血清和关节液中YKL-40对骨性关节炎

血清和关节液中血清和关节液中 YKL-40对骨性关节对骨性关节炎诊断价值的研究炎诊断价值的研究导 师 : 卫小春教授研究生 : 王国金科研开题报告一、课题简介一、课题简介关节软骨特性：光滑、耐磨、富有弹性及一些特有的机械性能 功能：传导载荷、吸收震荡、润滑关节 由于关节软骨没有血管、神经，一旦损伤，很难自我修复 (once destoryed， is not repaired)实验流程图实验流程图前言前言关节软骨是一种高度分化的组织，由于缺乏血供，损伤后很难自我修复 （ once destoryed， is not repaired）Autologous Chondrocyte Transplantation（ ACT）1994年，年， Brittberg国内外曾用多种修复方法来治疗软骨损伤，如刨削成形术、微骨折术、软骨下骨钻孔术等，其基本原理是利用生物或机械因素使骨髓中的多能干细胞到达软骨缺损区，并进一步分化为软骨及骨组织。研究发现形成的软骨为纤维软骨或类透明软骨，且该软骨容易发生退变。 本研究所属领域本研究所属领域 范围及性质范围及性质 骨性关节炎 (osteoarthritis, OA)生物学标志物 (Biomarkers, Biological Markers,marker. BM)的研究领域。 采用横断面研究的方法 ,对 OA体液中生物学标志物之一 YKL-40(又称人软骨糖蛋白 -39,human cartilage glycoprtein-39,HC gp-39/GP-39)进行的临床诊断性试验研究。OA概况概况 (1) OA是引起关节疼痛和活动受限的常见病变 ,是世界性的关节疾病。 在美国 50岁以上的人群中已成为劳动力丧失的第二大疾患。 在我国 OA的发病率 :农村为 9.6%,城市人群为 4.9%。OA概况概况 (2) OA是以疼痛、肿胀、活动受限、弹响，有时伴关节积液，以及不同程度的局部炎症 ,但无全身症状为特点的关节病。 OA的病理生理学特点：负重部位的不规则软骨丧失；软骨下骨硬化、囊性变、边缘骨赘形成 不同程度的滑膜炎症。OA诊断的现状诊断的现状 目前临床所通用的是 1986年美国风湿病协会关于 OA的诊断标准，主要是以 症状 +X线征像为依据的。 现有检查手段对 OA软骨退变诊断的局限性MRIX线其征象改变比软骨发生退变迟 3-5年。OA的生物学标志物的生物学标志物 (BM) (1)-概况概况 近年来国内外学者欲在 OA患者的体液中寻找理想的病变标志物，来及时反映关节软骨代谢状态和局部病变的进展情况，揭示病情活动或预后，并为临床提供疗效评价的客观依据。 美国国立卫生研究院 2000年建议用Biomarker取代 marker,这样可更好地揭示其生物学本质。OA的生物学标志物的生物学标志物 (BM) (2)-研究现状研究现状 大量实验研究已发现许多能反映 OA病情的 BM：反映骨代谢的 BM；反映软骨代谢的 BM；反映滑膜代谢的 BM。YKL-40：可能是反映软骨和滑膜代谢的 BM之一。近年来，国外开始进行临床试验研究。OA的生物学标志物（的生物学标志物（ BM）（）（ 2） 研究现状（研究现状（ 1）反映骨代谢的）反映骨代谢的 BM 合成代谢 I型胶原： I型前胶原氨基端前肽 , I型前胶原羧基端前肽。 非胶原蛋白：骨特异性碱性磷酸酶 ; 骨钙素 。 分解代谢 I型胶原：脱氧吡啶酚 , 吡啶酚 ; I型胶原氨基端端肽 , I型胶原羧基端端肽 -1,2 。 非胶原蛋白：血浆酒石酸盐耐受性酸性磷酸酶, 骨唾液蛋白。OA的生物学标志物（的生物学标志物（ BM）（）（ 2） 研究现状（研究现状（ 2）反映软骨代谢的）反映软骨代谢的 BM 合成代谢 型胶原： 型前胶原羧基端前肽 , A型前胶原氨基端前肽。 可聚蛋白多糖：硫酸软骨素表位 846, 3B3, 7D4。 