发酵设计链霉菌生产维生素B12.doc

中北大学2012年发酵工程课程设计说明书1 绪论维生素B12是一种水溶性维生素。只需少量即能产生效果， 为深红色结晶或结晶粉末又称为红色维生素（red vitamin）或氰钴胺。维生素 B12具有广泛的生理作用，它参与体内甲基转换及叶酸代谢，促进神经髓鞘中脂蛋白的形成，保持中枢神经和外周髓鞘神经纤维的功能完整，参与广泛的蛋白质及脂肪代谢等。其计量单位为微克（mcgmicrogram，即1/1000000克）。现在维生素B12 的发酵常用菌种为放线菌中的链霉菌。1.1 链霉菌的简介 链霉菌 -链霉菌属（streptomyces)，其基内菌丝多分枝，一般横隔稀疏，很少断裂，常产生各种水溶性或脂溶性的色素；气生菌丝比基内菌丝稍粗，为外鞘所包，气生菌丝部分分化成直形、柔曲、钩环状至松敞或紧密螺旋形的孢子丝，时常含50个左右的孢子，短者含510个孢子。本属菌种数最多，分类鉴定比较困难，一般认为孢子丝的形状、孢子的表面结构、孢子的颜色和在有机培养基内是否产生类黑色素是最主要的分类指征。它们在土壤中分布极广，大多在人工培养基上生长茂盛，少数是植物致病菌。因许多种是抗生素的产生菌而且产生抗生素的种类最多而著名（如链霉素）。在维生素B12发酵中，我们采用国内比较常用的灰色链霉菌及其变种。灰色链霉素的孢子柄直而短，不呈螺旋。孢子量多，呈椭圆球形。气生菌丝和孢子都呈白色，单菌落生长丰满，呈梅花形或馒头形，直径3-4mm。基质菌丝透明，在斜面背后产生淡棕色色素。菌种采用沙土管或冷冻干燥保藏。1.2 维生素B12结构与性质维生素B12（VB12）为钴胺素（Cobalamin）类化合物，它的分子中有4个还原性吡咯环联结在一起，这种构叫做咕啉，它与核苷酸（二甲基苯异咪唑）及核糖相联，另一方面与D-1-氨基-2-丙醇相连，钴与核苷酸之N相偶联。化学上称氰钴胺素为维生素B12，除CN后称钴胺至少。CN可为其他基团代替，成为不同类型的钴胺素。一般称对哺乳类有生理作用的为钴胺素，称对哺乳类及微生物都有作用的为维生素B12。本文中维生素B12泛称此类物。氰钴胺至少自然界很少，为人工合成产品，可从其他类型转换而来。它是红色结晶，其活力为重金属及氧化还原剂所破坏，但在短期高压消毒（12）不被破坏，能溶解在1：80水中，溶液为中性，在pH4.55时最稳定。辅酶B12（即5-脱氧腺钳钴胺素）及甲基B12（甲基钴胺素）为哺乳类（人类）组织中最主要的辅酶形式。前者在线粒体内，后者在胞浆内，为合成蛋氨酸所必需者。它们对光不稳定，光解后形成水钴胺素。在氰存在下变成氰钴胺素，维生素B12、B12a、B12b、B12c都可治疗维生素B12的缺乏。氰钴胺素分子式（CN可以其他基团代替 ） 1.2.1 维生素B12主要功能1）提高叶酸利用率，与叶酸一起合成甲硫氨酸（由高半胱胺选合成）和胆碱，产生嘌呤和嘧啶的过程中合成氰钴胺申基先驱物质如甲基钴胺和辅酶B12，参与许多重要化合物的甲基化过程。维生素B12缺乏时，从甲基四氢叶酸上转移甲基基团的活动减少，使叶酸变成不能利用的形式，导致叶酸缺乏症。2）维护神经髓鞘的代谢与功能。缺乏维生素B12时，可引起神经障碍、脊髓变性，并可引起严重的精神症状。维生素B12缺乏可导致周围神经炎。小孩缺乏维生素B12的早期表现是情绪异常、表情呆滞、反应迟钝，最后导致贫血。 3）促进红细胞的发育和成熟。将甲基丙二酰辅酶A转化成琥珀酰辅酶A，参与三羧酸循环，其中琥珀酰辅酶A与血红素的合成有关。 4）参与脱氧核酸（DNA）的合成，脂肪、碳水化合物及蛋白质的代谢，增加核酸与蛋白质的合成。 1.2.2 维生素B12主要用途（1）医疗方面用于治疗和预防维生素B12缺乏症。 用于胃切除或吸收不良综合症，维生素B12缺乏造成贫血的预防。 用于补充因消耗性疾病，甲状腺机能亢进，妊娠，哺乳等造成的维生素B12需求增加。 肝障碍贫血。 放射性引起的白细胞减少。神经疼，肌肉疼，关节疼。末梢神经炎，末梢神经麻痹。脊髓炎，脊髓变性。（2）饲料添加剂维生素B12对于机体生长是一种不可缺少的微量营养物质，大多数动物的植物性饲料中不含维生素B12，动物一方面靠胃肠中的微生物合成，一方面靠外界添加。为了满足动物维生素的需要就必须补充维生素添加剂。 猪和鸡等非反刍动物缺乏维生素B12主要表现是生长发育停滞，也有少数猪可出现轻度的正常红细胞性贫血。此外，还可使鸡的孵化率和猪的生殖率降低。缺乏症的临床症状包括食欲不振、生长停滞、单纯贫血，严重的也有神经症状。 饲料维生素B12能促进家禽，特别是幼禽幼畜的生长发育。 