疟疾的病原学诊断技术

血涂片制作及疟原虫镜检技术烟台市疾控中心检验科授课内容1.厚、薄血膜血片制作方法。2.疟原虫的生活史及其各发育阶段的基本特点。3.间日疟、恶性疟各期疟原虫的形态与镜检技术 血膜的制作用于检查疟原虫的血涂片有两种：一种是将血液涂呈薄膜状，称 薄血膜 ；一种是血液涂成圆盘，称 厚血膜 。无特殊要求的可厚薄血膜分载玻片涂制。发热病人血片 标本片薄血膜的制作l 薄血膜 ： 取一小滴血（约 1 1.5微升的血量），将血滴置于载玻片中部，将推玻片的边缘紧贴载玻片血滴前，使血液沿推玻片边缘散开约 2cm宽时，使推玻片与平置的载玻片形成 25 350夹角，平稳、均匀由右向左推片，形成舌型、头体尾分明的薄血膜（约 2.0-2.5cm宽 2.5-3.0cm长）。l 影响因素 ： 速度快慢、血滴大小、推片与载玻片夹角大小等影响血膜的厚薄、大小。l 要求 ： 制成的薄血膜外观：厚薄均匀，无划痕，无起伏，边缘整齐光滑舌状血膜；在镜下看 RBC平铺互相接触而不重叠。l 薄血膜位置 ：薄血膜位于载玻片左 1/2处。 厚血片制作l 厚血膜 ： 用推玻片的一角，从取血部位刮取约 4微升左右血量，使血滴与平置的载玻片接触，接着用推玻片角由里向外一个方向旋转 24圈，涂成直径0.81cm大小、圆形厚血膜。l 厚血膜要求： 外观：圆形厚薄均匀，无划痕。镜下观察其厚度，以每油镜视野 5-10个 WBC为宜。过厚易于脱落，过薄达不到检出率要求。l 厚血膜位置： 位于玻片右半部分左 1/2处血膜编号血膜制成后，立即在玻片面上写上受检者的个人编号，以防差错；待薄血膜干后玻片头可粘贴患者信息，亦可用铅笔在薄血膜头写上血片种类的代号，依次顺序插入标本盒内。制片时机掌握（取血时间）l 采血时间： 现症病人和流调普查时可不考虑取血时机。但在诊断或需要某期疟原虫作标本时，则应掌握适宜的取血时机。 l 疟疾典型的临床表现： 分前驱期、发冷（寒战）期、发热期、出汗期和间歇期 五期 。 1.采血时间：P.v 发作后 10小时内 采血，各期（ R、 T、 S、 G）疟原虫均可查 见。P.f 发作时采血可查到 R；发作后 10天左右采血可查见 G。间日疟（取血时间）l 在 前驱期 （相当于肝内期疟原虫发育）因原虫密度太低，镜检多为 阴性 。l 发热期： 外周血中以 环状体（小滋养体） 为主，也可见到 裂殖体 ；l 发冷寒战期 （相当于红内期，成熟裂殖体涨破红细胞期），镜检多为 裂殖体和环状体 。l 出汗期 ：因原虫密度太低，镜检多为阴性。l 发作后数小时，间歇期 ：外周血中以 大滋养体 为主，形态较易辩认，为诊断的有利时机。发作 36-48h，可检出 裂殖体 。l 发作 1-2次后 ， 配子体 出现较多。恶性疟（取血时间）l 恶性疟： 较理想的取血时间是在发作后至 20h内。l 初发患者退热后常查不到原虫。l 末梢血中检出恶性疟 配子体 ，是在末梢血出现 环状体 之后的 10天左右。 制作 血膜 的注意事项1. 玻片清洗时，避免玻片碰撞、磨损。制作血膜的载玻片必须完全清洁而毫无油渍或污垢。制片时，手指只能持载片的边缘，不能接触玻片表面，以免油污使薄血膜产生空白区以及厚血膜脱落。作为推片的玻片边缘一定要平滑，才能使推出的血膜均匀一致。制作 血膜 的注意事项l 2. 刚涂制的血膜要平放在标本盒内，厚血膜未干前勿使标本盒倾斜，以免血膜倾向一侧，造成血膜厚薄不均，厚处不一溶血和着色而影响检查结果；晾干血膜时应注意防尘、防止苍蝇、蟑螂等昆虫吮吸血膜，干后应及时装入标本盒并盖严，新的木制标本盒需敞开放置一段时间，让木醇挥发后才能使用，以免厚血膜红蛋白被其固定，不能溶血或染色效果不佳。