《疫组化显色系统》PPT课件.ppt

免疫组化显色系统 VisualizationSystemsofImmunohistochemistry IHC 免疫组化技术原理 用标记物或显色物标记抗体或抗原通过免疫学中的抗原与已知抗体反应来检测组织或细胞内的抗原成分免疫组化染色是一项综合性技术组织材料的准备免疫组化染色前处理免疫组化染色 一抗 显色系统 免疫组化原理图标注解 一抗1 一抗2 抗兔二抗 抗鼠二抗 组织抗原1 抗原2 过氧化物酶 碱性磷酸酶 双染阻断剂 显色剂 棕色 显色剂 红色 葡聚糖骨架分子 回顾过去 直接法 二步间接法 三步间接法 酶免疫复合物法 链亲和素 生物素法 ABC 目前常用的显色系统 一步法 EPOS EnhancedPolymerOne StepStaining 二步法 EnVisionSystems双染 GeneralDoublestain三步法 LSAB LabeledSstreptavidin biotin 催化放大系统 CSA CatalyzedSignalAmplicationSystem 动物研究试剂盒 ARK AnimalResearchKit 一步法EPOS 原理 在一抗上通过多聚骨架标记过氧化物酶 即一抗上已标记过氧化物酶 这种一抗与抗原结合后即可直接显色 多聚骨架分子 特异性一抗 组织抗原 过氧化物酶 一步法EPOS 主要实验流程 组织片脱蜡 水化 阻断 S2001 TBS冲洗 S1968 一抗 HRP U TBS冲洗 S1968 显色剂DAB或AEC K3467或K0697 水漂洗 素木精复染 S3309 一步法EPOS 特点 一抗孵育后直接显色即用型试剂快速 一步 完成敏感性较差昂贵使用对象 要求快速出结果的免疫组化实验对象 二步法EnVision 原理 在葡聚糖大分子上标记二抗及酶 将传统的二抗和三抗 酶 连接在一起 形成一个复合物EnVision 两步孵育完成免疫组化 二步法EnVision 原理图 一抗与抗原结合 EnVision二抗复合物与一抗结合 二步法EnVision 主要实验流程 阻断内过氧化酶 S2001 TBS冲洗 S1968 一抗孵育 Mo Rb EnVision Mo K4001Rb K4003 TBS冲洗 S1968 显色剂DAB或AEC K3467或K0697 苏木精复染 S3309 TBS冲洗 S1968 二步法EnVision 特点 二抗及酶通过葡聚糖连成一个大分子试剂 避开了传统的生物素与链亲和素结合 不受内源性生物素干扰 即用 方便 快速 两步 敏感性强 背景低 是目前最理想的免疫组化显色系统使用对象可向所有做免疫组化的用户推荐 EnVision二步法双染 原理 与EnVision二步法原理相同 只是为达到在同一组织上标记两种抗原 必需用两种动物来源的一抗 常用抗小鼠和兔 分别配相应的EnVision 二抗 再用两种颜色的显色剂显色 EnVision二步法双染 原理图 鼠一抗接抗原1 鼠EnV HRP接抗鼠一抗 DAB 显色剂1 双染阻断剂 兔一抗接抗原2 兔EnV AP接抗兔一抗 FastRed 显色剂2 EnVision二步法双染 主要实验流程 阻断内过氧化酶 S2001 TBS冲洗 S1968 一抗 1Mo 孵育 TBS冲洗 S1968 EnVision HRP 1Mo TBS冲洗 S1968 显色剂1DAB K3467 蒸馏水冲洗 双染阻断剂 Kit含 一抗 2Rb 孵育 TBS冲洗 S1968 EnVision AP 2Rb TBS冲洗 S1968 显色剂2FastRead K0597 蒸馏水冲洗 苏木精复染 S3309 EnVision二步法双染 特点 即用 方便 快速 省时 敏感性强 背景低 在同一组织切片上 用两种不同标记物标记两种不同的抗原 