可用于： 维生素B12缺乏所引起的猪、鸡生长发育不良和贫血； 缺钴地区牛、羊所出现的地方性消瘦病； 神经炎、神经痛等的非特异性治疗； 提高饲料蛋白的利用率； 经济动物的饲养； 用B12溶液处理鱼卵或鱼苗，可提高鱼对水中有毒物质如苯和重金属的耐受力。 （3）其它食品添加剂 可作为仪器着色剂：如火腿，香肠，冰淇淋，鱼肉酱。 用于化妆品，肥皂，牙膏等，也可用于厕所，冰箱，口腔等防臭，消除硫化物和醛的气味。1.2.3 维生素B12的发酵生产（一）抗生素废液中提取早在1952年美国T.R.Wood等人就发现,当用加有钴化合物的培养基培养灰色链霉菌时,可大大提高维生素B12在整个培养液中的浓度,但是对于钴化合物的浓度要求要适量,过高的浓度会对菌体细胞产生毒性;另有研究表明,添加适量的氰化合物也同样可促进抗生素废液中B12类似物的含量,但需严格掌握其用量。(二)放线菌发酵自从人们发现可从抗生素废液中提取得到维生素B12后,许多科学家将目光转向了采用放线菌,其中主要是运用链霉菌属中的灰色链霉菌和橄榄色链霉菌来发酵产维生素B12,由于链霉素的生成,而始终未能使得维生素B12的产生处于主导地位,因此,我们应选出链霉素发酵支路的关键酶,并将其抑制,这样便可大大提高维生素B12的得率,使得大量产生维生素B12成为可能。发酵法生产维生素B12的生产路线：1.2.4 维生素B12的提取对于维生素B12提取,不断有新的方法提出,主要有两种,一种为溶剂提取法,另一种为离子交换树脂法。(一)有机溶剂提取研究表明,采用两相混合溶剂,可简单地纯化和提取出来,常用的溶剂为苯甲醇和水的混合溶液,基本过程如下:发酵液吸附(活性碳)洗脱(吡啶)浓缩层析(Al2O3)洗脱(甲醇)收集红色液浓缩结晶。（二）离子交换树脂法离子交换树脂法提取随着离子交换柱在工业上的广泛应用,人们尝试用阴阳离子交换树脂来进行维生素B12的提取,并取得了较好的效果,过程如下所示:发酵液阳离子树脂(LonacC-240)阴离子树脂(LonacAC-300)蒸馏水冲洗收集红色液体部分浓缩冷冻干燥。1.3今后维生素B12的发展方向针对目前国内维生素B12的发展状况,提出如下的发展方向:（1）搞好维生素B12发酵菌株的选育工作,同时可借助于紫外线诱变、原生质体融合等生物技术工程手段,提高单株的产量；（2）进行高密度培养,首先增加生物量,以期提高单位发酵效率;（3）由于目前关于维生素B12的代谢途径和基因表达序列已基本研究清楚，因此,可采用基因工程手段,使该基因片段能在宿主细胞中多次表达,并使其能稳定遗传,将会是维生素B12发酵的一大革命;（4）研制新型的诱导剂,以进一步提高其产量;（5）研制高效专用的生物反应器,采用连续流加培养;（6）采用固定化技术,将菌种包埋或吸附于载2 菌种选育21 菌种的来源维生素12主要由链霉菌（streptomyces)产生，该菌是最大的一群放线菌,属放线菌目,链霉菌属。多数为腐生菌,好氧,革兰氏染色阳性。有发育良好的分枝菌丝，菌丝无横隔，分化为营养菌丝、气生菌丝、65孢子丝。孢子丝再形成分生孢子。孢子丝和孢子的形态、颜色因种而异，是分种的主要识别性状之一。已报道的有千余种，主要分布于土壤中。已知放线菌所产抗生素的90%由本属产生。本次设计选择链霉菌属中的灰色链霉菌来作为菌种。灰色链霉菌的孢子柄直而短，不呈螺旋形。孢子量很多，呈椭圆球形。气生菌丝和孢子都呈白色。单菌落生长丰满，呈梅花形或馒头形，直径约为34mm。基内菌丝透明，在斜面背后产生淡棕色色素。 2.1.1 菌种选择性分离菌种选择性分离的步骤一般是：含微生物材料选择材料的预处理菌种的分离菌种的培养菌种的选择和纯化。1 含微生物材料的选择土壤中的微生物比较多，一般耕作土、菜园土和近郊土壤中有机质含量丰富，营养充足，且土壤成团粒结构，通气保水性好，因而微生物生长旺盛，数量较多尤其适合放线菌的生长（链霉菌也主要分布于土壤中）。2 材料的预处理对于从土壤中分离出链霉菌属可以在养料中加入质量分数为1%的几丁质培养，也可以用CaCO3提高pH进行培养。3 所需菌种的分离所需菌种的分离效率取决于分离培养基的成分，pH和加入的选择性抑制剂等。要分离链霉菌则用几丁质培养基。分离培养基的pH通常在6.77.5之间，在分离培养基中加入制霉菌素（50）亚胺环己酮（50）来增加选择性。4 菌种的培养链霉菌最适生长温度为300C，为嗜温菌，一般培养714天5 菌落的选择本次设计采用铺菌法即：于分离平板上铺一层单一的试验菌的办法可用来测定各个菌落的维生素12生产能力。22 菌种选育育种技术可分为自然分离、经典诱变育种技术和现代生物技术。在自然界中，由于菌种基因自然突变的机率很小，而且突变往往导致菌种退化，符合生产要求的突变非常难求，因此自然选育是比较缓慢和被动的过程。