《蛋白质II》PPT课件.ppt

蛋白质 II 蛋白质的结构 蛋白质的共价结构 蛋白质的一级结构 Primarystructure 定义 蛋白质的共价结构 即蛋白质分子内部通过共价键连接而形成的结构形式氨基酸在蛋白质内的排列顺序二硫键的位置和连接顺序侧链基团的修饰和连接情况是否磷酸化 磷酸化位置是否糖基化 糖基化位置 糖链组成是否酯化 酯化位置 酯的组成是否有辅基或其他分子 连接方式 肽键蛋白质是氨基酸通过脱水缩合形成肽键而形成的实验证据 1 蛋白质分子中游离的 氨基 羧基很少 若水解 游离 氨基 羧基以等mol数增加 说明 氨基 羧基参与某种结合 水解时 这种结合断开 2 人工合成肽可以被蛋白酶水解O 3 包含 C N H基团的化合物如双缩脲H2N CO NH NH2能与硫酸铜 氢氧化钠溶液产生双缩脲颜色反应 天然蛋白质也存同样反应 4 人工合成的多聚AA的X射线衍射图案和红外吸收光谱与天然的纤维状蛋白质十分相似 5 我国在世界上首次人工合成蛋白质 结晶牛胰岛素的成功 完全证明了蛋白质的肽链结构学说的正确性 肽键的特点酰胺键 由于酰胺氮上的孤对电子与相邻羰基的共振作用 表现出高稳定性C N具40 双键性质C O具40 单键性质共振杂化体亚氨基 NH pH0 14没有明显的解离和质子化倾向肽键是一个平面 称肽平面 可以有反式顺式结构 但旋转能障较高 反式稳定 Pro例外 蛋白质中的每一个氨基酸单位称氨基酸残基 residue 肽链结构的命名与书写根据含Aa的数目命名 肽从NH2末端Aa残基开始 称为 某氨基酰某氨基酰某氨基酰 氨基酸书写时氨基端在左边 羧基端在右边 以氨基酸的三字缩写或单字缩写代表对应的氨基酸 用短横线代表氨基酸残基之间的肽键 肽的物理化学性质 一般物理性质短肽晶体 熔点很高 离子晶体 偶极离子 肽的两性解离决定于游离氨基末端 游离羧基末端以及侧链基团肽链羧基的pK 比氨基酸的大一些 而氨基的pK 则要小一些多肽等电点的计算中性肽的等电点酸性肽的等电点碱性肽的等电点 常见化学反应N端氨基酸残基与茚三酮 DNFB PITC等反应C氨基酸残基成酯 成酰胺 成盐侧链氨基酸的反应磷酸化 Tyr Ser Thr酯化 Ser Thr Tyr糖基化 Ser Thr Cys双缩脲反应 Biuretreaction 多肽与CuSO4碱性溶液反应 生成紫红色或蓝紫色的复合物 540nm处有最大光吸收 为肽和蛋白质特有 两个或两个以上肽键 氨基酸没有该反应 天然活性多肽 定义 在生物体中 多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位 但是 也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在 这类多肽通常都具有特殊的生理功能 常称为活性肽常见活性多肽谷胱甘肽 GSH Glu Cys Gly巯基缓冲剂 脑啡肽 enkephalins 神经系统中产生的一类短肽 具有多种特殊生物学功能 蕈毒素 蛇毒素 鹅膏蕈碱 能与真核生物的RNA聚合酶 RNApolymerase 和 牢固结合而抑制酶的活性 因而使RNA的合成不能进行 但不影响原核生物的RNA合成 短肽类抗生素 蛋白质一级结构测定 氨基酸顺序测定的一般步骤要求 样品均一纯度97 以上已知分子量 误差小于10 一般步骤 测定蛋白质分子中多肽链的数目蛋白质末端残基 NH2末端 COOH末端 mol数蛋白质的分子量 