《研究生实验》PPT课件.ppt

实验二 ELISPOT 单细胞分析技术 基础医学院免疫学教研室徐琦副教授 ELISPOT简介 ELISPOT是在ELISA技术的基础上建立的体外检测特异性抗体分泌细胞和CK分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术 可在单细胞水平检测和计数特异性分泌抗体和细胞因子的细胞 并具有较高的特异性和敏感性 目前正被国内外广泛应用 ELISPOT技术的发展 ELISPOT是20多年前便己研发成功的老技术 Czerkinsky等人率先在1983年 运用该技术成功地检测出因受激而分泌抗体的B细胞频率 早期ELISPOT的分析条件不是非常理想 成对抗体的品质 呈色底膜的材质等几个技术性的问题无法解决 直到1996年PVDF薄膜的应用 Forsthuberetal Science 1996 才解决了该技术因斑点呈色问题造成低敏感度的缺失 与原来的标准膜面相比 PVDF薄膜提供1 000倍的较大面积来吸附单株抗体 使T细胞分泌的各类细胞因子能在细胞周围就近被俘虏 让呈色斑点集中 清晰 对比色高 大大的提高ELISPOTCytokine分析的敏感度 1996年以来随着抗体制备 PVDF膜等技术改良 ELISPOT分析技术已经逐渐达到科研人员的期待 它已是当世公认最灵敏抗原特异性T细胞的体外检测技术 ELISPOT与ELISA的比较 它们最大的不同在于 1 ELISA通过显色反应 在酶标仪上测定吸光度 与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量 2 ELISPOT也是通过显色反应 在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点 可直接在显微镜下人工计数斑点或通过ELISPOT分析系统对斑点进行计数 1个斑点代表1个细胞 从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率 3 由于是单细胞水平检测 ELISPOT比ELISA和有限稀释法等更灵敏 能从20万 30万细胞中检出1个分泌该蛋白的细胞 4 刺激剂激活细胞时 不会影响活化细胞分泌细胞因子 106抗原呈递细胞 APC 中混入特定数量的IFN 的T淋巴细胞 经下列方法检测 ELISPOT细胞内细胞因子染色 FACS ELISA X坐标 106APC中实际IFN T细胞数量Y坐标 各检测方法的检测结果 ELISPOT FACS ELISA检测精确度比较 BDELISPOT技术优势 单细胞水平检测分泌到的胞外细胞因子观察活细胞应答 动态 结果能计数效应细胞 分析效应分子产生频率 ofSpots cellnumbers frequencysizeofSpots relativeamountproduced高灵敏度 高产量 大容量T细胞分析成为可行 只需要少量样本即可进行检测分析 淋巴细胞在ELISPOT分析后依然存活 这使得分析之后可以用于进行增殖 用于更进一步的分析 克隆或者低温储藏成为可能 BDELISPOT应用 移植研究疫苗开发 亦可评估疫苗效力 或是疫苗注射路径影响Th0 Th1 Th2细胞转换分析自体免疫研究 免疫调节及免疫治疗研究癌症研究 肿瘤反应T细胞作用过敏机制探讨 IL 4诱导免疫球蛋白亚型转换 其它参与过敏机制之细胞因子研究传染疾病研究体液免疫研究 B细胞免疫球蛋白及特定亚型反应的进展研究 BDELISPOT原理 1 ELISPOT实验设计是在96微孔培养板底部披覆PVDF薄膜 用来吸附特殊挑选 且无毒性 不含sodiumazide 内毒素endotoxin 的单株抗体 2 静脉血PBMC经适当分离处理后分配到微孔上 再接受适当的抗原刺激 并将微孔板放置于温箱中过夜培养一段时间 