同时在自然分离过程中由于菌种的同源基因反复传代，易引起菌种遗传上的退化。因此自然分离技术目前在工业生产中仅用于维持菌种的优良性状，达到纯化菌种、稳定生产的目的，很少单独用于菌种选育。在此采用诱变育种技术。2.2.1 诱变育种的基本原理诱变育种的理论基础是基因突变。基因突变指的是DNA分子结构中的某一部位发生变化（又称点突变）。根据突变发生的原因又可分为自然突变和诱发突变。所谓自然突变是指在自然条件下出现的基因突变，而诱发突变是指用各种物理、化学因素人工诱发的基因突变。经诱变处理后，微生物的遗传物质，DNA和RNA的化学结构发生改变，从而引起微生物的遗传变异。由于引进了有诱变剂的处理，故诱变育种使菌种发生突变的频率和变异的幅度得到了提高，从而使筛选获得优良特性的变异菌株的几率得到了提高6。2.2.2 诱变育种的一般步骤1.出发菌种的选择链霉菌属的灰色链霉菌，该菌株是生产抗生素的主要菌株，也产维生素B12，来源广，对诱导剂的敏感程度大，变异的幅度广，产维生素B12的发酵水平较高。2.单细胞悬液的制备在诱变有种中，采用生理状态一致的单孢子进行诱变，这样不仅可以使细胞或孢子均匀接触诱变剂，还可以避免分离现象的发生。3 诱变处理仅仅采用诱变剂的理化指标控制诱变剂的用量常会造成误差，所以在诱变处理前，一定要先做诱变剂量对菌体死亡数量致死曲线，选择合适的处理剂量，选择合适的剂量要多次试验才能确定。加入10ml无菌水于新鲜斜面培养物，用接种铲将菌丝刮下，用玻璃珠打碎成菌丝碎片，经一层滤纸过滤，制成菌丝悬浮液。吸取5ml上述菌丝悬浮液于无菌培养皿中，置于波长为253.7nm、功率30W的紫外灯直下30cm处开盖、震荡照射60s。4 突变菌株的筛选诱变处理后，正突变的菌株很少，所以要进行大量的筛选才能得到高产菌株，根据维生素B12生物合成途径和代谢调节理论，对维生素的B12产生菌灰色链霉菌进行了推理选育，经多次紫外诱变才得到维生素B12 的高产菌株，通过初筛和复筛，并确定最佳的发酵条件，才能使链霉菌的生产能力充分发挥出来 23 菌种的保藏菌种保藏是进行微生物研究和微生物育种工作的重要组成部分，其首要任务是使菌种不死亡，同时还要尽可能设法把菌种的优良特性保持下来而不致向坏的方面发展。目前经常采用的菌种保存方法是低温冷冻保藏如液氮保藏法和冷冻干燥法。这两种方法的保藏效果的好坏取决于使用适当的孢子培养基、斜面的培养温度和培养时间、孢子的浓度及添加适当的保护试剂。但这两种方法需要有真空干燥和冷藏设备，另外还需要保护剂，在工业化生产中较少使用，一般仅用于菌种的长期保藏。国内在生产实践中，一般使用沙土管保藏法和低温冻结保藏法。前者效果较好，操作简便，保存期在一年以上；后者的优点是存活率高，变异率低，使用方便。综合考虑本次设计选用甘油菌丝冷冻保藏法，可使菌种保存12年左右还保存能产维生素12的能力。具体做法：将冻干管中的孢子周无菌水洗出后接种到斜面培养基上培养。待孢子生长成熟后进行如下操作步骤：(a)在斜面上加入9 mL无菌水，用棉签轻轻洗下孢子，使孢子悬浮于无菌水中；(b)将洗下的孢子悬液倒入装有1 0颗直径为23 mm玻璃珠的三角瓶中，放在摇床上220 rpm，振荡l h左右；(c)脱脂棉过滤孢子悬液，除去菌丝片段和固体培养基碎片；(d)3000 rpm离心1 5 min以使孢子沉淀，马上倒掉上清液；(e)将离心管在振荡器上振荡几秒钟使孢子沉淀物分散于残存的无菌水中；(f)加入无菌的40甘油和5乳糖，-200C冷冻保藏。使用前需洗涤两次，充分去除甘油对孢子活力的影响。3 培养基的配置3.1 培养基配置的原则培养基是指可供微生物细胞生长繁殖所需的一组营养物质和原料，同时也为微生物生长提供除营养外的其他生长所需的条件。原则上满足必须的原料；生化反应的基本条件（温度、溶氧和pH）；来源丰富、价格低廉、取材方便、质量稳定；培养基成分不影响下游产品的提取加工。3.2 培养基类型培养基可以按照用途可以分成孢子培养基、种子培养基和发酵培养基。(1)孢子培养基孢子培养基是供菌种繁殖孢子的一种常用固体培养基，对这类培养基的要求是能使菌体生长迅速,产生数量多而且优质的孢子,并且不会引起菌体变异。(2)种子培养基种子培养基是供孢子发芽、生长和大量繁殖菌丝体，并使菌丝体长的粗壮，成为活力强的“种子”。(3)发酵培养基发酵培养基既要有利于生长繁殖，防止菌体过早衰老，又要有利于产物的大量合成。要求培养基的组成应丰富、完全，碳、氮源要注意速效和迟效的互相搭配，少用速效营养，多加迟效营养，还要考虑适当的碳氮比，加缓冲剂稳定pH值；并且还要有菌体生长所需的生长因子和产物合成所需的元素、前体和促进剂等。