DNARAN 琼脂糖凝胶电泳

,核酸的提取及琼脂糖凝胶电泳,目录,核酸 组成 理化性质核酸分离、纯化的原则核酸提取的基本步骤 材料准备 细胞裂解 分离、纯化 沉淀溶解DNA提取的常用方法RNA提取的常用方法核酸的保存琼脂糖凝胶电泳,核酸,DNA,RNA,Genomic DNA ( 原核、真核、病毒 ),细胞器DNA ( 叶绿体、线粒体等),质粒DNA ( 细菌、放线菌等 ),mRNA ( 1%-5% )rRNA (80%-85%)tRNA(小分子RNA) (15%-20%),核 酸(nucleic acid),核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作 。,核酸的理化性质,理化性质 DNA化学性质稳定，物理上易碎，粘度大 RNA化学性质比DNA活泼，易受RNA酶的污染溶解性 均溶于水 不溶于一般有机溶剂,在70%乙醇中形成沉淀,核酸分离、纯化原则,1、保持核酸分子一级结构的完整性 温度不要太高 控制pH值范围(pH值5-9) 保持一定离子强度 减少物理因素对核酸的机械剪切力,核酸分离、纯化原则,核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。所用器械和一些试剂需高温灭菌提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂,2、防止核酸的生物降解,DNA酶抑制剂,金属离子螯合剂： DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，常用EDTA(乙二胺四乙酸)离子螯合剂，可抑制DNA酶活性。阴离于型表面活性剂 SDS除对核酸酶有抑制作用外，还能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物，该复合物有核酸酶抑制剂作用。,RNA酶（RNAase)抑制剂,DEPC(二乙基焦碳酸盐) 粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。与蛋白质中His 结 合使蛋白变性。 使用注意： 1.DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。 2.容易降解，保存在4 或液氮中； 3.剧毒。,1：手指头 2：枪头 3：水/缓冲液 4：实验台面 5：内源 Rnase 6：RNA 样品 7：质粒抽提 8：RNA 保存 9：阳离子 (Ca, Mg) 10：后续实验所用的酶,Rnase 污染的10大来源,DNA提取的基本步骤,I.材料准备II.裂解III.分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸V.溶解,材料准备,使用新鲜材料，样品材料不要反复冻融提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞）含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集,基因组DNA的提取,细胞裂解,裂解液经典的裂解液几乎都含有去污剂和盐，可以抑制样品中的核酸酶,含蛋白酶的裂解方法：基因组DNA高浓度蛋白变性剂的裂解方法：RNA含CTAB的裂解法：富含多糖的样品的基因组 DNA含SDS碱裂解法：质粒DNA,核酸分离、纯化,蛋白质的去除：酚/氯仿抽提使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等）高盐洗涤 核酸-蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力，使氢键破坏，核蛋白解聚；蛋白酶处理,核酸分离、纯化,多糖的去除：高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖 。,核酸沉淀、溶解,重新调整核酸的浓度；去除溶液中某些盐离子与杂质。,乙醇 优点： 对盐类沉淀少，沉淀中所含乙醇易挥发除去，不影响以后实验。 缺点： 需要量大，一般要求低温操作。异丙醇 优点： 需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的DNA样品沉淀。一般不需低温。 缺点： 易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀异丙醇难以挥发除去。所以，最后用70乙醇漂洗。,有机沉淀剂,核酸的保存,(1) 对DNA DNA样品溶于pH8.0的TE，4 或-20 保存； 长期保存样品中可加入1滴氯仿。(2) 对RNA RNA样品溶于0.3 mol/L NaAc (pH5.2)或双蒸灭菌水中，-70 保存; 长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中;,DNA提取的常用方法,基因组DNA的提取,SDS法其它,原理,基因组DNASDS法,SDS在高温（5565）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。,SDS提取缓冲液的配方,Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl 提供一个高盐环境，使DNA充分溶解，存在于液相中；SDS 裂解细胞，使蛋白变性，染色体离析；,吸附材料结合法：,根据核酸分离纯化方式的不同有：,高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。快捷高效。