拆分蛋白质分子的多肽链测定多肽链的Aa组成分析多肽链的N末端和C末端残基断裂多肽链内的二硫键过甲酸氧化巯基化合物还原多肽链断裂成肽段酶解法化学法测定各个肽段的Aa顺序Edman降解法确定肽段在多肽链中的次序确定原多肽链中二硫键的位置 多肽N末端分析方法二硝基氟苯 DNFBorFDNB法 Sange试剂丹磺酰氯 DNS 法原理 与DNFB相同优点 DNS具强烈的荧光 检测灵敏度可以达到1 10 9mol比DNFB法高100倍苯异硫氰酸酯 PITC 法氨肽酶法 氨肽酶 可以从多肽链的N端逐个降解氨基酸的肽链外切酶亮氨酸氨肽酶 LAP 水解以Leu为N末端的肽键速度为最大 多肽C末端分析方法肼解法蛋白质or多肽 无水肼 C末端Aa以游离形式存在 其他Aa转变为相应的Aa酰肼化物加入苯甲醛可以使Aa酰肼化物转变成二苯基衍生物沉淀 C末端Aa则在溶液中 缺点 Gln Asp Cys破坏不易测出 Arg Orn还原法 肽链C末端Aa 硼氢化锂 氨基醇羧肽酶法最有效 最常用的测C端殘基方法羧肽酶 专一地从肽链的C端逐个降解 释放出游离Aa肽链外切酶 多肽链的部分断裂和肽段的拼接常用蛋白酶 内切酶 胰蛋白酶 Trypsin 专一性强 只断裂Lys Arg的羧基参与形成的肽键可以通过修饰增加或减少酶切位点糜蛋白酶 Chymotrypsin 专一性 胰蛋白酶 断裂Phe Trp Tyr等疏水芳香Aa的羧基所形成的肽键断裂键邻近的基团若为碱性 裂解能力 酸性 裂解能力 嗜热菌蛋白酶 thermolysin 含Zn Ca Zn是活力必需的 Ca与热稳定有关专一性差 断裂较短的多肽链or大肽段最适PH8 9 胃蛋白酶 Pepsin 专一性 糜蛋白酶 要求被断裂键两侧的殘基都是疏水性Aa最适PH2 可用来确定二硫键的位置金黄色葡萄球菌蛋白酶 Glu蛋白酶 磷酸缓冲液PH7 8 能在Glu殘基和Asp殘基的羧基侧断裂肽键NH4HCO3缓冲液PH7 8 或醋酸铵缓冲液PH4 0中 只能断裂Glu殘基的羧基侧肽键梭状芽孢杆菌蛋白酶 Arg蛋白酶 专门裂解Arg殘基的COOH所形成的肽键 对不溶性蛋白质的长时间裂解很有效 肽段的拼接次序确定利用不同的方法获得多种肽段组合断裂点位置差异越大越好断裂点不宜过多或过少确定N C末端的Aa残基确定各个肽段的Aa顺序根据不同的肽段组合内Aa顺序的部分重叠 确定肽段的拼接次序二硫键的位置确定胃蛋白酶水解过甲酸打开二硫键双向电泳法分析 蛋白质的一级结构和生物功能的关系同源蛋白质的种属差异与生物进化基本概念 同源蛋白质 在不同的有机体中实现同一功能的蛋白质顺序同源 同源蛋白质的Aa顺序的相似性 不变残基 同源蛋白质Aa顺序中对所有的种属来说都相同的Aa残基可变残基 不同种属有相当大的变化的Aa残基生物学意义生物进化的标记 e g 细胞色素C遗传变异的分子基础 e g 镰刀型贫血病 一级结构的改变与蛋白质的活性变化局部断裂与蛋白质的激活胰岛素原的激活前胰岛素原 N末端多一段肽链 信号肽引导新生的多肽链进入内质网 胰岛素原 信号肽被切 Golgi体 胰岛素 肽酶催化胰岛素的二个特定肽键断裂 血液凝固的机制13种凝血因子构成凝血系统血浆纤维蛋白原在凝血酶的激活作用下转变为不溶性纤维蛋白 激活作用是通过凝血酶切去纤维蛋白原N末端富含酸性氨基酸的A B肽 然后在XIIIa 纤维蛋白稳定因子 作用下 发生交联而实现凝血 其他一级结构变化与功能磷酸化 许多生物酶可以通过磷酸化 去磷酸化实现活性的改变 连接糖链 活性 抗原性 寿命连接脂质 活性 溶解性 蛋白质的二级结构 二级结构的定义和研究方法 定义 蛋白质的二级结构 Secondarystructure 是指肽链的主链在空间的排列 或规则的几何走向 