材料，建立了半连续的操作方式。首先将细胞悬浮液在冷冻箱内冷冻制成圆柱状，其大小要适合加压圆筒。将预先冷冻成形的物料放入破碎器，利用水泵加压驱动活塞，使之通过小孔进行破碎。一般样品温度为 -35 ，加压破碎温度为 -20 ，面包酵母以平滑流动方式通过小孔，一次破碎的破碎率可达到 90%。每小时可处理 20Kg材料，功效可达到 20%，能量消耗为 1 KW h/Kg。如果再增加处理量也是可能的。 球磨破碎技术 球磨破碎技术 球磨破碎细胞的破碎率可高达 95%，用于提取细胞壁，线粒体，核酸，蛋白以及其它细胞器的收率也高。用 Dyno mill破碎酵母细胞提取线粒体的收率要比其它机械破碎法要高 5-8倍。球磨破碎细胞应用范围广，从实验室到大规模生产均可使用，并可控制系统及破碎工艺过程的温度；操作系统密闭，可对系统进行灭菌，避免污染。因此，该技术和设备的发展和应用受到广泛关注。 设备及原理 国际上不同生产厂家分别生产多种球磨破碎细胞的设备，从实验室使用的小型细胞球磨机到大规模生产使用的每小时可破碎 100公斤细胞的大型细胞破碎机，多各种类型和规格。但基本原理和机械结构大同小异。这里主要介绍瑞典的 Dyno-mill 机。 设备及原理 Dyno-mill 细胞破碎机结构示意图 1为整体结构图， 2为破碎室结构图， A 破碎室夹套， B 搅拌叶， C 搅拌轴， D 微孔分离器 , E 物料进口 , F 温度测试孔 , G 冷却液进口 , H 搅拌轴 设备及原理 球磨容器 实验室规模的容积为 0.15、 0.3和 0.6升，工业规模的为 1.4升到15升，最大的可达 265升，为带有冷却夹套的圆桶容器，小型的实验室使用的是无铅玻璃制造，而大型的是不锈钢制造。有通向容器内部的菌悬液进料口和球磨剂装料口。依靠夹具将其固定，很容易更换。 驱动马达 为三相 380 V， 1.85 KW， 2900 rpm的电动马达。其主动轮通过一个特殊的 V型皮带与搅动轴上的被动轮连结，利用安装在操作马达开关板上的手柄，控制皮带在主动轮和被动轮上的位置，改变搅动速度 。 分别达到 2000， 3000， 4500和 6000转 /秒，这时的搅拌叶的线速度分别为 6.7， 10， 15和 20米 /秒。 设备及原理 电动马达的控制 控制马达的开关有两个按钮，开和关，安培表，信号灯，在防护罩上有磁性开关，一当防护罩打开，或在操作时未关上，电动马达不能启动。 搅拌叶 由聚氨酯或不锈钢制造的直径为 64毫米的圆盘，它们是用垫片和分离子按一定间隔距离将其固定在搅动轴上。 A B 搅拌叶轮结构示意图 A 聚氨酯叶轮 B 不锈钢叶轮 设备及原理 分离器 为一种高效狭缝分离器，它的作用是将研磨剂保留在研磨容器内，而使破碎的细胞悬浮液流出。狭缝的宽度是利用不同厚度的标准隔片控制，分别为 0.02， 0.05， 0.1， 0.2和 0.3 mm。狭缝大小的选择取决于使用的研磨剂的粒度，一般为研磨剂直径的三分之一。 球磨剂 球磨剂为无铅玻璃制造的玻璃珠，直径范围最小的为 0.1mm，最大的为 1.5mm，可根据破碎的细胞种类进行选择。实验结果表明在球磨容器内的球磨剂装量为研磨容器的容积的 80-85%为宜。 设备及原理 给料泵 为了连续破碎，可使用能调速的普通蠕动泵，将细胞悬浮液连续输到破碎器内，其供料速度可由需要的破碎率来控制。 冷冻设备 由于在细胞破碎过程中高速搅拌，研磨剂与研磨剂，研磨剂与细胞之间的磨擦会产生大量热量，破碎过程温度不断升高，为避免生物活性物质失活，对破碎系统进行冷却是十分必需的。