制作 血膜 的注意事项l 3. 血膜让其自然干燥，切忌用太阳晒或火烤，干透后才能用甲醇固定薄血膜。夏天标本尽可能 2448小时内固定染色；冬天也不能超过 72小时。放置时间越久，厚血膜越不易脱血，染色效果也差。若不能及时染色，膜血膜宜先用甲醇固定（ 13分钟）然后用过滤清水对厚血膜溶血，晾干固定后装入盒内盖严，待以后染色。厚薄血膜的优缺点及适用范围薄血膜： 用血量少 1-1.5ul，疟原虫的形态完整，便于疟原虫虫种的鉴定。为保证检测的敏感性，常耗时较多，不适用于大规模调查，常出现漏诊。厚血膜： 用血量较多 4-5ul，疟原虫胞浆和核有一定程度的固缩，较难识别；但须查范围小，节省时间，阳性检出率较高。血片的镜检原则1. 镜检疟原虫，必须对正常厚薄血膜中各种血细胞的形态、结构和染色性质能够识别。2. 镜检疟原虫，首先要会看薄血膜，在基本上掌握薄血膜中疟原虫形态后，才镜检厚血膜。3.镜检疟原虫一般只查厚血膜，薄血膜仅作为原虫分类时参考和血片编号之用。4.镜检疟原虫必须用油镜头配合 5X低倍目镜镜检，当发现疑难问题时可调换 10X目镜进行观察。5.检查时应从厚血膜的上缘开始，使血膜从上而下，自左至右，由右至左，一行接一行，一个视野稍叠一个视野顺序地查完整个血膜。 薄血膜中常见的血液细胞中性粒细胞嗜酸性粒细胞单核细胞淋巴细胞红细胞血小板疟原虫的生活史及其各发育阶段的基本特点疟原虫生活史l 人疟原虫完成其生活史需要人和按蚊两个宿主。l 1. 在按蚊体内进行 有性繁殖 ，按蚊是疟原虫的 终末宿主 。l 2. 在人体内进行 无性增殖 ，人是疟原虫的 中间宿主 。传播媒介l 中华按蚊疟原虫生活史 含成熟疟原虫子孢子按蚊 叮咬人 子孢子随唾液进入人体血液 约 30分钟 侵入肝细胞 裂体增殖 成熟裂殖体（含数以万计裂殖子） 肝细胞破裂 裂殖子侵入红细胞（开始 红细胞内期 发育） 发育 小滋养体（环状体） 摄食营养、发育 大滋养体 核分裂、发育 未成熟裂殖体 核进一步分裂 裂殖体（成熟） 被寄生红细胞破裂 裂殖子释放入血流一部分被巨噬细胞吞噬。 一部分再侵入红细胞，开始新的一轮发育。一部分裂殖子在红细胞内不再进行裂体增殖，而发育成雌、雄配子体。在蚊体内进行有性生殖。疟原虫生活史示意图疟原虫生活史示意图（红内各期原虫形态） 疟原虫生活史示意由生活史看出疟原虫对人体的主要 致病阶段 ：是红细胞内期的裂体增殖期；主要是指红细胞内期的无性体 小滋养体到成熟裂殖体，而不是红细胞内期的无性体 配子体；具有流行病学意义的疟疾 传染源 ：是外周血内有配子体的现症病人和带虫者。可见早期诊断治疗的重要性。复发 由肝内期迟发型子孢子引起。 人类疟原虫的基本特征人体疟原虫的基本结构l 人体疟原虫的基本构造：胞核、胞质和包膜疟原虫的结构与镜检l 疟原虫形态检查三要素：胞核、胞质和疟色素l 1 、胞、胞 核核 ： 即细胞核或染色质粒。在正常情况即细胞核或染色质粒。在正常情况下核呈鲜红色，呈圆形或不规则的颗粒状。核的下核呈鲜红色，呈圆形或不规则的颗粒状。核的结构致密，只有在个别发育阶段较为疏松。结构致密，只有在个别发育阶段较为疏松。l 2、胞、胞 质；质； 被染成蔚蓝色或深蓝色，随着虫体被染成蔚蓝色或深蓝色，随着虫体发育长大，细胞浆逐渐增多。发育长大，细胞浆逐渐增多。l 3、疟色素；颜色和颗粒的形状，因疟原虫种类、疟色素；颜色和颗粒的形状，因疟原虫种类而异。而异。感染人的疟原虫有四种 : l恶性疟原虫 P. falciparum l间日疟原虫 P. vivaxl三日疟原虫 P. malariae l卵形疟原虫 P. ovale 恶性疟 P.falciparum 分布热带、亚热带，是非洲的重要疾病 我国流行区域为云南省和海南省 四种疟原虫中致病力最强，无免疫力者 感染后出现急性症状 ,不及时治疗可危及生命间日疟 P.vivax 间日疟原虫分布于 我国大部分地区 ，主要是中部地区。 