医学实验室认可技术要求的关键控制点PCR专业

医学实验室认可技术要求PCR专业的关键控制点,沈佐君,临床基因扩增检验实验室管理暂行办法（卫医发200210号）医疗机构临床实验室管理办法（卫医发 200673号）医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法（卫办医政发2010194号）临床基因扩增检验实验室基本设置标准临床基因扩增检验实验室工作导则 ISO15189 准则（CL02）CNAS-GL26医学实验室质量和能力认可准则在基因扩增检验领域的指南CNAS医学实验室质量和能力认可准则在基因扩增检验领域的应用说明,参考依据,概 述,基因体外扩增检验通常称为PCR检验；该检验项目是目前我国临床检验项目中唯一一项需要通过卫生部或省级临床检验中心现场技术验收合格方可开展临床检验的技术准入项目。,概 述,对实验室的要求：实验室验收合格证书人员上岗证书实验室的布局仪器设备要求质量手册、管理程序文件、操作程序文件、作业指导书、记录表格等,1 范围本文件规定了CNAS对医学实验室基因扩增检验领域的认可要求，包括病原体核酸扩增检验和病理学检查等领域涉及的人体基因扩增检验。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括修改单）适用于本文件。GB/T 20468-2006临床实验室定量测定室内质量控制指南卫办医政发2010194号医疗机构临床基因扩增管理办法CNAS-RL02能力验证规则,4 管理要求,4.1.1 从事基于组织/细胞形态学基础项目检测的医学实验室，应具有病理学诊断资质。,5 技术要求,5.1 人员5.1.2 基因扩增实验室（以下简称实验室）操作人员应经过有资质的培训机构培训合格取得上岗证后方可上岗。5.1.4实验室负责人至少应具有以下资格：中级职称，医学相关专业背景，二年以上基因扩增工作经验。5.1.11 实验室应制定员工能力评审的内容和方法，每年评审员工的工作能力；至少每半年评审新员工工作能力，并保存胜任的证据。当职责变更时，应有政策规定对员工进行再培训和再评审。没有通过评审的人员应经再培训和再评审，合格后才可继续上岗，并记录。5.1.13 实验室应提供工作人员对患者隐私及结果保密的声明及签字。,5.1 人 员,操作人员考核的主要内容： 1. 标本接收与处理：流程和标本是否合格的要点 2. 试剂耗材质检：为何要质检、如何做 3. 核酸提取：原理和操作技术要领 4. 防污染：措施和意识 5. 质量控制：程序和实际运行情况、失控的分析处理 6. 结果分析与判断：结果审核、报告发放,5.1 人 员,在现场评审时要求安排人员比对： 临床基因扩增检验的操作主要是标本处理中的核酸提取步骤，这其中所涉及的又主要是加样器的使用，尽管操作简单，但由于均为微量操作，最后扩增放大，因此要获得稳定可靠的测定结果，操作人员需要一定的专业技术知识和经验。,5.1 人 员,在现场安排实验时应考虑到的问题：标本数量：一般5个；标本要求：一份阴性，其余4份一般要尽可能涵盖高、中、低、临界等浓度差，了解线性范围。,5.2 设施和环境条件(3-1),5.2.1实验室原则上分四个分隔开的工作区域：试剂贮存和准备区；标本制备区；扩增区；扩增产物分析区。如使用自动分析仪（扩增产物闭管检测），（c）和（d）区可合并。上述每个区域应有充分空间以保证： 样本处置符合分析前、后样本分区放置； 仪器放置符合维修和操作要求； 标本制备区放置生物安全柜、离心机和冰箱等仪器设备； 打印检验报告时交叉污染的控制。,5.2 设施和环境条件(3-2),5.2.2 实验室应实施安全风险评估，应针对各工作区制定针对性的防护措施及合适的警告。5.2.4 实验室各分区应配置固定和移动紫外线灯，波长为254nm，照射时离实验台的高度为6090cm。标本处理区应配置二级生物安全柜。5.2.5 实验室应依据所用分析设备和实验过程对环境温、湿度的要求，制定实验室温、湿度控制的目标，有效地实施控制，并提供温、湿度监控记录。 实验室应依据用途（如：RNA检测用水），制定适 宜的水质标准（如：应除RNase），并定期检测。,5.2 设施和环境条件(3-3),5.2.6 基因扩增检验各工作区域应有明确的标记，不同工作区域内的设备、物品不能混用。进入各工作区域应按照单一方向进行，即试剂贮存和准备区标本制备区扩增区扩增产物分析区。