旋转及折叠 它只涉及肽链主链的构象及链内或链间形成的氢键研究方法 X 衍射圆二色性核磁共振荧光偏振 肽平面二面角与蛋白质二级结构C N1 C C2单键 可自由旋转 角 绕C N1键旋转的角度 角 绕C C2键旋转的角度 原则上可以在 180 180之间任意取值多肽链的所有可能构象都能用 这两个构象角描述 每一对 称肽平面的二面角 Ramachandran构象图可能构象分析 由于分子间的相互作用力 并非所有构象都可以形成Ramachandran构象图的预测作用 几种常见的二级结构 螺旋 helix 结构要点 肽链内每个残基C 的成对二面角 和 各自取同一数值 57 48 右手 左手螺旋 均由L 型Aa残基构成 右手 螺旋和左手 螺旋不是对映体 蛋白质中 螺旋几乎均为右手的 右手的比左手的稳定每圈螺旋占3 6个AA残基 沿螺旋轴方向上升0 54nm 肽链内形成氢键 氢键的取向几乎与轴平行 第一个氨基酸残基的酰胺基团的 C O基与第四个氨基酸残基酰胺基团的 NH基形成氢键 螺旋是不对称的分子结构 具有旋光能力 天然 helix的不对称因素引起右旋 螺旋结构的结构通式与命名 螺旋结构中重复性结构命名 第一个数字表示每圈螺旋包含的残基数 下标数字表示氢键封闭的环所包含的主链原子数 同时也可标出氢键封闭的环内的重复单位数常见的螺旋形式3 613螺旋 n 3 非整数螺旋 蛋白质中 螺旋结构的主要类型 310螺旋 n 2 一般只出现在 转角内4 416螺旋 n 4 紧缩螺旋 某些核酸结合蛋白 不同氨基酸对 螺旋结构形成的影响利用多聚氨基酸分析R基小 不带电荷的Aa 易于形成 螺旋结构 Ala Val Glu His等当一圈螺旋形成以后 再加入残基形成螺旋就变得容易了带相同电荷的Aa 相互临近的区域 不容易形成 螺旋结构C 附近支链长的氨基酸 对 螺旋的形成是不利的 尤其Ile将破坏 螺旋的稳定Pro的C N1 C C2单键不能旋转 不具有亚氨基 不能形成链内氢键 所以 螺旋在Pro处中断 形成结节 kink Gly由于空间位阻小 构象柔性大 常形成 转角 折叠 pleatedsheet 结构要点两条或多条几乎完全伸展的多肽链侧向聚集在一起 相邻肽链上的 NH和C O之间形成有规则的氢键 这样的多肽构象就是 折叠 平行式 各肽链的排列极性 N C 是同一方向的 119 113 重复周期0 65nm 常见于球状蛋白反平行式 相邻肽链的极性相反 139 135 重复周期0 70nm 常见于纤维状蛋白所有的肽键都参与链间氢键的交联 氢键与肽链的长轴接近垂直 多肽主链为据齿状折叠构象 侧链的C C 键几乎垂直于折叠片平面 侧链R基交替地分布在片层平面的两侧 纤维状蛋白的 折叠主要在不同肽链间形成 而球状蛋白则可以在肽链的不同片段间形成常出现在 折叠的Aa Ile Leu Tyr Val Phe Lys 转角 trun 结构要点三种类型 每种类型都有4个Aa残基类型I 类型II 均为伸展弯折 无螺旋 差别在于中心肽单位相互之间有180 的旋转关系类型III在第一和第三个氨基酸残基之间形成一小段310螺旋弯曲处的第一个残基的C O和第四个残基的NH之间形成一个4 1氢键 产生一种不很稳定的环形结构 转角多数都处在球状蛋白质分子表面 常出现在 转角的Aa类型II的C3常为GlyAsn Asp Pro Cys Ser Thr 蛋白质的三级结构 定义 蛋白质的三级结构 TertiaryStructure 是指在二级结构基础上 肽链的不同区段的侧链基团相互作用在空间进一步盘绕 折叠形成的包括主链和侧链构象在内的特征三维结构 