,低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。适用于纯度要求高的实验。,磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。,其他方法,硅质材料,阴离子交换树脂,磁珠,低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。适用于纯度要求高的实验。,阴离子交换树脂,磁珠,低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。适用于纯度要求高的实验。,阴离子交换树脂,磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。,磁珠,低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。适用于纯度要求高的实验。,阴离子交换树脂,磁珠,硅质材料,高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。快捷高效。,硅质材料,低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。适用于纯度要求高的实验。,阴离子交换树脂,高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。快捷高效。,硅质材料,阴离子交换树脂,低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。适用于纯度要求高的实验。,阴离子交换树脂,阴离子交换树脂,低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。适用于纯度要求高的实验。,阴离子交换树脂,磁珠,磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。,磁珠,Trizol是直接从细胞或组织中提取总RNA 的试剂，内含异硫氰酸胍，酚等物质，异硫氰酸胍能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎。核酸由于核蛋白二级结构的破坏而解离下来。异硫氰酸胍同时抑制细胞释放出的核酸酶，保持RNA 的完整性。,TRIZOL法提RNA,目前有不少商业化的核酸抽提试剂盒可供选用，具体操作步骤参考各种产品说明书。,问题一：DNA降解,材料不新鲜、反复冻融或细胞衰老提取操作过于剧烈，DNA被打断外源核酸酶污染,低温保存，避免反复冻融液氮研磨或匀浆组织，应在解冻前加入裂解缓冲液增加裂解液中螯合剂的含量细胞裂解后操作应尽量轻柔试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌DNA分装保存于缓冲液，避免反复冻融,核酸提取常见的问题,问题二： DNA样品不纯,DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应DNA中残留有金属离子,重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质重新沉淀DNA，让酒精充分挥发增加70乙醇洗涤的次数（2-3次）,实验材料不佳或量少破壁或裂解不充分沉淀不完全洗涤时DNA丢失,尽量选用新鲜（幼嫩）的材料动植物要匀浆研磨充分，裂解时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加PK的用量）低温沉淀，延长沉淀时间加辅助物，促进沉淀洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒,问题三：DNA提取量少,RNA提取常见问题一：样品不纯,蛋白多糖多酚DNA离子,保证彻底的裂解和一定转数一定时间的离心增加有机溶剂抽提的次数，用吸附柱纯化加入不含RNase的DNase处理增加洗涤次数,RNA提取常见问题二：得率低,样品太多或太少RNA在柱子上未洗出洗出液中有酒精,减少或增加样品使用量加入RNaseFree,放置几分钟再离心漂洗后再次离心,RNA提取常见问题三：降解,样品不新鲜或保存不当RNase污染RNA溶液储存不当,取新鲜的样品；取样后立即放入液氮或储存液保存研磨样品及时补充液氮严格处理相应的器具和试剂-70 冻存，分装使用,为了检测提取核酸的浓度和内参，需要继续做琼脂糖凝胶电泳实验,实验原理,（1）DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。分子质量越小跑得越快，紧密构型快于松散型开环分子或线性分子，从而可以分离大小不同的DNA或RNA分子。,（2）琼脂糖是一种线性多糖聚合物，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。,琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖凝胶缓冲液,（1）制备凝胶和胶板： 100ml(1TBE)+1g琼脂糖（ 三角瓶 ）， 煮胶，溶解，冷却至60(不烫手)，加EB替代物，倒板(4-6mm)，室温下充分凝固，竖直拔下梳子 。,（2 ）加样： 5l质粒DNA+1l loading buffer ，混匀 5lPCR产物+1l loading buffer，混匀（3 ）电泳：电压80-120V，注意电极 方向 15min（4 ）观察：紫外透射分析仪下观察。,电泳常见问题分析,DNA降解：避免核酸酶污染。 电泳