对于 Dtno-mill KDL可配用 DMK 15/F型的循环流动式制冷机，对球磨容器和细胞悬浮液储存器进行冷却。 冷冻液可采用聚乙二醇 /水溶液（ 1/1）。 设备及原理 破碎效能 当使用 0.3 L的研磨容器时，采用连续破碎，最大的细胞悬浮液输入量可达 15L/h，而实际的输入量要取决于破碎率。 0.3和 0.15 L的破碎容器也可进行批式破碎，主要适用于低粘度的悬浮液，如微生物材料，其一次装量分别为 160-170和 80-85 ml。而不锈钢破碎球磨容器主要用于高速破碎和粘度高的悬浮液的破碎 。 细胞破碎原理及动力学 在高速细胞破碎球磨机内，高速旋转搅拌叶搅动细胞悬浮液和球磨剂 -玻璃珠，由于切力层间的碰撞及球磨剂的旋辗而使细胞破碎。因此，细胞破碎的过程实为一级反应动力学过程。如果以细胞内蛋白质的释放来衡量破碎程度，蛋白质释放速度直接与未释放的蛋白质量成正比。 log e Rm/(Rma - R) = log e D = kt R为某一时间测定的细胞破碎释放的蛋白质量， Rm 为总蛋白质释放量， k 为一级反应动力学常数。将上式对时间 t 积分 D = Rm/Rma-R，即为未释放蛋白质的百分数的倒数。 若按细胞破碎率来表示，可写成： log e (Xma/1 - X) = kt 这里 Xma 为最大破碎率， X 是在时间 t 时的破碎率。 细胞破碎原理及动力学 按可溶性蛋白质释放的破碎动力学，则可写为： log e Rm/(Rma - R) = log e D = kt 若按实际测定的蛋白质量 Ro 表示， 当 Ro = Rma 时， 则 Ro = Rma + k2/k1 . K 按 细胞破碎率来表示，可写成： log e (Xma/1 - X) = kt 通过对破碎细胞的球磨机的示踪研究表明，其动力学行为与连续搅拌反应器 (CSTR)很相似，因此，对 Dyno-mill KDL 0.6的球磨过程可以认为是由四个串联的搅拌反应器组成，即由四个搅拌叶构成一个反应器，相邻的搅动叶轮距离较小，因此，存在反流现象，而使其效率略有降低。而 5 L的 Dyno-mill，因反流现象可以忽略，因此破碎效率较高。 影响细胞破碎的因素及其相互关系 细胞种类及状态 利用 Dyno-mill KDL进行的细胞破碎试验表明，不同中属的微生物细胞在相同条件下破碎时，其破碎效率有明显差异，如表 。 菌种 活菌数 蛋白质 酶 最大破碎 率 (%) K (min-1) 最大释放量 (mg/g.dl) K (min-1) 最大释放量 （ IU/g.dl） K (min-1) 假单孢菌 - - 66.0 1.1 46.2 1.6 阴沟肠杆菌 100 1.3 99.0 1.55 70.0 1.65 大肠杆菌 100 1.75 40.5 1.7 32.0 1.4 酵母 90 1.46 54.0 1.5 45.0 1.3 影响细胞破碎的因素及其相互关系 上述差异的主要原因是不同种属的微生物细胞的大小和形态，细胞壁或膜的结构不同，另外，因生长条件如培养温度，时间，营养成份不同使上述的细胞形态细胞壁结构等也有差别。因此，即使在相同的破碎条件下其破碎效果也不同。换句话说，不同种属的微生物细胞所需的破碎条件也不相同。从大量文献中可以总结出这样的规律：按细胞破碎的难易程度是细菌酵母真菌藻类。 另外，细胞的保存情况也会影响破碎效果， 保存状态 破碎程度 (%) 5 (min) 10 (min) 15 (min) 喷雾干燥 55 91 97 新鲜 87 99 100 细胞浓度 在细胞破碎前，需用适当的介质，比如缓冲液按细胞重量配制成一定细胞浓度的悬浮液。