不同的工作区域宜使用不同的工作服（如不同的颜色）。工作人员离开各工作区域时，不能将工作服带出。5.2.7 实验室应有限制进入的标志和措施。5.2.9 实验室应有足够的、温度适宜的储存空间（如冰箱），用以保存临床样品和试剂，设置目标温度和允许范围，并记录。实验室应有温度失控时的处理措施，并记录。5.2.10 实验室应有经过培训的内务管理人员（如保洁人员），实验室应有地面、台面的维护、清洁和消毒计划及相关的记录。 危险物品的存放及处置应遵守相关法规，并应有相关的使用记录。,5.3 实验室设备(3-1),5.3.1 实验室应制定设备、试剂和耗材的采购、验收等管理程序，应有根据工作量保证实验持续进行的试剂/耗材订购计划，以及试剂/耗材最低贮存量要求。基因扩增实验室如从事RNA的检测，应具有高速冷冻离心机。在使用PCR-ELISA方法检测扩增产物时，应配置洗板机并使用洗板机洗板。一次性的加样器吸头应带有滤芯。5.3.2 强检设备按国家相关要求执行，应进行外部校准的设备，可按制造商校准程序进行。对分析设备校准的基本项目至少应包括：加样系统、检测系统、温控系统。应内部校准的辅助设备，实验室应制定内部校准程序。应定期对PCR仪、加样器、温度计和恒温设备进行校准。,校准与检定,校准：在规定条件下，为确定测量仪器或测量系统所指示的量值，或实物量具或参考物质所代表的量值，与对应的由标准所复现的量值之间关系的一组操作。,检定： 查明和确认计量器具是否符合法定要求的程序，它包括检查、加标记和（或）出具检定证书。,5.3 实验室设备(3-2),5.3.4 实验室应保存与检验质量有关的设备管理记录。实验室应提供对试剂和耗材检查、接收或拒绝、贮存和使用的记录，包括批号、效期、实验室接收日期、接收人和使用日期等。试剂耗材的质检记录至少包括：外观检查：肉眼可看出的，如包装完整性；性能检测：通过实验才能判断的，如耗材的抑制物、试剂批间的差异（应涵盖低浓度和高浓度，如安排过去检测过的临界阳性的患者标本加上病理定性检查的部分）。对于试剂性能质检记录，应能反映该批试剂：1）核酸提取效率，2）核酸扩增效率。商品试剂记录包括：使用效期和启用日期。自配试剂记录包括：试剂名称或成分；规格；储存要求；制备或复融的日期；有效期；配制人。,试剂质检,强调采用患者标本进行试剂质检的意义：PCR实验时两个关键步骤：（1）从标本中提取核酸；（2）提取核酸的扩增。商品化的质控品和标准曲线的结果良好，并非能反映提取试剂的质量。,5.3 实验室设备(3-3),5.3.6 PCR扩增仪应配备稳压电源。5.3.7 设备故障修复后，实验室应对该设备性能进行验证，必要时需进行校准。实验室应首先分析故障原因，如果设备故障影响了方法学性能，可通过以下合适的方式进行相关的检测、验证（适用于定量项目）：可校准的项目结果超出允许范围时，实施校准；质控品检测结果应在质控范围内；与其他仪器的检测结果比较，偏差符合附录A的要求；使用留样再测结果进行判别，偏差符合附录A的要求。 特别注意的是：评价故障对之前检验结果的影响。,基因扩增检验项目分析性能标准A.1 应不低于国家标准、行业标准、地方法规要求。A.2 自建检测系统分析性能标准：以能力验证/室间质评评价界限作为允许总误差（TEa），重复性精密度1/4TEa；中间精密度1/3TEa。A.3设备故障修复后，分析系统比对：5份样本，覆盖测量范围，包括医学决定水平，至少4份样本测量结果偏倚1/2TEa。A.4实验室内分析系统定期比对：样本数n20，浓度应覆盖测量范围，包括医学决定水平，计算回归方程，计算在医学决定性水平下的系统误差（偏倚%），应1/2TEa。A.5 留样再测判断标准：按照项目稳定性要求选取最长期限样本，5个样本，覆盖测量范围，考虑医学决定水平，至少4个样本测量结果偏倚1/2TEa。A.6 没有标准和室间质评要求时，实验室间结果比对合格标准可依据制造商声明的性能标准而制定。,附录A : 基因扩增检验项目分析性能标准A.1 应不低于国家标准、行业标准、地方法规要求。A.2 自建检测系统不精密度要求：以能力验证/室间质评评价界限（靶值0.4对数值）作为允许总误差（TEa），重复性精密度3/5TEa；中间精密度4/5TEa。A.3 设备故障修复后，分析系统比对：5份样本，覆盖测量范围，至少4份样本测量结果偏倚7.5%。