3.3 链霉菌的培养基及培养条件菌种活化：将冷冻甘油管中的菌丝悬液或冻干管中的孢子洗出液转接于新鲜斜面培养基上，30下培养710天左右，转置于40C冰箱保存备用。培养基：(1)斜面培养基：可溶性淀粉2，黄豆饼粉1，K2HP04 025，NaCI 0.2，MgS04005，CaC03 03，琼脂18，pH 65。(2)种子培养基：可溶性淀粉17，葡萄糖1，黄豆饼粉15，蛋白胨05，酵母粉05，KN03 025，NaCl 02，CaC03 04，pH 6.8。(3)发酵培养基：淀粉4，葡萄糖1，黄豆饼粉1，蛋白胨05，鱼粉1，酵母粉O3，NaN03 0075，(NH4)2S04 015，MgS047H20 035，KH2P04 002，CaC0304，pH 67-70。以上培养基均在121下灭菌20min。培养方法:斜面培养：将涂有菌液或孢子悬液的斜面置于30、相对湿度4060N恒温恒湿培养箱中培养710天。种子培养：将适量新鲜斜面或甘油管保藏的菌液接种至装有25mL种子培养基的250mL三角瓶中，置于220rpm、30的恒温摇床中培养40-48h。固定化种子培养：将预处理过的固定化介质若干投至含有30mL种子培养基的摇瓶发酵培养：以8接种量将种子液接入装有25mL发酵培养基的250mL三角瓶中，置于240rpm、25的恒温摇床中培养7284h。3.4 培养基的营养要求3.4.1 碳源碳源是组成培养基的主要成分之一。其功能主要有两个：一是为微生物菌种的生长繁殖提供能源和合成菌体所必需的碳成分；二是为合成目的产物提供所需的碳成分。常用的碳源有糖类、油脂、有机酸和低碳醇等。糖类是发酵培养基中最常用的碳源，主要有葡萄糖、糖蜜和淀粉糊精等。葡萄糖是最容易利用的碳源，几乎所有的微生物都能利用葡萄糖。所以在本设计中选择了葡萄糖作为碳源。3.4.2 氮源氮源是构成细胞中所含蛋白质、核酸、酶等成分，以及代谢产物中氮素来源的营养物质，所地中海拟无枝酸菌在生长时均可利用无机氮源。工业生产中通常使用的氮源有氨、铵盐和尿素。当培养基中碳源不足时，可作为补充碳源。本设计采用的氮源有黄豆饼粉、鱼粉、蛋白胨、硝酸钾。3.4.3 无机盐及微量元素在复合培养基中已经存在，一般就不需再添加。为了调节pH，中和代谢过程中所产生的有机酸，尚需加人CaCO3。Co+是一种酶的激活剂，又是生物合成维生素B12的前体，通常需加入极微量，K+有促进生长的作用，Na+与维持细胞渗透压有关，通常加入0.25左右量的NaCl即可，增加用量会明显影响菌的生长繁殖。Mn2+、Mg2+对链霉菌菌丝生长有明显作用。Fe2+浓度超过60ugmg以上，就要产生毒性，显著影响链霉素的产量，而对菌丝体生长影响较小，一般适用量在20ugul左右。3.4.4 水水是所有培养基的主要成分，也是微生物机体的重要组成成分。水是良好的溶剂，又是活细胞中一切代谢反应的媒介物，还可以维持细胞中的渗透压，同时水又是热的良好导体，有利于散热，可调节细胞温度。3.4.5 生长因子和促进剂生长因子是微生物生长不可缺少的微量有机物，如氨基酸，嘌呤，嘧啶，维生素等。酶的生产中所需的生长因子大多由天然原料提供。玉米浆、麦芽汁、豆芽汁和酵母等，含有丰富的生长因子。产酶促进剂一般是该酶的底物和底物类似物，向培养基添加表面活性剂以改善细胞膜的通透性或诱导酶的生成，在一定条件下可以显著地促进产物的生产。4 灭菌所谓灭菌，就是指用物理或化学方法杀灭或去除物料或设备中一切有生命物质的过程。4.1 仪器灭菌接种环应用火焰灼烧法灭菌；摇瓶、试管应用蒸煮法灭菌。经过灭菌是仪器不要暴露于空气中或于其它的未知仪器接触，并及时使用，以免再次带菌。4.2 培养基灭菌4.2.1 灭菌方法灭菌，就是指用物理或化学方法杀灭或去除物料或设备中一切有生命物质的过程。常用的灭菌方法有以下几种：(1)化学药剂能使微生物中的蛋白质、酶及核酸发生反应而具有杀菌作用，如甲醛、氯、高锰酸钾、环氧乙烷等。(2)紫外线灭菌：波长为（2.13.1）10-7m的紫外线有灭菌作用，最常用的波长为2.53710-7m的紫外线，但紫外线的穿透力低不适用于培养基灭菌。(3)干热灭菌的条件为在160下保温1小时。适用于一些要求干燥的实验器具和材料的灭菌。(4)湿热灭菌即利用饱和水蒸气进行灭菌。通常的蒸汽灭菌条件为在121（表压约0.1MPa）维持30分钟。4.2.2 培养基的湿热灭菌本实验采用湿热灭菌，条件为在121（表压约0.11MPa）维持30分钟。