病程良性 , 有复发。 遍布全球温带地区及大片热带地区。在热带非洲，特别是西非则很少见。三日疟 P.malariae l 遍及热带和亚热带地区，特别是东、西非洲，圭亚那及印度部分地区，呈片状、块状分布l 三日疟在 我国非常少见 ，只在南方广西有过散在报告l 无复发卵形疟 P.ovale又称蛋形疟原虫 ,主要分布非洲。太平洋地区、缅甸、东南亚有散在报告l 在 我国已基本消灭l 症状与间日疟相似 , 有复发1. 红细胞通常涨大 2. 薛氏点明显 3. 成熟环状体粗大4. 滋养体胞浆有阿米巴样伪足5. 血片中可见各期的原虫形态6. 成熟裂殖体约含 12-24个裂殖子间日疟（ P. vivax ）鉴定要点1. 红细胞不涨大2. 环状体钎细 , 一个红细胞内可有几个环状体 ,环状体内可有 2个核 3. 环状体可贴在红细胞边缘 4. 血片中没有其他发育期滋养体 5. 配子体呈新月形或腊肠形6. 成熟裂殖体约含 6-32个裂殖子7. 可出现茂氏点恶性疟（ P.falciparum）鉴定 要点1. 红细胞不涨大或略小2. 环状体可呈方形3. 胞浆不活跃呈带状形 4. 成熟滋养体呈菊花状 ,内含 6-12个裂殖子 5. 核可能出现在环状体边缘三日疟（ P.malariae）诊断要点卵形疟（ P. ovale）诊断要点1. 红细胞涨大 2. 常见慧星状 (也称齿轮状 )3. 环粗大 4. 薛氏点明显 5. 成熟滋养体类似三日疟原虫但更粗大6. 成熟裂殖体约含 4-12个裂殖子种 周围血中发育阶段红细胞形态 疟原虫形态大小 点彩 胞浆 疟色素 裂殖子数恶性疟原虫环状体配子体正常 常见茂氏点环状体钎细，常见个核粗黑，配子体中明显 6-32平均 = 10-24间日 疟原虫各期滋养体裂殖体和配子体涨大 ,可达正常的 1.5-2 倍薛氏点可出现阿米巴样滋养体，浅蓝色，活泼金棕色不明显 12-24平均 = 16卵形 疟原虫各期滋养体裂殖体涨大 ,可达正常的 1.25-1.5倍薛氏点可出现卵圆形滋养体，蓝色较深，核较大深棕色明显 4-12平均 = 8三日 疟原虫各期滋养体裂殖体和配子体正常 西门氏点少见圆形，蓝色深，核紧缩，滋养体带状深棕色，粗明显 6-12平均 = 8呈菊花状 薄血膜中 P.v 的形态环状体 (P.v.R)P.v.R约占寄生红细胞的 1/3，很少见到一个红细胞寄生2个环状体和一个环状体有 2个核。 P.v.R大滋养体 (P.v.T)l 经 8 10小时，虫体增大，胞质增多，伸出伪足。l 出现黄褐色的疟色素。l 红细胞胀大，变形，颜色变淡，并出现数量较多，淡红色的小点，称薛氏小点成熟裂殖体（ P.v.S）红细胞 ： 胀大，褪色，可见薛氏小点。大 小 ： 个体较大。胞浆和核 ： 裂殖子 1224个平均 16个，排 列不规则，核红色，胞浆浅兰色。色 素 ： 黄褐色常集于疟原虫的一边。间日疟原虫雄配子体(P.v.G) 间日疟原虫雌配子体 (P.v.G)l 虫体较小，占满胀大的红细胞l 胞质浅蓝l 核大疏松，淡红色，多位于虫体的中央。l 疟色素分散 l 虫体较大，占满胀大的红细胞l 胞质致密，色深蓝l 核小致密，深红色，多位于虫体一侧l 疟色素分散 间日疟大滋养体 (T)与配子体 (G)的区别T G虫体： 较小 较大胞浆： 边缘不规则可见空泡 边缘规则无空泡 核： 较小、不规则 较大有不染色带色素： 较少、分布不匀， 色素分布均匀T GP.V 与 P.f 鉴别报告1、当血膜中发现环状体时，且数量较多，环纤细，此时应注意观察全血膜有无间日疟的其他期原虫，如无可判定为 恶性疟 。