活菌微生态制剂对黄曲霉真菌的生长抑制及拮抗研究.doc

精品文档微生态制剂对黄曲霉真菌的生长抑制和拮抗研究 【摘要】：黄曲霉及其毒素危害巨大，是饲料食品中的主要污染源之一。乳酸菌作为益生菌，在食品防霉去毒的方法已获得应用，这是运用生物控制的一个成功范例；芽孢杆菌也已经可以从海洋生物中提取并应用于抑制黄曲霉真菌的生长；黑曲霉因为具有良好的分泌多种降解酶的能力，并且生产的酶制剂、有安全、可靠、不产生毒素的特点，是公认安全(GRAS)的微生物，也是科技工作者用生物控制方法来降解黄曲霉毒素的一种有效微生物。【关键词】：微生态、中药、益生素、发酵、黄曲霉真菌 乳酸菌 芽孢杆菌 黑曲霉 生长抑制霉菌毒素污染造成全世界每年粮食的损失达数千亿美元，而黄曲霉毒素因其对人、畜肝脏的剧烈损害而名列毒性之首，被列为极毒。黄曲霉菌( Aspergillus flavus) 产生的黄曲霉毒素( aflatoxin)是目前发现的毒性和致癌性最强的化学物质之一，被世界卫生组织认定为1A 级危险物( WHO，1993)。黄曲霉毒素( AFT) 主要是粮油食品上常出现的黄曲霉( Aspergilluflavas Link ) 和寄生曲( Aspergillus ParasiticasSpeave) 产生的种具活性的、有毒的次级代谢产物。黄曲霉可通过产生孢子进行传播，侵染植物、植物产品各种食品和饲料等。它对农作物的产量，人、兽和禽类的健康构成很大威胁。凡是含淀粉多的食品，如玉米、花生、大豆、大米、小麦、面粉等最易受到黄曲霉及其毒素的污染，果仁类也常受污染。因此采取何种措施来预防黄曲霉的生长与产毒是根本措施。目前的防霉措施是利用良好的农业生产工艺从田间防霉，在收获与保藏中采取防霉措施，此方法涉及多个步骤，操作起来较困难。此外，也有用化学防霉剂，多为化学合成物质，人们对其长期应用的安全性尚存疑虑。因此，对黄曲霉及其毒素的生物防治，目前国内外的研究方向主要是利用植物提取物和微生物的次生代谢产物来获得具有抗菌或降解毒素特性的物质。研究发现，多种植物提取物，如山苍子精油、百里香油、海马齿香精油、玫瑰精油等对黄曲霉生长以及毒素的产生有较强抑制作用。目前发现能有效防治黄曲霉的微生物主要有乳酸菌、芽孢杆菌以及黑曲霉等。1、 乳酸菌对黄曲霉真菌的生长抑制作用 从健康动物体内分离抗黄曲霉活性的乳酸杆菌， 不仅能添加在饲料中， 起到生物防霉的作用， 并且能在动物体内定植， 为进一步研究开发饲料生物防霉剂提供菌种资源。 黑龙江省微生物研究所研究人员做了乳酸杆菌对黄曲霉真菌的生长抑制作用的研究实验。1.1 对抑制霉菌生长试验：分别用乳酸杆菌的全菌液或离心上清液( 3000 r/min， 20 min) 1 mL 涂布PDA 培养基， 待液体完全吸收后， 在培养基的中心接种20 L 黄曲霉孢子悬液( 1107 cfu/mL) ，同时设未涂布乳酸杆菌的空白PDA 培养基为对照组， 接种20 L 黄曲霉孢子悬液， 28 培养4d，分别测量菌落大小， 计算乳酸杆菌对霉菌生长的抑制率。霉菌生长的抑制率(%) =( 对照组菌落直径- 试验组菌落直径) /对照组菌落直径100。每个处理设3 个重复组， 各试验重复3 次， 以3 次试验结果平均值进行分析。1.2 对黄曲霉孢子萌发影响试验： 设2 个处理组和2 个对照组。处理1： 将1 mL 乳酸杆菌培养液( 1109 cfu/mL) 和50L 黄曲霉孢子悬液( 1105 cfu/mL) 同时接种到5mL 新鲜MRS 液体培养基中。处理2: 将0.5 mL黄曲霉孢子悬液( 1105 cfu/mL) 加入到5 mL 乳酸杆菌培养液中( 1109 cfu/mL) 。对照组1: 用乳酸调MRS 肉汤与乳酸杆菌培养液pH 相同， 然后将500 L 和50 L 黄曲霉孢子悬液分别接种到调好pH 值的MRS 肉汤中， 作两种不同浓度孢子悬液的对照组。对照组2: 将500 L 和50 L 黄曲霉孢子悬液分别接种到空白的MRS 肉汤中， 不调pH 值。2 个处理组和2 个对照组均在28 培养， 分别于第6、18、24 h 取不同处理组0.1 mL 涂布PDA 平板， 28 培养5 d， 进行孢子计数。以孢子未萌发或萌发数量显著减少判断为乳酸杆菌对其有抑制作用。设对照组2 的生长率为100 %， 计算处理组和对照组1 的抑制率， 计算公式如下:抑制率(%) =对照组2 孢子萌发数- ( 处理组或对照组1 孢子萌发数) /对照组2 孢子萌发数100。1.3 霉菌生长抑制试验结果：本试验中， 鸡源乳酸杆菌B30 以及牛源乳酸杆菌BN3 是对黄曲霉菌生长有明显抑制作用的乳酸杆菌。