悬浮液要均匀，要防止有结块和沉淀。初始的细胞浓度对破碎速率的影响如图 。 00.20.40.60.80 0.2 0.4 0.6 0.8酵母细胞浓度破碎速度常数k(sec-1)破碎速度常数 (K)与酵母浓度的关系 不锈钢搅拌叶， 聚氨酯搅拌叶 细胞浓度 一级反应动力学的速成常数应当与细胞浓度无关，但在较高细胞浓度下，破碎过程细胞内含物不断释放使系统粘度不断升高，混合速度降低，导致破碎速率下降。在高细胞浓度下，最大蛋白质释放量 (Rm)降低，但破碎率高。 低细胞浓度下，细胞的总蛋白质释放量高，并受流出速度影响较小；高细胞浓度下，细胞的总蛋白质释放量降低，特别是在高流出速度下，总蛋白质释放量随细胞浓度增加而下降。 酵母浓度对蛋白质释放的影响 不锈钢搅拌叶， 流速为 100 10-6m3/sec 聚氨酯搅拌叶， 流速为 20 10-6m3/sec 细胞浓度 除了细胞浓度直接影响破碎物的粘度以外，细胞的保存状态也影响着粘度和破碎率。 01020300 2 4 6 8 10 12 14黏度( c p )酵母浓度(%)细胞浓度与保存状态对粘度的影响 鲜细胞 干细胞 细胞浓度 细胞破碎过程中，由于粘度增加，热传导能力降低，即使在相同的冷却条件下，破碎系统的温度也会增高，温度的增高会引起蛋白质和酶变性，使蛋白质和酶的总释放量降低。 10152025303540450 5 10 15 20 25 30 35酵母干物质量(%)温度()细胞浓度对破碎温度的影响 玻璃研磨室 不锈钢研磨室 细胞浓度 总之，在 Dyno-mill上进行细胞破碎，细胞浓度从 20%增加到 40%，破碎速度常数仅有很小的变化 ;细胞浓度增加到 50%，破碎速度常数减小，破碎效率降低。高细胞浓度下，还会发生细胞破碎物沉淀和蛋白质沉淀现象一般来说，破碎细胞浓度以 40%为宜。 球磨剂 最常使用的球磨剂是无铅玻璃珠，其它的还有不锈钢珠，聚酯和聚酰胺珠等。 球磨剂颗粒大小的影响 一般使用的无铅玻璃珠的直径为 0.11.5 mm，利用大肠杆菌和酵母细胞进行实验发现，细胞破碎率随玻璃珠直径的增加而降低。对于不同的细胞，由于其大小不同，使用的玻璃珠的最适直径也不同。大肠杆菌和阴沟肠杆菌使用 0.1 mm的玻璃珠进行破碎的效率最高；而酵母细胞使用 0.250.5 mm的研磨剂最宜。 球磨剂 细胞内蛋白质和各种酶的释放速度常数与玻璃珠直径的关系如图，说明酵母细胞破碎的最适玻璃珠直径为0.250.5 mm。 玻璃珠直径对破碎速度常数的影响 酶 蛋白质 球磨剂 破碎率与玻璃珠大小和物料流速的关系如图，说明破碎率随使用的玻璃珠直径的增加和物料流速的增加而降低。 玻璃珠大小与流速对破碎率的影响 球磨剂 实际操作时，一般不使用 0.1 mm的球磨剂，即使破碎细菌也使用 0.250.5 mm的玻璃珠。其原因有三：一、用 0.1 mm的玻璃珠破碎速度虽高，时间短，若破碎时间控制不严，对酶有破坏作用，破碎物的酶活会下降；二、小珠机械研磨产生热量高；三、选择狭缝分离器时，狭缝的大小应当是使用的研磨剂直径的三分之一，使用 0.1 mm的玻璃珠，狭缝应选用 0.03 mm的，这样的狭缝分离很慢，大规模破碎时很困难。 玻璃珠作球磨剂，使用 100 h的损失不超过 3%，一年后检查分离器通道无重大变化，说明玻璃珠可以长期反复使用。 还发现使用的玻璃珠大小与酶在细胞内的位置及细胞浓度有关。 球磨剂 装量的影响 使用无铅玻璃珠作球磨剂，一般的装量为研磨容器容积的 8085%。随球磨剂装量的降低，细胞破碎效率也降低，同时研磨过程中产生的热量也减少。因此，如果破碎释放的活性物质不耐热，而且设备冷却又差，需适当减少球磨剂的装量。