Western超详细实验步骤.doc

Western实验步骤 1. 电泳(Electrophoresis) （1）SDS-PAGE凝胶配制 SDS-PAGE凝胶进行配制，配方试剂去离子水，Arc-HCL(29:1)，10%APS，SDS,TEMED。 一般按分子大小配胶，现实验分离胶配12%-15%的胶，浓缩胶10%的胶。配胶步骤： 1.清洗玻璃板，装好（注意不要漏即玻璃板要对齐）。 2.按比例配分离胶（8ml-10ml） 3.加水压胶，待分离胶凝固后（可见有分离胶与水有分隔线，一般凝固时间30分钟-1小时左右），吸走上层水面 4.按比例配浓缩胶（3ml-4ml），加入分离胶上层，插入梳子，（注意别有气泡），待凝。（如果今日不上样可以放入4C冰箱） 注意：玻璃板要洗得干净；玻璃板要装好，不要漏；制胶过程中，一定要充分混匀，而且避免有气泡；（2）样品处理 1.准备无菌EP管，向EP管内加入样品蛋白质体积的1/4体积的SDS缓冲液（5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，现样品加3.5ul），之后加入相应蛋白样品（要制冰，蛋白质样品要放置在冰上），充分吹打混匀 2.100水浴加热5分钟，以充分变性蛋白。 3.12000r离心5分钟。（3）上样与电泳 1.将玻璃板装入电泳槽中，加电泳缓冲液至泳槽的的2/3左右2.蛋白质样品冷却到室温后，直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可，样品两边加蛋白质Maker(6ul)（注意上样蛋白质顺序，一定不要弄错）。3.通常把电压设置在100V，然后设定定时时间为100分钟（一般为90-120分钟）。设置定时可以避免经常发生的电泳过头。通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。（为了避免电泳过头，最好是在电泳设定时间的提前30分钟观察电泳）注意：上样时尽量避免样本被上漏出孔外；注意电泳时间的把握；最重要的是一定要记录上样顺序，必要时记录在本子上。 3. 转膜(Transfer) 1.物品准备，甲醇，转膜缓冲液，滤纸，转膜槽，玻璃皿3个，制冰。2.取下胶板，用专门的板将玻璃板分离（务必不要将胶弄破，动作轻些，从下面和上面分离玻璃板），切适合大小的胶（不要切掉MAKER）。3.用专门的板将胶转入事先放有转膜缓冲液的皿中，记录胶的顺序，剪与胶同等大小的滤纸和转膜纸PVDF膜，PVDF膜要放入甲醇中浸15秒（一般1-2分钟），胶要切角做标记（不要切到maker）,一般一个切三个角，一个切一个角，记录顺序4.铺膜，PVDF膜铺在胶上，在PVDF膜上铺三层滤纸，然后胶的对侧面铺三层滤纸即可（滤纸要大于等PVDF膜，PVDF膜要大于等胶），赶尽气饱。5.再将铺好的膜胶滤纸，转入转膜夹中，有PVDF膜这面放在正极侧（即无色透明夹这面），再将夹子放入转膜槽里（电极不要放错，蛋白质带负电的）6.转膜，槽放入冰中，槽内放冰槽，设定转膜电流为300-400mA，电压120伏，转膜时间为40分钟（30-60分钟）。注意：实验选用PVDF膜但硝酸纤维素膜比较脆，在操作过程中特别是用镊子夹取，膜不要碰到其他地方特别是手不要碰到膜；动作要轻；赶尽气饱；正负极不要弄错；记录胶的顺序；通常如果使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，可以设定转膜电流为300-400mA，电压120伏，转膜时间为30-60分钟。也可以在15-20mA转膜过夜。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。 在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。 转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。转膜的效果也可以用丽春红染色液对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝快速染色液对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。 4封闭 1.转膜完毕后，将蛋白膜放入，TBS漂洗1-2分钟 2.再用TBST封闭，在摇床上摇1小时，装入薄膜内配制TBS:1MtriHCL (PH8.0) 10ML,1M NaCL 150ml,dd水 840ml；TBST(MILLK)：5%millk（脱脂奶粉）,0.1%tween20,TBS注意：从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景；对于一些背景较高的抗体，可以4封闭过夜。5. 一抗孵育(Primary antibody incubation) 1.切所需蛋白条带后，参考一抗的说明书，按照适当比例用TBST（有奶粉的）稀释一抗。放置在冰上2.有薄膜将所需条带封住，立即加入稀释好的一抗后，封口，4孵育过夜。 注意：其实室温或4在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果一抗孵育一小时效果不佳，可以4缓慢摇动孵育过夜。或更据抗体的说明选择适当的孵育温度和时间。6. 二抗孵育(antibody incubation)1.回收一抗。2.取出膜，放入TBST(没MILLK)中摆摇床上缓慢摇动洗涤5分钟（5-10分钟），共洗涤3次注意：如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数，一般洗膜后以MAKER条带背景变淡一些为好。 3.参考二抗的说明书，按照适当比例用TBST(MILLK)稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。 二抗需根据一抗进行选择，例如，一抗是小鼠来源的IgG，则二抗需选择抗小鼠IgG的二抗4.立即加入稀释好的二抗，室温或4在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。 回收二抗。5取出膜，放入TBST(没MILLK)中摆摇床上缓慢摇动洗涤5分钟（5-10分钟），共洗涤3次，如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数7.显色和曝光1.物品准备：显色试剂A、B(A;B=1ml:25ul)，显影液，定影液，保鲜膜，胶片2.倒掉脱洗液，在曝光盒里铺好保鲜膜；再在皿里将条带铺好（蛋白面朝上），关灯暗室中配好的显色液，加入铺好的膜上（要完全覆盖膜）3.将蛋白膜铺好在保鲜膜上（要脱掉些显色液），盖上保鲜膜，剪适当大小胶片，曝光，曝光时间分别是15秒、30秒、60、秒4.曝光后将膜放入显影液中，显影片刻（看到条带出现即可），放入定影液中定影片刻；5.曝光结束后，清水洗胶片，晾干8. 膜的重复利用(Membrane recovery) 如果蛋白膜需要再次利用可以使用stri