对培养基进行湿热灭菌时，培养基中的微生物受热死亡速率与残存数量成正比，即 （41）式中：N 培养基中活微生物的个数；为微生物受热时间，s； 为比死亡速率，；若开始灭菌时（=0），培养基中或微生物数为N0，将式（41）积分可得 或 上式被称为对数残留定律。其中N为经时间灭菌后培养基中活微生物数。4.2.3 培养基湿热灭菌的方法分批灭菌 将先配制好的培养基放在发酵罐或其他容器中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起灭菌的操作过程（适用于小型发酵罐）。连续灭菌 将配制好的培养基在通入发酵罐时进行加热、保温、降温的灭菌过程。培养基的分批灭菌的缺点是对培养基成分破坏大，升降温时间长，而连续灭菌时培养基在短时间内被加热到灭菌温度，短时间保温后被快速冷却，再进入早已灭完菌的发酵罐，这样不但可以节省时间，更重要的是减少了培养基的破坏率， 其流程图如图2所示。图2 连续灭菌的流程图4.3 空气除菌大多数生物培养基都需要氧气，通常以空气作为氧源。根据国家药品生产质量管理规范（GMP）的要求，生物制品、药品的生产场地业需要符合空气洁净度的要求。过滤是空气除菌的主要手段，按过滤介质孔隙将空气过滤器分为两类：绝对过滤和相对过滤。过滤介质有棉花、玻璃纤维、活性碳等。4.3.1 过滤除菌流程及设备流程如下：采风塔空气粗过滤器空气压缩机储气罐冷却器旋风分离器冷却器丝网除沫器空气加热器总空气过滤器。设备如下：（1）采风塔：采风塔建在工厂的上风头，高至少10米，气流速度8m/s。（2）粗过滤器：主要作用是拦截空气中较大的灰尘以保护空气压缩机，同时起一定的除菌作用，减轻总过滤器的负担。（3）空气压缩机：作用是提供动力，以克服随后各设备的阻力。（4）空气储罐：作用是消除压缩空气的脉动。要求：H/B=22.5 , V=（0.10.2）V1 其中，H为罐高；B为罐直径； V1为空压机每分钟排气量（20，1105Pa状况下）。（5）旋风分离器：是利用离心力进行气-固或气-液沉降分离的设备。作用是分离空气中被冷却成雾状的较大的水雾和油雾粒子。（6）冷却器：空压机出口温度气温在120左右，必须冷却。另外在潮湿的地域和季节还可以达到降湿的目的。（7）丝网除沫器：可以除去空气中绝大多数的20m 以上的液滴和1m以上的雾滴，一般采用规格为直径0.2540孔且高度为150的不锈钢丝网。（8）空气加热器：列管内走空气，管外走蒸汽。（9）总过滤器：填充物按下面顺序安装：孔板铁丝网麻布活性炭麻布棉花麻布铁丝网孔板。介质要紧密均匀，压紧一致，上下棉花层厚度为总过滤层厚度的1/4,间活性炭层为1/3。空气除菌的目的是出去空气中的微生物，关键在于保证介质的干燥，要求空气湿度小于50%。气净化系统流程，如图2-2所示。 图3 空气净化系统流程图4.3.2 无菌空气的检测现在采用的无菌实验方法有肉汤培养法、斜面培养法和双碟培养法这里我们采用斜面培养法来检查。具体方法如下：500 mL三角瓶内装斜面培养基50mL,其组成为可溶性淀粉2，黄豆饼粉1，K2HP04 025，NaCI 0.2，MgS04005，CaC03 03，琼脂18，pH 6.57.0，接种后置旋转式摇床，(301)下培养28h左右备用。5 种子扩大培养种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种的过程。本发酵属于二级种子罐扩大培养，三级发酵。设计流程如下：孢子锥形瓶种子罐发酵罐种子制备的工艺流程如图3所示： 图1 种子扩大培养流程图5.1 实验室种子制备保藏在沙土管或冷冻干燥管中的菌种经无菌手续接入合适于孢子发芽或菌丝生长的斜面培养基中，经培养成熟后挑选菌落正常的孢子可再一次接入试管斜面，对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌落可以采用固体培养基培养孢子，孢子可直接作为种子罐的种子，这样操作简单，不易污染杂菌。对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的灰色链霉菌可以用摇瓶液体培养法。孢子接入含液体培养基的摇瓶中，于摇床上恒温振荡培养，获得菌丝体，作为种子。5.2 生产车间种子制备将生产菌种悬浮液用微孔接种法接入种子罐进行扩大培养，种子罐之间的转接采用压差接种法，种子罐接入发酵罐也采用压差接种法。种子罐级数确定的原则：保证种子量足够，满足生长需求。尽量减少级数，简化工艺，减少污染。种子罐培养的目的是使种子量增大，以缩短发酵罐的发酵延滞期。灰色链霉菌属于放线菌，因其生长速度较慢，产维生素12采用三级种子罐，也称四级发酵。若取接种量为10。三级种子罐用一个种子罐，体积为V3=10010=10m3。