其它蛋白： YKL-40即人软骨糖蛋白 -39 分解代谢 型胶原：吡啶酚 ; 型胶原新表位 COL2-3/4m, COL2-1/4N1; 型胶原羧基端端肽。 可聚蛋白多糖：可聚蛋白多糖片断 ; 硫酸角质素表位 5D4,AN9P1; 其它蛋白：软骨寡聚基质蛋白。OA的生物学标志物（的生物学标志物（ BM）（）（ 2） 研究现状（研究现状（ 3）反映滑膜代谢的）反映滑膜代谢的 BM 合成代谢 I型和 III型胶原： I型前胶原羧基端前肽 , III型前胶原氨基端前肽。 非胶原蛋白：透明质酸 ; YKL-40 ; 软骨寡聚基质蛋白 ; 基质金属蛋白酶及其组织抑制因子。 分解代谢 I型和 III型胶原：葡萄糖 -半乳糖 -吡啶酚 ; I型胶原羧基端端肽 -2。YKL-40概况概况 YKL-40（又称人软骨糖蛋白 -39， human cartilage glycoprtein 39， HC gp-39/ GP-39） 在非泌乳期牛的乳清分泌物中被首次发现的。 来源：软骨细胞、滑膜细胞、单核巨噬细胞和中性粒细胞等。 相对分子量为 40 000的糖蛋白，含 383个氨基酸。 由 10个外显子构成的含开放读码框架完全互补 cDNA序列编译。 是壳质酶 (chitinase)糖蛋白家族的成员 , 但不具备壳质酶活性。YKL-40的研究现状（的研究现状（ 1） 目前 YKL-40的相关研究主要集中于以下领域： 类风湿性关节炎； 骨性关节炎； 巨细胞性动脉炎； 肝纤维化； 乳腺癌和结肠直肠癌，等等。 虽然 YKL-40的作用机制尚不清楚，但研究表明它与许多组织的重塑和细胞外基质降解有关。YKL-40的研究现状（的研究现状（ 2） 关节液内 YKL-40是软骨细胞和滑膜细胞的分泌产物。 OA患者 Volck ： YKL-40在关节液中含量增加； 血清水平也升高。 Johansen报道：血清和关节液中 YKL-40水平是反映滑膜炎时滑膜合成代谢水平的指标。 Volk等的研究表明： YKL-40可能在 OA的关节软骨降解和重塑形中也起着重要作用。YKL-40的研究现状（的研究现状（ 3） YKL-40是一个反映滑膜和关节软骨代谢的 BM? 经检索十年的 CBMDisc未发现国内关于 YKL-40在骨性关节炎方面的研究论文发表。 OA的生物学标志物（的生物学标志物（ BM）（）（ 3） 血清血清 BM研究中的混杂因素研究中的混杂因素 血清 BM除反映关节的病情外，还可能受其它因素的影响： 生物节律的影响 肠蠕动的影响 体育活动的影响 肝肾等疾病的影响 年龄和性别的影响 手术的影响 药物因素的影响OA的生物学标志物（的生物学标志物（ BM）（）（ 4）-现有临床诊断性研究论著的局限性现有临床诊断性研究论著的局限性 多以 OA患者 X线征象的 Kellgren&Lawrence分级作为 “金标准 ”，来对照评价 OA病情严重程度。 充分考虑混杂因素控制的相关论著也不多见。本研究目的本研究目的 明确关节液（ synovial fluid, SF）中 YKL-40水平对膝 OA的诊断价值； 探讨血清（ Serum）中 YKL-40水平对膝 OA的诊断价值。本研究的特点本研究的特点 诊断试验的 “金标准 ” 关节镜下关节软骨损伤和滑膜炎病理变化程度的评分； WOMAC骨性关节炎指数（由患者自我评估）； X线的 Kellgren&Lawrence分级，负重位 X线的膝关节间隙宽度。 充分控制混杂因素 探讨血清 YKL-40诊断价值。本研究的意义本研究的意义 学术意义 可以明确 YKL-40对 OA的诊断价值； 可为 OA的症状解释、早期诊断及其分期提供一种实验室检查手段； 可为 OA的治疗提供一种疗效评价的客观指标； 可为进一步研究确定国人体液 YKL-40的正常参考值奠定基础。 经济效益 近期效益； 远期效益。