《生物检定法》PPT课件.ppt

生物检定法 生物检定法定义 p103 生物检定属生物法分析 是利用药物对生物体 整体动物 离体组织 微生物等 的作用以测定其效价或生物活性的一种方法 它以药物的药理作用为基础 统计学为工具 选用特定的实验设计 在一定条件下比较供试品和相当的标准品所产生的特定反应 通过等反应剂量间比例的计算 从而测得供试品中活性成分的效价 由于生物差异的存在 生物检定结果误差较大 重现性比较差 需要控制的条件较多测定费时 计算繁琐 所以 生物检定主要用于无适当理化方法进行检定的药物 补充理化检验的不足 由于科学技术的发展 一些品种的生物检定可能被理化检验代替 而一些新药的生物检定方法又在不断建立 生物检定包括整体和离体测定整体测定 直接反映药品对生物的综合作用 但需要动物 需用供试品量多 耗时长 精密度和灵敏度较差 离体测定 个体差异小 实验时间较短 精密度和敏度较高 能在一定程度上保留药理作用特性 尤其适用于微量激素的测定 缺点是不一定能反映供试品在整体的作用 一 生物检定的应用范围 1 药物的效价测定对一些理化方法不能测定含量或理化测定不能反映临床生物活性的药物 可用生物检定来控制药物质量 例如洋地黄 胰岛素 肝素 绒促性素 缩官素等的生物测定法 以及多种抗生素的微生物测定法 有些天然药物 生物制品往往因结构复杂 而且往往又是由结构类似 比例不定的多种成分组成 很难用理化方法反映其生物活性 另一些药物 尤其是一些激素类药物 其结构相近相近 而生物活性不同 还有些药物虽可用理化方法测定含量 但含量完全不能反映效价 因此这些药物的质量控制都离不开生物检定 2 体内微量生理活性物质的测定一些神经介质 激素等微量生理活性物质 由于其很强的生理活性 在体内的浓度很低 加上体液中各种物质的干扰 很难用理化方法测定 而不少活性物质的生物鉴定法由于灵敏度高 专一性强 对供试品稍作处理即可直接测定 3 中药质量的控制中药成分复杂 大部分中药的有效成分尚未搞清 难以用理化方法加以控制 一部分中药可用一些以其疗效为基础的生物测定方法来控制其质量 4 某些有害杂质的限度检查如农药残留 热原质 抗生素及生化制剂中降压物质的限度检查等 标准品 生物检定法 一般需要应用标准品 以降低由于生物差异造成的实验误差 使在不同实验室中检定同一药物时 即使实验条件或影响因素不尽相同 但由于同时作用于标准品和供式品 在比检定中这些影响因素可以互相抵消 它们之间的反应强度比例保持不变这样就大大提高了生物检定的可靠性和精密度 药典所采用的标准品 为参照国际标准品制备的标准品 由中国药品与生物制品检定所发放 单位效价相当于国际单位效价 标准品有均匀 稳定而持久的性质 应存放于除去氧气的干燥器中 低温处避光贮放 效价检定的基本内容 一 生物反应是生物检定的基础被测物特有的生物学作用都可作为生物法分析的基础 例如生长素具有促进生长 蛋白质同化 脂肪动员作用 可致糖尿 血酮 影响盐类代谢 已据之设计出多种的生长素的生物学定量法 见书上表5 1 二 剂量与反应关系 生物检定是利用药物不同剂量引起生物体反应程度的变化以进行药物效价测定的 要计算效价 首先要研究剂量与反应之间的关系 在生物检定中 剂量与反应间一般都是曲线关系 可通过各种坐标转换的方法 使剂量与反应间呈直线关系 即数学表达式为简单的直线方程 y a bx 最便于处理和应用 生物反应基本上可分为以下两种类型 即质反应和量反应 1 质反应当一定剂量的药物注入动物体内后 观察某一反应或反应的某一特定程度出现与否例如死或不死 惊厥或不惊厥 只有出现与不出现两种情况 故不能用量来表示个体的反应程度 只能用一组动物中出现正 或负 反应的百分率来表示 如死亡率 惊厥率 这类称质反应 在质反应中 将动物分组 分别给以不同剂量 通过调节剂量 使最大剂量组接近但不全部产生阳性反应 最小剂量组接近但不全部产生阴性反应 则各组阳性反应动物的百分率随剂量的增加而递升 剂量与反应率之间的关系是一条长尾的 肩斜 形曲线 如将剂量转换为对数 反应率转换为适当的函数后则呈直线关系 