A.4 实验室内分析系统定期比对：样本数n20，浓度应覆盖测量范围，计算回归方程，计算系统误差应7.5%。A.5 留样再测判断标准：按照项目稳定性要求选取最长期限样本，5个样本，覆盖测量范围，至少4个样本测量结果偏倚7.5%。A.6 没有标准和室间质评要求时，实验室间结果比对合格标准可依据制造商声明的性能标准而制定。,1X103 取对数3；30.4；0.4/313.33 %；1X108 取对数8；80.4；0.4/85 %。,5.4 检验前程序,5.4.3 b) 样品采集手册中应规定基因扩增检验标本留取的具体要求：如高压或Rnase灭活的洁净试管、抗凝管正确使用等。一般全血和骨髓标本应进行抗凝处理，EDTA和枸橼酸盐为首选抗凝剂，不使用肝素抗凝（核酸提取采用吸附法而不受肝素干扰时除外）；用于RNA（如HCV RNA）扩增检测的血标本宜进行抗凝处理，并尽快（3小时内）分离血浆，以避免RNA的降解；如未作抗凝处理，则宜在抽血后1小时内分离血清；分泌物、拭子、肿瘤组织等标本留取的注意事项等。5.4.10 基于组织/细胞学形态基础的检测项目应由具有病理诊断资质的医师确认标本是否满足检测要求。,如何正确采集患者标本，确保分子诊断检验结果准确可靠？1、规定标本采集的时间此项规定一方面应便于病人与检验人员做好准备，集中收集标本及时检测，尤其是RNA标本应在采集后及时处理以防RNA的降解。人的汗液，甚至空气中，都可能含有RNA酶，当RNA遇到RNA酶时会降解，造成检测结果误差。另一方面应考虑疾病发展过程中，标本采集过早过晚都可能给出假阴性结果。比如，获得性梅毒分三期期（初期）梅毒：外生殖器溃疡渗出物中有大量的TP；期（中期）在梅毒疹与淋巴结中存在大量的TP；期（晚期）病变波及全身组织器官，病损处TP少。2、标本的类型和采集量标本的类型和采集量应根据所检测的病原体而定，并且重视和考虑同一病原体感染部位不同所采集的标本类型亦不同。比如，肺部结核应取深部晨痰；神经系统结核应取脑脊液；泌尿系统结核应取尿液（清晨一次全部尿量或24小时尿沉渣）；胸腔腹腔结核可取胸水、腹水；另外对于病变部位不明的病人亦可采取血液抗凝。,3、标本采集中的防污染措施（1）标本采集采用一次性材料。（2）标本应装在封闭的无菌一次性容器中。（3）标本应收集在专用的容器内，而不能与其他检测项目共用同一份标本，因为这样做大大增加了标本间污染的可能，若是进行RNA检测的标本易受RNA酶污染。4、标本的抗凝要求一般全血和骨髓标本应进行抗凝处理，EDTA和枸橼酸盐为首选抗凝剂，不使用肝素抗凝（核酸提取采用吸附法而不受肝素干扰时除外）；用于RNA（如HCV RNA）扩增检测的血标本宜进行抗凝处理，并尽快（3小时内）分离血浆，以避免RNA的降解；如未作抗凝处理，则宜在抽血后1小时内分离血清；分泌物、拭子、肿瘤组织等标本留取的注意事项等。基于组织/细胞学形态基础的检测项目应由具有病理诊断资质的医师确认标本是否满足检测要求。5、其它注意事项对于取材来自男性尿道或女性生殖道的分泌物或拭子等标本，要特别注意是否取到病变的样本，否则容易出现假阴性。对这类样本，临床上往往存在一个误区，即临床医生希望检验科能报告定量的结果，如性病的治疗、优生优育检查。虽然PCR方法本身是可以准确定量的，但因取材无法定量，故此这类检验结果实际上无法准确定量。,5.5 检验程序,5.5.1 如果使用内部程序，如自建检测系统，应有程序评估并确认分析性能符合预期用途。对于定量检测项目内容应至少包括正确度、精密度、可报告范围、生物参考区间等。5.5.2实验室应在应用于医学检验之前验证所使用的检验方法和程序的分析性能，对于定量检测项目内容至少包括正确度、精密度、可报告（或线性）范围等。对于定性检测项目内容应包括灵敏度、特异性或符合率及重复性。,5.6 检验程序的质量保证(4-1),5.6.1 实验室应制定室内质量控制程序，可参照GB/T 20468 -2006临床实验室定量测定室内质量控制指南。质量控制程序中应有针对核酸检测中防污染的具体措施。质控图应包括质控结果、质控品名称、浓度、批号和有效期、质控图的中心线和控制界线、分析仪器名称和唯一标识、方法学名称、检验项目名称、试剂和校准品批号、每个数据点的日期和时间、干扰行为的记录、质控人员及审核人员的签字、失控时的分析处理程序和纠正措施等。对于定性检测项目，每次实验应设置阴性、弱阳性和阳性质控。