统计学分析X线评价体液 YKL-40的检测（ ELISA）体液标本的预处理和储存OA病变程度的评价术中关节镜下观察采集关节液标本采集血液标本膝关节镜手术时术前化验时病例选择关节软骨退变和滑膜炎关节镜分级关节液和血清 YKL-40浓度Kellgren&Lawrence 分级技术路线功能评估WOMAC指数专业结论技术关键技术关键 体液标本的采集和预处理 体液标本的检测 统计学的统计处理研究方法（研究方法（ 1） 病例选择病例选择 病例来源 ：山医二院骨科行膝关节镜检查和膝关节置换术的患者。 择入标准 : 非发育期患者（年龄 18岁）； 排除肝肾疾病、全身感染和癌症等的患者； 体液标本采集前两月未使用糖皮质激素类药物的患者。 样本含量 ： 60例。研究方法（研究方法（ 2） 体液标本的采集、预处理、储存和检测体液标本的采集、预处理、储存和检测 体液标本的采集、储存前处理、储存和取用、以及检测前处理和检测，应依据课题技术规范进行。 本课题相关技术规范主要参考 Poole R. NIH White Paper: Biomakers, the Osteoarthritis Initiative (A Basis for Discussion). Ferbruary 3rd,2000. 制定 。技术规范（技术规范（ 1） 体液标本的采集体液标本的采集 体液标本的采集规范 血液标本在 清晨 6-8时 空腹抽取静脉血 5ml，留存于无菌非抗凝试管中送检。并应限制病人在采集标本前活动。 关节液标本在行 关节镜手术时麻醉后 采集：抽取关节液原液留存于无菌非抗凝试管中（尽量多抽取）。技术规范（技术规范（ 2） 体液标本的储存前处理体液标本的储存前处理 体液标本均应在采样后 2小时内进行离心处理： 血清标本：在至少 600g， 3000rpm， 10分钟的条件下离心。 关节液标本：在 2500g， 4 ， 15分钟的条件下离心。 （ 4500rpm， 20min）技术规范（技术规范（ 3） 体液标本的储存和取用体液标本的储存和取用 体液标本的储存 标本离心后取上清液，经快速冷冻后 , -70 条件下冻存。 体液标本的取用 在室温下复温解冻。 标本避免反复冻融。技术规范（技术规范（ 4） 体液标本检测前处理和检测体液标本检测前处理和检测 体液标本的检测前处理 关节液标本应先经离心后，取上清液测定其含量； 血清标本不需进行特殊处理。 体液标本的检测 ELISA法。研究方法（研究方法（ 3） 其它相关资料的收集其它相关资料的收集 临床资料 一般资料； 临床症状、体征； 问卷调查： WOMAC指数 实验室检查资料 常规项目， 血清 型胶原。 X线资料 关节间隙的宽度； Kellgren&Lawrence分级。 手术资料 关节软骨损伤和滑膜炎程度的评分； 手术录像资料。技术规范（技术规范（ 5） 手术资料收集的注意事项手术资料收集的注意事项 手术中对关节内组织的病变程度进行评价 ： 关节软骨损伤： Outerbridge膝关节软骨损伤评分法； 滑膜炎： Ayral膝滑膜炎评分法。 术中对病变部位用探钩进行相对测量，并注意留存录像资料。研究方法（研究方法（ 4）OA 病变程度的对照评价标准病变程度的对照评价标准 关节组织的关节镜征象评价标准 关节软骨退变程度： Outerbridge法 ； 滑膜炎程度： Ayral膝滑膜炎评分法。 OA病变程度的 X线征象评价标准 Kellgren&Lawrence 分级； 负重位的膝关节间隙宽度。 OA病变程度的患者自我评估标准 WOMAC骨性关节炎指数。研究方法（研究方法（ 5） 统计学处理统计学处理 使用 SPSS11.0软件进行统计学分析 OA组和非 OA组之间体液 YKL-40水平的比较用多元协方差分析。 体液 YKL-40水平与关节镜下相关组织的病变程度评分之间用多元线性回归。 体液 YKL-40水平与膝关节间隙宽度或 WOMAC评分间用相关分析。