常见的转换方法有概率单位logit 角度等 2 量反应 药物对生物体所引起的反应随着药物剂量的增加产生的量变可以测量者 称为量反应例如血压的变化值 血糖浓度 组织器官重量的增减 抑菌圈直径的大小等 时反应虽有某些特殊性 但基本上仍可属于量反应 它是观察某一反应或反应的某种程度出现所需的时间 例如血液的凝结时间 动物生存时间等 三 对比检定 生物检定的目的是将供试品 T 和已知效价的标准品 S 进行效力对比 根据它们的反应程度 求供试品的效力相当于标准品效力的倍数 再从中计算出供试品的效价 因此它属于对比检定 胰岛素生物检定法 胰岛素是从哺乳动物胰8的胰岛口细胞中提取的一种蛋白类激素 为六方系结晶 相对分子量6000 易溶于80 乙醇和酸性水溶液 在pH2 5的酸性溶液中比较稳定 胰岛素主要药理作用是降低血糖 大剂量注入可引起惊厥 休克甚至死亡 胰岛素生物检定法 具体方法 本品效价测定采用生物检定法 基于其有降低血糖的作用而采用小鼠血糖法 小鼠惊厥法 家兔血糖法 长效制剂的延效作用只能用血糖法 肝素生物检定法 肝素系由健康牛 猪 羊等食用动物的肺 肝 肠粘膜中提取的有延长凝血时间作用的粘多糖类物质 为白色或淡黄色无晶形粉末 有吸湿性 在水中易溶 本品相对分子质量及抗凝血效价随动物种属和脏器来源不同而有差异 相对分子质量为6000 20000 由肝肺提出的肝素 每mg不得低于110U 由肠粘膜提出的肝素 每mg不得低于140U 本品在中性及微碱性中较稳定 肝素生物检定法 具体方法 肝素的生物检定法是根据对数剂量与血凝时间的对数呈线性关系而设计的 常用的有兔全血法 硫酸钠兔全血法 此外还有使用牛 羊血法测定肝素效价的方法 抗生素的微生物检定法 由于抗生素多为结构复杂的多组分物质 异构体多 且不稳定 容易产生降解杂质故各国药典均以微生物检定法为主要含量测定法 因为抗生素药品的医疗作用主要是它的抗菌活力 而微生物检定法正是以抗生素的抗菌活力为指标来衡量抗生素效价的一种方法 其测定原理与临床要求相一致 能直接反映抗生素医疗价值 因此一直是各国药典所采用的主要测定方法 微生物检定法测定抗生素效价 一般可分为 稀释法比浊法琼脂扩散法以琼脂扩散法应用最为广泛 为目前国际上测定抗生素效价的通用方法 琼脂扩散法 管碟法的原理 琼脂扩散法 亦称管碟法 系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用 采用量反应平行线原理的设计 比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小 以测定供试品效价的一种方法 将不锈钢小管安置在摊布特定试验菌的琼脂培养基平板上 当小管内加入抗生素溶液后 抗生素分子就随溶剂向培养基内呈球形扩散 同时将培养基平板置培养箱中培养 试验菌就开始繁殖 抗生素分子在琼脂培养基中的浓度 随离开小管的距离增大而降低 当抗生素分子扩散到T时间 这时琼脂培养基中抗生素的浓度恰高于该抗生素对试验菌的最低抑菌浓度 试验菌的繁殖被抑制而呈现出透明的抑菌圈 在抑菌圈的边缘处 琼脂培养基中所含抗生素的浓度即为该抗生素对试验菌的最低抑菌浓度 将已知效价的抗生素标准溶液与未知效价的供试品溶液在同样试验条件下进行培养 比较两者抑菌圈的大小 由于同质的抗生素对特定试验菌所得的两条剂量反应曲线为平行直线 故可根据此原理 设计一剂量法 二剂量法及三剂量法 中国药典 只收载了二剂量法和三剂量法 等 从而可以较准确地对比出供试品的效价 影响效价测定的因素 1 试验菌种2 培养基3 双碟的制备4 双碟的培养温度和时间 生物制品的效力检定 生物制品的效力 从实验室检定来讲 一是指制品中有效成分的含量水平 二是指制制品在机体中建立自动免疫或被动免疫后所引起的抗感染作用的能力 对于诊断用品 其效力则表现在诊断试验的特异性和敏感性 制品的质量 主要是从效力上体现出来 无效的制品 不仅没有使用价值 而且可能给防疫 治疗或诊断工作带来贻误疫情或病情的严重后果 因此 必须十分重视制品的效力检定 有的制品必要时还要进行人体效果