二级种子罐用一个种子罐，体积为V2=1010=1m3。则一级种子罐也用一个种子罐，体积为V1=110=0.1m3，一级种子罐到二级种子罐采用压差接种法。种子罐的体积按照接种量来确定。5.3 影响种子质量的因素影响种子质量的因素有原材料的质量，培养条件（温度、湿度、通气量）和斜面冷藏时间。生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象，其主要原因是原材料质量波动。原材料质量的波动，起主要作用是其中无机离子含量不同。种子质量的控制可以通过菌种稳定性检查，无菌检查，保证原材料质量和控制培养条件等。6 发酵过程的工艺控制6.1 发酵过程技术原理微生物发酵过程可分为：分批发酵、补料-分批、半连续（发酵液带放）和连续发酵。分批发酵是一种准封闭式系统。补料-分批发酵，即在分批发酵（一次性加入发酵罐内等发酵完全后放罐）的基础上，加入新鲜的料液，也克服由于养分的不足导致发酵过早结束。连续发酵是在发酵过程中一边补入新鲜的料液，一边以相近的流放速放料，维持发酵液原来的体积。本设计采用半连续发酵，即在补料-分批发酵的基础上加上间歇放掉部分发酵液，放掉部分发酵液，再补入适当料液不仅补充养分和前体而且代谢有害物被稀释，从而有利于产物的继续合成。6.1.1 发酵过程中接种量的控制接种量对发酵过程的影响很大，主要是影响菌体量，菌体的生长状态以及发酵液中溶氧状况，从而影响产酶。分别考察2%、4、6、8、10的接种量对VB12的产量、菌体干重以及溶氧的影响。实验结果得出，随着接种量的增大，菌体量增加迅速，接种量为10时，在发酵到36h时，菌体量达到最大。但接种量过大，发酵前期菌体大量繁殖，发酵液迅速变得粘稠，导致整个发酵体系溶氧水平下降，供氧不足，从而影响产量。可见，接种量的选择对VB12的合成有着非常重要的影响，从发酵各参数考虑，选择10的接种量较为合适。6.2 发酵条件的影响维生素B12的发酵生产水平取决于生产菌种的特性和发酵条件（包括培养基）的控制）。其中发酵条件包括：发酵温度、溶氧、Ph、培养基营养成分等。6.2.1 温度对维生素B12发酵的影响菌体的生长和合成抗生素的代谢活动都是在各种酶的催化下进行的，然而酶的催化作用需要有适当的温度。从酶反应动力学来看，随着温度的升高，酶的活性加强，反应速率加大，生长代谢加快，抗生素分泌期提前，但温度过高，则酶易失去活性，菌体易迅速衰老，发酵周期缩短，抗生素产量就降低，因此维持产生菌的生长和合成抗生素所需要的最适温度是抗生素发酵的重要条件。研究表明, 灰色链霉菌对温度敏感。一般认为维生素B12发酵温度以30左右为宜。6.2.2 溶氧对维生素B12发酵的影响维生素B12由链霉菌发酵产生，灰色链霉菌是一种高度需氧菌，维生素B12组成部分咕啉醇酰胺（B因子）生物合成前期的两种主要酶受到养的阻遏，限制养的供给，才能积累B因子，B因子在供氧的情况下，才能转变成维生素B12。发酵前期菌丝体大量繁殖，需氧量大于供氧，溶氧出现一个低峰。在生长阶段，产物合成期，需氧量减少，溶氧稳定，但受补料、加油等条件大影响。补糖后，摄氧率就会增加，引起溶氧浓度的下降，经过一段时间以后又逐步回升并接近原来的溶解氧浓度。如继续补糖，又会继续下降，甚至引起生产受到限制。发酵后期，由于菌体衰老，呼吸减弱，溶氧浓度上升，一旦菌体自溶，溶氧浓度会明显上升。在进行维生素B12工业化生产时，以此来确定发酵罐的通气量和搅拌功率。6.2.3 PH对维生素B12发酵的影响无机氮源是决定维生素B12产量的重要因素。据文献报道NH3-N能被菌体快速利用并促进菌体生长，并由此控制pH，并调节了pH在适合于维生素B12合成内，也补充了产物合成所需N的来源，维生素B12的合成最适范围为6.87.0,pH过高或过低，对发酵都不好，pH不适合的时候，可以用酸碱缓冲剂来调节。6.2.4 无机盐对维生素B12发酵的影响无机盐是菌丝生长所必需的重要元素，能促进菌丝的生长，但在维生素B12的发酵中，过多的无机盐会形成大量无活性的维生素B12。并且在发酵罐培养时还发现，在培养基中适当增加磷酸盐，可延缓菌丝衰老、自溶，减少发酵液的泡沫，可以改善发酵液的质量，有利提取过滤。6.3 发酵过程中周期的控制优化后的培养基，以葡萄糖为碳源发酵生产维生素B12通过单因素试验确定的培养条件为接种量10%,种龄48h,装液量75/300 ml三角瓶,培养基初始pH 值6.8,30静止发酵,周期为144h, 维生素B12的产量为5.7g/l 6.3.1 发酵过程中消泡的控制发酵过程中泡沫较大，除在基础料中加入0.1%泡敌外，还以（花生油：泡敌= 5：1）作为混合消泡剂于发酵过程中滴加控制泡沫。