质控规则应确保试验的稳定性和检验结果的可靠性。实验室应检查失控对之前检验的影响。,5.6 检验程序的质量保证(4-2),5.6.3 对于定量检测项目，使用配套分析系统时，实验室可使用制造商提供的溯源性文件。使用非配套分析系统时，实验室应采用有证参考物质、正确度控制品等进行正确度验证或与经确认的参考方法进行结果比对以证明实验室检验结果的正确度。如以上无法实现，则通过如下方式提供结果可信度的证明：参加适宜的能力验证计划（PT）、室间质评计划（EQA），且在近期一个完整的周期内成绩合格，或与已获认可的实验室或其它使用相同检测方法的配套系统的同级别或高级别医疗机构实验室进行比对。,5.6 检验程序的质量保证(4-3),5.6.4实验室应按照CNAS-RL02能力验证规则的要求参加相应的能力验证活动。应采用相同的检测系统检测质控样本与患者样本；室间质评活动需由从事常规检验工作的人员执行；应有禁止与其他实验室之间核对上报PT、EQA结果的规定；应能提供参加PT、EQA活动的结果和证书。实验室应对“不满意”和“不合格”的PT、EQA结果建立分析和纠正措施，并记录。实验室负责人或指定负责人应监控室间质量评价活动的结果，并在结果报告上签字。5.6.5 对没有开展PT或EQA的检测项目，实验室应通过与其他实验室（如已获认可的实验室或其它使用相同检测方法的配套系统的同级别或高级别实验室）比对的方式，判断检验结果的可接受性。,5.6 检验程序的质量保证(4-4),5.6.6 实验室用两套及以上检测系统检测同一项目时，应有比对数据表明其检测结果的一致性，比对频次每年至少2次，每次不少于5份样本，浓度水平覆盖测量范围；比对结果的系统偏倚应符合附录A的要求。使用不同生物参考区间的检测系统间不宜进行比对。5.6.7 实验室管理层应定期检查室内质量控制记录（最少每月一次）和能力验证结果。应有针对内部质量控制和外部质量评价“不满意”结果采取纠正措施的记录。质量控制记录至少应保留2年。,5.6 检验程序的质量保证,一般核酸提取试剂促使靶核酸从细胞内释出的原理核酸的分离纯化靶核酸提取的质量 临床标本及核酸提取中可能存在的抑制和干扰物质 核酸样本制备及扩增检测的质控 产物检测的质控,核酸样本的制备、扩增检测及其质量控制,5.6 检验程序的质量保证,一般核酸提取试剂促使靶核酸从细胞内释出的原理,靶核酸可以与宿主细胞整合，核内游离及胞浆内各种构形存在于细胞内，如测定的是病原微生物,则靶核酸存在于细菌、病毒、原虫或真菌细胞内，如果上述细胞破裂,则靶核酸亦可存在于细胞外。 一般均使用去垢剂(如Triton-100)裂解细胞，用一种蛋白裂解酶(如蛋白酶K)消化结合于核酸的蛋白质，从而将靶核酸从细胞内释放出来。,5.6 检验程序的质量保证,核酸的分离纯化,核酸的分离纯化就是要将蛋白、脂类等干扰核酸扩增的物质去除。 经典方法硅吸附法对于商品核酸提取试剂盒，临床实验室在使用前，必须对其核酸提取纯度和效率进行评价。,5.6 检验程序的质量保证,靶核酸提取的质量,纯化的靶核酸的完整性：可使用凝胶电泳将样本的核酸提取物与一核酸标准比较测定。 核酸提取的产率：可在A260读数测定。核酸纯度：可通过提取物A260/A280比率判定血清或血浆中病原体核酸纯化纯度：采用一种间接的方法，即使用已知病原体含量的溶血和/或脂血标本用待评价试剂提取，然后进行扩增检测，比较所得到的结果。,DNA纯度：OD260/OD280=1.8，1.6 2.0之间DNA用量：0.05 ng 100 ngRNA纯度：OD260/OD280=2.0 cDNA用量：1-100 ng 总RNA反转录的cDNA取1 uL,5.6 检验程序的质量保证,临床标本及核酸提取中可能存在的抑制和干扰物质,临床标本中：血清或血浆中的血红素及其代谢产物、痰中酸性多糖和糖蛋白成份 、降解靶核酸的核酸酶等。核酸提取中：许多试剂如乙二胺四乙酸(EDTA)、去垢剂如十二烷基硫酸盐(SDS)和chaotrope试剂如异硫氰酸胍和盐酸胍等、酚、氯仿、乙醇等有机溶剂 。,5.6 检验程序的质量保证,实验室应有室内质控方案和室间质评计1. 室内质量控制标准操作程序； 阳性对照、阴性对照、试剂空白对照、 阳性（临界值）对照 2. 实验室应参加EQA。失控结果的分析，纠正措施及其效果评价等。,5.6 检验程序的质量保证,无商品化质控物时，可采用自制的质控物。质