单条肽链构成的蛋白质所具有的最高级构象蛋白质表现完整生物活性的最低构象要求 即只有具有了完整的三级结构 才能表现出蛋白质的生物活性 超二级结构 super secondarystructure 定义 在蛋白质中 特别是球状蛋白质中 若干相邻的二级结构单元组合在一起 彼此相互作用 形成有规则 在空间上能辨认的二级结构组合体充当三级结构的构体 称为超二级结构 在结构的组织层次上高于二级结构 但没有构成完整的结构域常见的超二级结构 型由两股或三股右手 helix彼此缠绕而成的左手超螺旋 重复距离约为14nm是 角蛋白 肌球蛋白 原肌球蛋白 纤维蛋白质中的一种超二级结构 helix的结构作出相应调整每圈螺旋为3 5个残基 重复单位0 51nm单个的 helix每隔7个残基重复一次稳定因素是非极性侧链间的范德华力 型由二段平行式的 链和一段连接链组成 此超二级结构称 单位连接链 helix或无规则卷曲大体上反平行于 链最常见的 组合是由三段平行式的 链和二段 helix链构成 此超二级结构称Rossmann 折叠几乎所有的实例 只有两个例外 中连接都是以右手交叉连接方式处于 折叠的一侧 型 曲折和回形拓扑结构 组合的二种超二级结构 曲折 由在一级结构上连续 在 折叠中相邻的三条反平行式 链通过紧凑的 转角连接而成 曲折含有与 helix相近数目的氢键 回形拓扑结构 反平行式 折叠片中常出现的一种超二级结构 三级结构的主要维系因素氢键 疏水键 离子键和范德华力等 疏水键 在蛋白质三级结构中起着重要作用 蛋白结构的实例球状蛋白纤维状蛋白角蛋白 Keratin 角蛋白 角蛋白胶原蛋白 定义 蛋白质的四级结构 QuaternaryStructure 是指由多条各自具有一 二 三级结构的肽链通过非共价键连接起来的结构形式 各个亚基在这些蛋白质中的空间排列方式及亚基之间的相互作用关系 这种蛋白质分子中 最小的单位通常称为亚基或亚单位 Subunit 它一般由一条肽链构成 无生理活性或不具有完整生理活性由多个亚基聚集而成的蛋白质常常称为寡聚蛋白 蛋白质的四级结构 四级结构的类型和维系类型 同聚体 由相同的亚基通过非共价键聚集而成的寡聚蛋白异聚体 由不同的亚基通过非共价键聚集而成的寡聚蛋白根据亚基的数目可以称 同 聚体 异 聚体四级结构的维系疏水力是维系四级结构的主要方式亚基之间的契合关系 寡聚蛋白质与别构效应基本概念别构效应 allostericeffect 指蛋白质与配基结合改变蛋白质的构象 进而改变蛋白质的生物活性的现象别构蛋白质 allostericprotein 具有别构效应的蛋白质 多为寡聚蛋白 包括活性部位和调节部位同位效应 指别构蛋白质与一种配基的结合对于该蛋白和同种配基的结合能力的影响正协同效应 第一个配基的结合引起第二个 第三个 配基更容易结合 这种同位效应称正协同效应负协同效应 第一个配基的结合导致第二个 第三个 配基更难结合 这种同位效应称负协同效应 异位效应 如果蛋白质分子中 相互之间发生作用的部位是不同的 也即活性部位上所发生的反应将受到调节部位与效应物结合的影响 称异位效应血红蛋白的结构与功能组成 4个亚基组成 成年人红细胞由 两种亚基各两条构成每条肽链都卷曲成球状 都有一个空隙容纳一个血红素 它们都能与氧气结合 以 2 2四聚体形式存在一分子Hb能与4分子氧气结合分析Hb与氧气结合 发现Hb的4个亚基和4个氧气结合时平衡常数 Keq 并不相同 而是有4个不同的平衡常数 Hb与最后一个氧气结合时其结合力最大 Hb与氧气结合将影响其四级结构 即亚基与亚基之间的相对位置发生变动 