6.3.2 染菌的控制在工业发酵中，染菌轻则影响产品的质和量，重则倒罐，颗粒无收，严重影响工厂的效益。因此要采取一些防治措施。控制染菌可以通过降低培养温度，调整补料量，调pH值，缩短培养周期等措施予以补救。若是前期染菌，应重新灭菌，补加一些营养，重新接种再用。中期染菌，应偏离杂菌生长条件，到达一定水平则可以提前放罐。后期染菌，如果染菌不多，对生产影响不大，严重的话可提前放罐。可能出现的异常发酵现象：（1）培养基变稀：可能是噬菌体污染或营养成分缺乏；（2）培养基过浓：会抑制微生物的生长，考虑可能是污水污染；（3）耗糖较慢：可能原因是种子生长能力降低，检测种子是否衰退，发酵条件是否合适，以及营养成分是否全面，尤其注意缺磷；（4）pH值不正常：用缓冲对来调节，检查是否染杂菌，碳氮比是否合适；（5）生长缓慢：最可能的原因就是营养成分不足。6.3.3发酵热的计算发酵过程中发酵热的热量平衡方程： Q发酵= Q生物+Q搅拌-Q蒸发-Q辐射发酵热的大小与反应的品种、发酵时间等有关。一般在1040033500kJ/(m3h)。可以通过测定一定时间内冷却水的流量和冷却水进出口温度。Q发酵=Gc(t2-t1)/V 式中：G冷却水流量，L/h； c水的比热容，kJ/(kg)；t1、t2进出口冷却水温度，； V体积，m37 下游加工7.1 下游加工过程下游加工过程是生物工程的一个组成部分，是生物化工产品通过微生物发酵过程、酶反应过程或动植物细胞大量培养获得，以上述发酵、反应液或培养液分离、精制有关产品的过程。下游加工过程可分为4个阶段：发酵液的预处理和固液分离；细胞破碎；初步纯化（提取）；高度纯化（精制）。7.1.1发酵液的预处理和固液分离发酵液预处理和固液分离的目的：分离菌体和其他悬浮颗粒(细胞碎片、核酸和蛋白质的沉淀物)；除去部分可溶性杂质和改变滤液性质，以利于提取和精制的顺利进行。发酵液的预处理：采用理化方法设法增大虚浮液中固体粒子的大小、或降低粘度，以利于过滤。去除会影响后续提取的高价无机离子。（一）预处理的方法高价无机离子的去除方法；杂蛋白质的去除；发酵液的凝聚和絮凝。7.1.2 维生素B12的提取发酵终了时，所产生的维生素B12，有一部分是与菌丝体相结合的。对于维生素B12提取,不断有新的方法提出,主要有两种,一种为溶剂提取法,另一种为离子交换树脂法(一)有机溶剂提取研究表明,采用两相混合溶剂,可简单地纯化和提取出来,常用的溶剂为苯甲醇和水的混合溶液,基本过程如下:发酵液吸附(活性碳)洗脱(吡啶)浓缩层析(Al2O3)洗脱(甲醇)收集红色液浓缩结晶（二）离子交换树脂法离子交换树脂法提取随着离子交换柱在工业上的广泛应用,人们尝试用阴阳离子交换树脂来进行维生素B12的提取,并取得了较好的效果,过程如下所示:发酵液阳离子树脂(LonacC-240)阴离子树脂(LonacAC-300)蒸馏水冲洗阴离子树脂收集红色液体部分浓缩冷冻干燥7.1.3维生素B12结晶过滤发酵液，收集菌体，水解，调节pH值为中性，首先用酚-丁醇进行提取，再用酚-氯仿进行提取，酸化，加温释放，滤袋过滤，膜过滤，二次酸化，过层析柱，丙酮洗脱，收集洗脱液，干燥得B12。另外，在发酵过程中有机酸的不断积累抑制了菌体生长，延长了发酵周期，影响了维生素的产量和质量，研究表明采用两步发酵法可解决此问题，第一步是厌氧发酵，可提高细胞生物量；第二步是好氧发酵，以分解丙酸。具体到工业化生产还有待于进一步研究。好氧发酵工艺是目前工业化生产B12 的主要工艺, 全球80%以上产量来自该工艺。8 发酵罐的工艺设计8.1 发酵罐的结构因为链霉菌属于放线菌，所以应采用好氧发酵设备。本设计采用通用式发酵罐。通用式发酵罐的主要组成部件有：罐体：发酵罐的主要结构，其内壁有挡板，作用是使液内充分湍流，使营养物质与菌体接触更充分，一般用4-6块挡板。搅拌装置：主要功能是使罐内物料混合均匀，搅拌器叶轮多采用搅拌涡轮式，搅拌轴要与罐体密封严实，防止漏液和染菌。搅拌转速为200r/min.传热装置：有夹套，列管等，这里采用外夹套。通气部分：通过空气分布器将通入的无菌空气均匀分布到发酵液中，发酵罐通风量0-12 h为1：0.67vvm ,12 h至发酵结束通风量为1：（1.0-1.33）vvm 。分布器有单管式和环形管式。消泡装置：用于消除产生的泡沫，最有效的控制泡沫的方式为添加消泡剂。但是，由于消泡剂大多对菌体生长有抑制作用，故最常选用的简单实用的消泡装置是耙式消泡器，直接装在搅拌轴上，利用机械力量改变泡沫表面张力，达到消泡目的。进出料口：罐顶设有进料口，罐底有出料口。其他附属设备还包括试镜、人孔、取样管等，用以观测和检修。