2、当血膜中发现间日疟原虫时，此时应注意观察全血膜有无恶性疟的配子体，如无可判为 间日疟 ，如有可判为此两型疟原虫 混合感染 。3、当全血膜中出现少数环状体时，且形态不典型，则最好间隔数小时后再取血检查，如此时无间日疟则可判为定 恶性疟 。 镜检 （ 1）一般只查 厚片 ，薄片仅作为疟原虫分类参考和编号用。（ 2）可先以 油镜头配合 5X低倍目 镜镜检，有疑问时可调换 10X目镜 进行观察。（ 3）检查时应从厚血膜的上缘开始，按下图示意的顺序方向，视野稍叠视野地查完整个血膜。薄血膜疟原虫形态间日疟 环状体感染的红细胞： 胀大不明显，基本正常。虫体大小： 较大，约为红细胞直径 1/3。胞浆： 环状，浅蓝色。核： 红色，一个，偶有二个。疟色素： 无。间日疟间日疟环状体 （薄血膜） 间日疟滋养体（薄血膜） 薄血膜间日疟大滋养体形态感染的红细胞： 胀大褪色，出现形状大小相等、分布均匀、数目较多、鲜红色的薛氏小点。虫体大小： 较大。胞浆： 不规则，浅蓝色，出现阿米巴伪足，有空泡。核： 红色，一个。疟色素： 有，细小杆状，黄褐色，分布不均匀。间 日 疟 大 滋 养 体虫体不规则，较大；阿米巴样空泡明显；疟色素细小，黄褐色。红细胞 ： 胀大，褪色，可有薛氏小点。胞浆 ： 较不规则，空泡小或消失，浅蓝色 。核 ： 红色，分裂为二个以上。色素 ： 黄褐色，分布不均匀。间日疟 未成熟裂殖体薄血膜疟原虫形态间日疟未成熟裂殖体 间日疟成熟裂殖体红细胞 ：胀大，褪色，可见薛氏小点。大小 ：个体较大。胞浆 ：裂殖子 1224个，通常为 1618个，排列不规则，胞浆浅蓝色。核 ； 核红色。疟色素 ：黄褐色，常集于疟原虫的一边。间日疟雄（小）配子体 形态形状大小 ： 圆形，虫体较大。胞浆 ： 浅蓝色。核 ： 一个，较大，疏松，位于中央，浅红色，周围有明显不着色带。疟色素 ： 黄褐色，散在分布。 间日疟雌（大）配子体形态形状大小 ： 圆形或椭圆形，较大。胞浆 ： 深蓝色。核 ： 一个，较小，深红色，常偏于一边，核周可见明显不染色带。疟色素 ： 黄褐色，均匀散在，数目较多。间日疟原虫雌配子体间日疟原虫雄配子体间日疟原虫 恶性疟原虫厚血膜集中视野各期疟原虫形态比较薄血膜中恶性疟各期疟原虫的形态结构特点薄血膜疟原虫形态恶性疟环状体感染的红细胞： 大小正常 ,颜色较深。虫体大小： 较小，约为红细胞直径 1/5-1/6。胞浆： 蓝色，环状纤细 ,有时位于红细胞的边缘。常见多个原虫同寄生于一红细胞的现象。核： 红色一个 ,常有二个。疟色素： 无。恶性疟原虫 -环状体环纤细 ,约为 RBC直径的 1/6， RBC不胀大核 1个，但 2个常见，红细胞常含 2个以上原虫恶性疟大滋养体受感染红细胞： 大小正常，颜色较深，可出现较粗、大小不一、分布不匀、数目较少红色茂氏小点。虫体大小： 较小。胞浆： 蓝色，圆形，坚实，体积小。核： 一个，红色。疟色素： 较细的黑褐色颗粒，常集成块。 恶性疟大滋养体恶性疟未成熟裂殖体红细胞： 大小正常，颜色较深，可有茂氏小点。大小： 较小。胞浆： 规则，圆形或卵圆形，蓝色。核： 分裂为二个以上，红色 。疟色素： 黄褐色颗粒，常集成黑褐色团块。恶性疟成熟裂殖体红细胞 ： 大小正常，颜色 较深，可见茂氏小点。大小 ： 虫体较小。胞浆和核 ： 裂殖子 832 个，通常为 818个， 排列不规则，核红色，胞浆蓝色。色素 ： 黑褐色，集中于中央或一侧。恶性疟成熟裂殖体 l 裂殖子 8 32个，通常 818个，排列不规则l 疟色素集中成团块状l 虫体占红细胞体积的 2/3至3/4 恶性疟雌（大）配子体形态形状 ： 新月形，两端稍尖。