使用对象需在同一张切片上标记两种抗原者主要是形态学科研人员 三步法LSAB LabeledStreptavidin biotin 原理 应用生物素标记二抗与过氧化物酶或碱性磷酸酶标记链亲和素 Streptavidin 的亲和作用 连接一抗及抗原 形成大分子 再通过相应酶的底物 显色剂 作用使之显色 三步法LSAB LabeledStreptavidin biotin 原理图 一抗与抗原结合 二抗 Bio与一抗结合 STPA HRP AP 与二抗 Bio结合 三步法LSAB LabeledStreptavidin biotin 主要实验流程 阻断内过氧 S2001 TBS冲洗 S1968 一抗孵育 Mo Rb TBS冲洗 S1968 TBS冲洗 S1968 二抗 生物素 Mo E354Rb E353 TBS冲洗 S1968 显色剂DAB或AEC K3467或K0697 FastRead K0597或K0699 苏木精复染 S3309 链亲和素 HRP或AP 蒸馏水冲洗 三步法LSAB LabeledStreptavidin biotin 特点 便宜有现成的兔 鼠 羊通用试剂盒会有内源性生物素造成的非特异性背景使用对象可向所有做免疫组化的用户推荐 催化放大系统CSA CatalyzedSignalAmplicationSystem 原理在经典三步法免疫组化放大基础上 通过生物素化酪胺的催化 将又一次加入的酶标记链亲和素 Streptavidin enzyme 与二抗中生物素亲和 使已放大的分子再一次放大 催化放大系统CSA CatalyzedSignalAmplicationSystem 原理图 一抗与抗原结合 二抗 Bio与一抗结合 STAV Bio与二抗 Bio结合 放大液催化 加入STAV HRP与Bio再结合 催化放大系统CSA CatalyzedSignalAmplicationSystem 主要实验流程 阻断内过氧 S2001 水洗 TBS冲洗 S1968 二抗孵育 Rba Mo Bio TBS冲洗 S1968 放大液 Kit含 链亲和素 生物素Strep Bio Kit含 TBS冲洗 S1968 显色剂DAB或AEC Kit含 苏木精复染 S3309 链亲和素 过氧化物酶Strep HRP Kit含 蒸馏水冲洗 蛋白阻断剂 Kit含 一抗孵育 Mo TBS冲洗 S1968 TBS冲洗 S1968 TBS冲洗 S1968 催化放大系统CSA CatalyzedSignalAmplicationSystem 特点 敏感性极强实验步骤较多较贵使用对象 需做免疫组化实验者 特别适用于某些石蜡片不易出结果的一抗 动物研究试剂盒ARK AnimalResearchKit 原理在一抗与组织抗原反应之前 小鼠一抗F c 与生物素化抗小鼠F ab 片断结合 再加入小鼠免疫球蛋白 中和未被结合的生物素化抗小鼠F ab 用该复合物再与小鼠组织中特异抗原反应 可降低非特异性背景 动物研究试剂盒ARK AnimalResearchKit 原理图 小鼠一抗 抗小鼠IgF ab Bio 免疫复合物 Bio和游离抗小鼠IgF ab Bio 免疫复合物 Bio和游离抗小鼠IgF ab Bio 小鼠Ig 免疫复合物 Bio和被中和的抗小鼠IgF ab Bio 与组织抗原结合按LSAB法继续免疫组化染色 动物研究试剂盒ARK AnimalResearchKit 主要实验步骤 一抗与组织抗原反应之前需做试剂的预处理 小鼠一抗 抗小鼠Ig的F ab Bio 复合物1 复合物1 小鼠Ig 复合物2 已优化的一抗 用复合物2作为一抗同LSAB三步法免疫组化染色 动物研究试剂盒ARK AnimalResearchKit 特点小鼠一抗在小鼠组织切片上做免疫组化可降低背景 使用对象需用小鼠一抗做小鼠组织的免疫组化