管道系统，包括试镜、取样管、pH值探头、温度探头、溶氧探头等，用以随时观测、调节和检修。发酵罐设备的结构图，见附图8.2 发酵罐的工艺尺寸常用的机械搅拌通风密闭发酵罐的结构和主要几何尺寸已标准化设计（见附图）。其几何尺寸比例如下：H0/D=2：1 H/D=2.54.0:1 d/D=1/31/2 W/D=1/121/8 B/d=0.81.0 h/D=1/4 单位全部为：m发酵罐大小用公称体积表示，V0=D2H/4+0.15D3其中：H0-发酵罐圆柱形筒身高度 D-发酵罐内径 H-罐顶到罐底的高度d-搅拌器直径W-挡板宽度B-下搅拌器距罐底的距离 S-搅拌器间距h-底封头或顶封头高度 8.2.1 发酵罐的计算年生产2吨维生素B12的生产日为245天，发酵周期为6天，清理及维修发酵罐总时间为1天，则发酵总时间为7天，产量为5.7g/L,发酵液预处理收率约为85%，提取时收率约为90%，浓缩干燥收率为95%，装料系数为70%。一年需放罐的次数：245/7=35次每批次产维生素B12：2/35=0.05714吨总提取率为：85%90%95%=72.675%假设用一台发酵罐，则发酵罐的体积V=0.057141000/5.7/72.675%/70% =19.7m3所以选用V0=20m3的发酵罐，则需发酵罐1个由V0（公称体积）=Va（筒身容积）+Vb（底部）D2H0/4+0.15D3得D=3.1m（H0=2.0D）那么：H0=2.0D=2.03.1=6.2 m H=3D=33.1=9.3 md=D/2=0.53.1=1.55m W=D/12=3.1/12=0.26mB=0.9d=0.91.55=1.4 m S=2d =21.55=3.1mh=D/4=3.1/4=0.775m 液面高度HL=0.7(H+h)=0.7(9.3+0.775)=7.05m8.3 物料衡算维生素B12发酵工艺指标如表3-1所示。指标名称单位指标数生产规模t/a2年生产天数产品日产量d/akg/d2458.16产品质量65%倒罐率发酵周期%d27发酵辅助时间菌种培养时间菌种培养辅助时间接种量发酵罐装料系数发酵放罐单位提取总收率hhh%u/mL%1248101070175072.67表8-1维生素B12发酵工艺指标本设计采用1个发酵罐，每个为20m3，维生素B12产量为5.7g/L, 发酵液预处理收率约为85%，提取时收率约为90%，浓缩干燥收率为95%，装料系数为70%（上面表说的就是这些）。则：每个发酵罐在一个发酵周期维生素B12产量为：205.790%85%95%0.7=57.995（kg）那么1个发酵罐1年的总产量为：（57.995245/7）1=2029.81（kg）=2.02981吨故符合年产量为2吨的生产要求。8.3.1 发酵液组成衡算20m3发酵罐的装料系数为0.7，则该罐的装料为：200.7=14m3因为发酵培养液的组成(%)为：淀粉4,葡萄糖1，黄豆饼粉1，蛋白胨05，鱼粉1，酵母粉O3，NaN03 0075，(NH4)2S04 015，MgS047H20 035，K2HP04 002，CaC0304，CoCl2 lugml, 消泡剂0.04。因此，20m3发酵罐的淀粉用量: 1410000.04=560 kg20m3发酵罐的葡萄糖用量：1410000.01=168kg20m3发酵罐的蛋白胨用量：1410000.005=70kg20m3发酵罐的黄豆饼粉用量：1410000.01=140kg20m3发酵罐的鱼粉用量：1410000.01=140kg20m3发酵罐的酵母粉用量：1410000.003=42kg20m3发酵罐的NaN03用量：1410000.00075=10.5kg20m3发酵罐的(NH4)2S04用量：1410000.0015=21kg20m3发酵罐的MgS047H20用量：1410000.0035=49kg20m3发酵罐的K2HPO4用量：1410000.0002=2.8kg20m3发酵罐的CaC03用量：1410000.004=56kg20m3发酵罐的CoCl2用量：1410-9 kg20m3发酵罐的消泡剂用量：1410000.0004=5.6kg维生素B12发酵车间物料衡算汇总见表3-2所示。物料名称2t/a维生素B12生产的物料量/kg每日物料量/kg成品维生素B12量/kg发酵液量/ m3种子液量/ m3玉米淀粉量/kg(NH4)2SO4用量/kg葡萄糖用量/kg蛋白胨用量/kg黄豆饼粉用量/kg鱼粉用量/kg酵母粉用量/kgNaN03用量/kgK2HPO4用量/kgMgS047H20用量/kgCaC03用量/kgCoC