由表1 可见，与对照组相比， BN3 和B30 在培养48 h 后， 除BN3 上清液抑菌效果不佳外， 其他数据均显示出对黄曲霉的生长有较明显的抑制效果， 并且随着培养时间的增加， 霉菌生长速度同样受到抑制， 而其余乳酸杆菌的抑菌现象均不明显。另外， 乳酸杆菌的全菌液与离心上清液相比而言， 全菌液的抑菌效果优于上清液。 表1乳酸杆菌全菌液和离心上清液对黄曲霉生长的抑制作用 注：NR表示无结果。1.4 乳酸杆菌对孢子萌发影响试验结果：结果见表2。从表2 可以看出， 乳酸杆菌BN3 和B30对孢子的萌发均起到了抑制的作用，并且在孢子与乳酸杆菌共同培养6 h 就出现了抑菌现象。与MRS 空白对照组相比， 用乳酸调整pH 值后， 乳酸所形成的低pH 环境同样会作用于孢子， 使其萌发受到影响。然而其抑制作用仍不如乳酸杆菌对霉菌孢子的抑制作用。乳酸对照组对孢子萌发的抑制作用随时间的增加呈抛物线分布， 在18 h 的抑制作用高于6 h 和24 h。处理组1 与处理组2相比， 处理组2 的抑菌效果更好， 即抑制孢子萌发率更明显。 表2 乳酸杆菌BN3 和B30对黄曲霉孢子萌发的抑制作用注: G1 为处理组1， G2 为处理组2; CK1 为对照组1。1.5 结果分析：1.5.1 在对黄曲霉生长抑制试验中：发现乳酸杆菌全菌液的抑制效果比乳酸杆菌上清液更好。其原因可能是，除乳酸杆菌全菌液中本身含乳酸和一些抑菌代谢产物形成抑菌现象外， 乳酸杆菌细胞在被接种到PDA 培养基中后与霉菌间产生了多因素拮抗作用，故比乳酸杆菌离心上清液的抑霉菌效果好。1.5.2 乳酸杆菌对孢子萌发影响试验结果显示：处理组1 与处理组2 相比， 处理组2 的抑菌效果更好， 其原因可能是接种孢子时乳酸菌全菌液浓度较处理组1 高出近4 倍， 在最初的一段时间内就达到了抑制霉菌孢子萌发的作用。另外， 乳酸杆菌代谢过程中会产生大量的乳酸， 使环境中的pH值降低， 抑制黄曲霉生长。乳酸所形成的低pH 环境有降低黄曲霉孢子萌发率的作用， 但接种了乳酸杆菌的处理组表现出更明显的抑制作用。这说明，对黄曲霉孢子萌发抑制作用的产生不仅在于低pH 环境的影响， 还有乳酸杆菌代谢产物和微生物间互相拮抗等多因素同作用的结果。2、芽孢杆菌抑制黄曲霉生长2.1 试验方法：采用滤纸片扩散法从海洋中分离筛选出1 株抑制黄曲霉活性高的微生物，利用16SrDNA 特异性扩增技术对其菌种进行鉴定, 并研究其对黄曲霉菌丝延长、孢子萌发和毒素合成的影响，用Beaco n黄曲霉毒素检测试剂盒测定黄曲霉毒素含量。2.2 试验结果： 该菌株为一株海洋巨大芽孢杆菌( Bacillusmegater ium) ，其菌体对黄曲霉菌丝延长、孢子萌发和黄曲霉毒素生物合成都有明显地抑制作用， 1 109CFU mL- 1菌体对黄曲霉孢子萌发的抑制率达87%， 1 108 CFU mL- 1 菌体对黄曲霉毒素合成的抑制率可达50. 75%。初步认为其抑制机制是该海洋巨大芽孢杆菌可产生某种次级代谢产物来抑制黄曲霉孢子萌发和菌丝延长。 表3 巨大芽孢杆菌对黄曲霉孢子萌发的抑制作用注: * 同列数据后的不同小写字母表示在P 0. 05 水平差异显著； n= 3，数据用平均值% SD 表示。 从表3中可以看出,巨大芽孢杆菌能极显著地抑制黄曲霉产黄曲霉毒素P0.01抑制50.75% . 越来越多的研究表明, 黄曲霉的次级代谢产物( 包括黄曲霉毒素对黄曲霉的生长非常重要, 其中, 黄曲霉毒素的合成与黄曲霉孢子形成有密切联系, 抑制黄曲霉毒素的产生, 往往也会抑制黄曲霉孢子的形成 ；因此， 认为该株海洋巨大芽孢杆菌通过抑制黄曲霉毒素等次级代谢产物的合成来抑制黄曲霉的生长；同时这种抑制的产生是因为该株海洋巨大芽孢杆菌会抑制黄曲霉次级代谢产物调节基因和黄曲霉毒素合成基因的表达。如L aeA、af lR 和af lS 等。3、 黑曲霉对黄曲霉生长的抑制3.1 试验方法：采用90 2.6 1013N+/cm2 注入黑曲霉筛选能抗黄曲霉(Aflavus)生长的突变菌株，以利发酵中控制被黄曲霉污染的原材料的再污染。进行产毒黄曲霉与被离子注入的黑曲霉混合对峙、原黑曲霉菌株与黄曲霉单独培养生长及混合对峙培养实验。3.2 试验结果：经离子注入的菌株及未注入菌株均对黄曲霉产生抑制作用，但后者仅有微弱抑制，前者不仅表现出几乎不能使黄曲霉生长，且已长出的黄曲霉菌丝体较瘦小，并呈灰白色。从培养基中提取物检验结果显示，黄曲霉组表现出有较明显的荧光反应，而黑曲霉菌株对峙培养物提取物中有微弱的荧光反应，其黑曲霉突变株对峙培养物未见荧光反应检出。这表明黑曲霉原菌株虽然能对黄曲霉