另外，若细胞悬浮液或破碎物的粘度很高时，也需适当降低球磨剂的装量。 球磨剂 搅动速度 Dyno-mill 的搅动轴有四个转速，即 2000， 3000，4500和 6000 r/min，相应的搅拌叶轮的线速度为 6.9，10， 15和 20 m/s。 在球磨细胞破碎过程中，马达驱动轴带动搅拌叶转动是细胞破碎的维一能量来源。因此，搅拌叶的转速决定着细胞破碎的速度和程度。大多数试验证明，细胞破碎速率随搅拌叶转速的增加而增加，但在很高的转速下细胞破碎速率不会成比例增加，有时还可能下降。 搅动速度 酵母细胞破碎过程中，酶的释放速度常数随叶轮转动速度的增加而增加。胞间质酶，在细胞破碎过程中容易释放，细胞器结合酶，只有细胞完全破碎才释放出来。 液轮搅动速度对蛋白质释放速度常数的影响 蛋白质 , 麦芽糖酶 , 磷酸酯酶 , MDH, G6PDH, 6GPDH. 搅动速度 Dyno-mill 的容积及搅动叶轮的材质上的差异，以及操作方式的差异，搅动速度对细胞破碎的影响也有差异。但总的趋势相同，即搅动速率增加，破碎的速度常数也增加。 搅动速度、叶轮材质和操作方式对破碎速率的影响 批式， 5 L破碎室，不锈钢搅拌叶批式， 连续， 0.6L破碎室，聚氨酯搅拌叶，连续，批式 搅动速度 实际上，搅拌叶的搅动速度的增加使破碎加快，也使整个系统的温度升高。 搅拌速度 (m/s) 温度 ( ) 开始温度 终了温度 10 1 34 15 1 78 22.5 1 21 是在有冷却的条件下进行的，搅动速度的增加造成温度升高；尽管高速搅动可以获得高的破碎速度，但对某些对热敏感的活性物质来说就受到限制。 叶轮结构 经常使用的搅动叶轮有两种，一种是由聚氨基甲酸酯材料制造，具有开放式的结构；另一种是用不锈钢制造的，结构上不如聚氨基甲酸酯的开放。 在 5 L破碎容器中不同材质的搅拌叶对破碎效率的影响 聚氨基甲酸酯 不锈钢 叶轮结构 不同材质和结构的搅动叶轮在操作中因搅动效果的差异，使破碎系统的温度变化也不同。 流 速 (m3/sec) 温度升高 ( ) 不锈钢叶轮 聚氨酯叶轮 83 10-6 16.5 17.0 53 10-6 17.0 19.5 42 10-6 18.0 22.0 22 10-6 20.0 28.0 该结果表明具有开放结构的聚氨酯搅拌叶的搅动效率高，物料球磨效果好，因而升温也比不锈钢叶轮的高些。 叶轮结构 在低转速下，较开放的聚氨酯叶轮的破碎效率较低，这是由于反逆作用所造成的。在高转速下，有较高的搅动效率，且能耗也增加。 为增加搅动效率，可以使搅拌叶安装成与轴有一定角度，其作用是增加分散能力，但这样会使连续破碎的能力减小；因增加了能量到细胞悬浮液中的传递能力，而有较高的破碎速度，但能量效率降低，特别是在高转速下。 叶轮结构 叶轮结构和材质上的差异造成功率消耗不同， 叶轮形状 ,转速和验磨腔的容积对功率消耗的影响 聚氨基甲酸酯搅拌叶 不锈钢搅拌叶 具有较开放结构的聚氨酯叶轮的功率消耗高于结构上较封闭的不锈钢叶轮，不论是在容积较大的，还是在容积较小的球磨破碎机上均是如此。 叶轮结构 一个球磨机的效率可用以下公式计算 : Eff = RYQ/P 这里 R为每 kg细胞释放的蛋白量， Y是细胞浓度， Q为流速， P为 动力消耗。在 5.0 L的 Dyno-mill上，使用聚氨基甲酸酯搅拌叶和不 锈钢搅拌叶时的动力效率与流速和搅动速度的关系如图。 聚氨基甲酸酯叶轮的操作动力效率 不锈钢叶轮的操作动力效率 叶轮结构 以上结果说明用聚氨酯搅拌叶操作时，球磨的动力效率随流速和叶轮转速的减小而增加