一般而言 记忆性T细胞在受抗原刺激数小时后会开始分泌细胞因子 此时局部 在紧靠分泌细胞的周围 分泌出的细胞因子会被PVDF薄膜上特异抗体捕获 3 微孔板中的细胞被移除并清洗后 被捕获的细胞因子可进一步使用生物素 Biotin 标记的一抗来标识 其后再与辣根过氧化物酶标记的亲合素作用 并加入底物使其呈色 有反应作用的细胞会留下约10 20mm大小染色的斑点 BDELISPOT流程 1 针对被分析物的捕获抗体包被在贴有PVDF膜的微孔板上 2 用完全培养基将板底封闭 3 细胞悬液加入Ag或有丝分裂素等刺激剂孵育一定时间以激活细胞 细胞分泌的蛋白紧靠在细胞周围 与已固定的捕获抗体结合 4 孵育一定时间后洗去细胞 分泌出的细胞因子会被PVDF薄膜上特异抗体捕获 BDELISPOT流程 5 加入生物素标记的针对被分析物的检测抗体 检测抗体与被分析物结合 形成 夹心三明治 复合物 6 加入与辣根过氧化物酶 HRP 连接的亲和素 亲和素与检测抗体上的生物素结合 7 加入底物与酶发生显色反应 监测颜色斑点的形成 终止底物反应 室温风干 避光保存于封口塑料袋中直至分析颜色斑点 BDELISPOT流程 BDELISPOT基本流程 去除细胞 加入冰冻去离子水200ul 孔 培养板置冰上10分钟 加入生物素标记的detectorAb 加入酶标抗生物素抗体 GABA 40C暗处混合显色剂I和II 加入显色剂I II 暗处室温孵育20 30分钟 PBST洗板10次 370C孵育1小时后 PBST洗板5次 370C孵育1小时后 PBST洗板5次 显微镜下观察至斑点形成 去离子水清洗培养板室温干燥后在倒置显微镜下观察结果 非无菌 ELISPOT结果显示 ELISPOT结果显示 Blankcontrols G1 9 无刺激剂的细胞H1 9 无细胞的刺激剂 样本孔出现颜色斑点Usu 10 20mm BDELISPOT结果分析 在显微镜下计数 一个斑点代表一个分泌细胞用ElispotReader进行分析对斑点自动计数 并做出不同大小斑点的分布图 快速 精确 还能平衡背景信号 软件自动计算出细胞的分泌频率 BDELISPOT操作注意事项1 1 操作时注意不要触及PVDF膜的底部 2 为获得优化的实验结果 在第一次实验时可使用不同的细胞浓度 103 106cells microwell 3 在细胞培养过程中不要摇动ELISPOT板 防止斑点模糊 4 在培养箱孵育过程中 不要将ELISPOT板重叠 防止边缘效应 5 背景过高的克服方法 增加洗涤的次数 在显色之前用PBS洗涤以去除Tween 20 防止对显色的干扰 如果需要 增加干燥ELISPOT板的时间 彻底洗去细胞减少非特异性斑点 掌握好显色时间 防止过度显色 6 实验结束后将ELISPOT板室温晾干 不能高于37 防止损坏PVDF膜 7 待ELISPOT板干燥后 将其保存在密封的塑料袋中防止褪色 BDELISPOT操作注意事项2 ChampSpot 酶联斑点分析系统简介 Bioreader3000TMPRO酶联斑点自动图象分析仪 适用于分析 酶联斑点 Elispot 克隆形成 CFU 病毒斑 德国Biosys公司产品 ELISPOT酶联斑点分析软件和ELISPOT计数分析软件 1 完成整块板的计数只需5个步骤 2 整块板的采集 分析 数据保存 输出 在15分钟内完成3 强大的斑点处理功能4 图象自动修复 可自动减切修复每个孔的内圈图象 有效的区分了孔壁与孔底的连接处 5 具有单 双 多色斑点分析功能 6 分析模式 给用户提供全自动 半自动 手动三种分析模式 同时可任意指定对整块ELISPOT板 列 行或单个微孔进行分析 ELISPOT酶联斑点分析软件和ELISPOT计数分析软件 7 单个孔的图片或整块板的图片都可直接 复制或导入到Photoshop PowerPoint Word 等软件中进行编辑