胞浆 ： 深蓝色。核 ： 一个，较小，致密，深红色，位于中央，核周可见透明不染色带。疟色素 ： 黑褐色，密布于核的周围。恶性疟雄（小）配子体形态形状： 腊肠形，两端钝圆。胞浆： 浅蓝色或淡紫红色。核： 一个，较大，疏松，位于中央，浅红色，核周可见不染色带。疟色素： 黑褐色，松散分布于核周围。（未）成熟雌配子体与 成熟大滋养体的形态鉴别虫体大小 :几乎充满被寄生的红细胞l 核 :一个，较大且致密，周围有一圈空白的不染色带l 胞浆 :边缘清楚，不含空泡l 疟色素 :颗粒较多较粗，均匀散在虫体大小 :不超过被寄生红细胞的 3/4l 核 :一个，延长呈带状，周围无明显的不染色带l 胞浆 :边缘不整齐，多有空泡l 疟色素 :颗粒较少较细，分布不均匀厚血膜中疟原虫的形态厚血膜由于用血量较多，涂制的血膜小，红细胞重叠且干燥慢，致使 虫体皱缩，空泡消失，胞浆变形 ，各期疟原虫的体积都 略微缩小 ，其中只有大、小滋养体的形态有较大改变，而裂殖体和配子体的形态则无明显变化 。厚血膜环状体体形态环状体： 胞浆呈环状或向核的一侧或两侧收缩，使环的中间断裂，或围绕核。 间日疟原虫 的环较大，常呈分号 “； ”和感叹号“！ ”状； 恶性疟原虫的环纤细，常呈冒号“： ”、飞鸟 “ . ”、V状和断环状。 间日疟小滋养体恶性疟小滋养体恶性疟原虫厚血膜厚血膜 间日疟大滋养体形态间日疟大滋养体 呈阿米巴样运动，胞浆常断裂几块或缩成圆形，核和疟色素均被包在胞浆之中，着色深，只隐约可见红色的核和黄绿色的疟色素。胞浆可皱缩断裂成几个块状，大小不一，似互不连接。核位于胞浆之中或外边。疟色素分布不均匀。有些仅见胞浆和疟色素而核看不清楚。 大滋养体厚血膜 恶性疟大滋养体形态恶性疟原虫大滋养体 与薄血膜形态相似，常呈圆形，体小结实，疟色素细小，金黄色，结成块状后，呈黑褐色。厚血膜 间日疟配子体形态l 间日疟原虫的配子体呈圆形或卵圆形，除虫体略缩小且着色深外，均与薄血膜相似。 雄配子体 核大，疏松，圆形或呈星状，胞浆较少，着色淡，疟色素颗粒大，数量较多，散在分布。l 雌配子体 与圆形成熟的大滋养体相似，但配子体疟色素颗粒粗大，多而散在分布。厚血膜 恶性疟配子体形态配子体 呈新月形或腊肠形，如血膜干燥较慢，则可缩成圆形 ，核居中，疟色素围在核周，外围一圈胞浆。此外，还可见配子体的胞浆部分或全部消失，只留下核和疟色素，或核和胞浆均消失，只留下一些疟色素。 1. 红细胞通常胀大 2. 薛氏点明显 3. 成熟环状体粗大4. 滋养体有阿米巴样伪足5. 可见不同发育期的原虫间日疟（ P. vivax ）鉴定要点1. 环状体钎细 , 红细胞不涨大2. 一个红细胞内可有几个环状体 3. 环状体内可有 2个核 4. 环状体可贴在红细胞边缘 5. 血片中没有其他发育期滋养体 6. 配子体呈新月形或腊肠形 7. 可出现茂氏点恶性疟（ P.falciparum）鉴定要点间日疟原虫形态 恶性疟原虫形态 两种疟原虫薄血膜形态鉴别 (吉氏染色 )l 间日疟原虫 l 被寄生红细胞 大小形状 胀大 l 颜色 褪色 l 斑点 薛氏点出现稍晚，红色，细小数多 l 小滋养体 大小 较大，约占红细胞直径的 1/ 3 l 核 1个 l 胞浆 较薄 l 色素 无 l 大滋养体 大小 较大 l 核 多见 1个 l 胞浆 阿米巴样，常含空泡 l 色素 黄褐色，细小，杆状，散在分布l 未成熟裂殖体l 大小 较大 l 核 2个以上 l 胞浆 圆形或不规则，空泡消失 l 色素 黄褐色，分布不匀 l 成熟裂殖体 大小 大于正常红细胞 l 裂殖子 12 24个，常为 16 18个，排列不规则，较大 l 色素 黄褐色，常聚集一侧l