可能遇到的问题及解决办法可能遇到的问题及解决办法 标本的采集、预处理和检测等的标准化 严格依据课题技术规范进行，才能保证结果的有效性和可比性。 混杂因素的控制 探讨血清 YKL-40水平对 OA诊断价值的关键。混杂因素的控制（混杂因素的控制（ 1） 生物节律影响的控制 血液标本的采集在 固定时间（清晨 6-8时） 进行。 肠蠕动影响的控制 血液标本在 清晨空腹 时采集。 体育活动影响的控制 采集血液标本前限制病人的体育活动。混杂因素的控制（混杂因素的控制（ 2） 肝肾等疾病影响的控制 选择肝肾功能均正常的病例； 若样本含量不足时，用统计学方法进行控制。 经术前检查可排除全身感染和肿瘤等的影响。 年龄和性别影响的控制 采用统计学方法进行控制。混杂因素的控制（混杂因素的控制（ 3） 手术影响的控制 由于体液标本是在麻醉后手术前采集的，故麻醉的影响可忽略。 药物因素影响的控制 采集标本前两月内未使用糖皮质激素类药物。进度安排进度安排 2005年 1月 2005年 4月 文献检索，课题设计，课题技术规范的制定 ,开题报告。 2005年 5月 2005年 9月 标本的采集和预处理，临床和手术资料的收集。 2005年 10月 2005年 12月 预实验，部分体液标本 YKL-40含量的测定，分析关节液和血清 YKL-40水平与膝骨性关节炎 WOMAC评分和 X线分级的相关性。 2006年 1月 2006年 2月 体液标本 YKL-40含量的测定，分析关节液和血清 YKL-40水平与膝关节镜下相关组织大体病理变化程度的相关性。 2006年 3月 2006年 6月 数据整理，统计分析，撰写论文 ,论文答辩。开题条件（开题条件（ 1） 学术及技术条件学术及技术条件 研究人员 卫小春 教授 长期从事关节软骨损伤的研究 ,具有丰富的临床经验和很强的科研能力 .能及时把握国际上关节软骨损伤研究的最新进展。主持承担国家 863计划一项及省部级科研项目多项，在国内外期刊上发表论文多篇。 文献和技术准备 已检索并熟读了大部分相关核心文献，了解该领域的研究进展、 YKL-40的检测方法。 病源及标本来源 山医二院骨科病源充足； 课题所需的体液标本较易获得。开题条件（开题条件（ 2） 实验设备条件实验设备条件 山医二院所具备的实验条件 手术室：关节镜设备； 骨科实验室：酶标仪及相关波长的滤光片、深低温冰箱、低速离心机、高速离心机、电热恒温孵育箱、电子天平、普通冰箱； 放射科：拍片相关设备。 开题条件（开题条件（ 3） 经费预算经费预算科研业务费 3000元实验材料费 7000元仪器设备费 4000元协作费 1500元科研组织费 2000元合 计 17500元参考文献参考文献 Poole R. NIH White Paper: Biomakers, the Osteoarthritis Initiative (A Basis for Discussion). Ferbruary 3rd,2000. Morgante M, Metelli MR, Morgante D. Observations on the increased serum levels of YKL-40 in patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis. Minerva Med. 2001;92(3):151-3. Johansen JS, Olee T, Price PA, et al. Regulation of YKL-40 production by human articular chondrocytes. Arthritis Rheum. 2001;44(4):826-37. Volck B, Johansen JS, Stoltenberg M, et al. Studies on YKL-40 in knee joints of pat