这种变化增强了Hb和O2的亲和力蛋白质各级结构之间的相互关系各级结构之间的递进一级结构对高级结构的指导作用一级结构是高级结构的基础高级结构由一级结构和其他构象指导因素共同决定最低势能原则 分子的稳定构象往往是该分子内结构势能最低的状态微环境和折叠辅助因子的影响高级结构对低级结构的影响 residue C N键长 0 184nmC N键长 0 127nmCN键长 0 132nm 一种四肽的结构 Ser Val Tyr Asp Gln NH3 Glu Glu Glu COO pK NH2 8 6 Pk COOH 3 26 pK R 4 45 因为该肽最多带一个正电荷 而最多可以带四个负电荷 所以等电点时 应该是三个侧链基团不离解 而末端COOH离解 pI 1 2 pK R pK COOH NH3 Lys Lys Lys COO pK NH2 8 6 Pk COOH 3 26 pK R 10 58 该肽最多可有四个正电荷 一个负电荷 所以等电点时 应该是末端 NH3离解 而三个侧链基团 有两个离解 因此pI pK R lg 2 1 H3N Tyr Gly Gly Phe Met COO H3N Tyr Gly Gly Phe Leu COO Met 脑啡肽Leu 脑啡肽 L Leu D Phe L Pro L Val L OrnL Orn L Val L Pro D Phe L Leu短杆菌肽S 环十肽 由细菌分泌的多肽 有时也都含有D 氨基酸和一些不常见氨基酸 如鸟氨酸 Ornithine 缩写为Orn 几条多肽链借助非共价键连接在一起 称为寡聚蛋白质 如 血红蛋白为四聚体 烯醇化酶为二聚体 可用8mol L尿素或6mol L盐酸胍处理 即可分开多肽链 亚基 可以通过加入盐酸胍方法解离多肽链之间的非共价力 应用过甲酸氧化法或巯基还原法拆分多肽链间的二硫键 水解蛋白质获得Aa混合液色谱分析氨基酸组成和含量分析水解液氨含量 推导酰胺氨基酸的含量 溴化氰水解法 能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键 Edman 苯异硫氰酸酯法 多肽or蛋白质末端NH2 PITC PTC 多肽or蛋白质 有机溶剂 N末端的PTC AA发生环化 生成苯乙内酰硫脲的衍生物 脱离肽链 除去N末端AA后剩下的肽链仍然是完整的 因为 PTC的引入 只使第一个肽键稳定性降低 干燥 薄层气相HPLC层析色谱 Edman 苯异硫氰酸酯法 氨基酸顺序分析法实际上也是一种N 端分析法 此法的特点是能够不断重复循环 将肽链N 端氨基酸残基逐一进行标记和解离 Edman氨基酸顺序分析法 蛋白质or多肽 无水肼 肼解 C末端AA以其他AA转变为游离形式存在相应的AA酰肼化物 苯甲醛存在于上清液中二苯基衍生物 FDNB DNS 层析法 Trypsin R1 Lys Arg当R2 Pro 抑制水解 肽链 水解位点 胰蛋白酶 多肽链1 2 环己酮 马来酸酐 咘丁烯二酸酐 修饰Arg的胍基保护Lys上的 NH2胰蛋白酶 胰蛋白酶 Lys水解Arg不水解 Lys的肽键只断开Arg不水解的肽键 多肽链 氮丙啶Cys殘基侧链被修饰成AECys 类似Lys侧链 具 NH2 胰蛋白酶Cys羧基侧的肽键 胰凝乳蛋白酶 Chymotrypsin R1 Phe Trp Tyr水解较快 而Leu Met His水解稍慢 当R2 Pro 抑制水解 糜蛋白酶 Pepsin R1和R2 Phe Trp Tyr Leu以及其它疏水性氨基酸 水解速度较快 R1 Pro则不水解 胃蛋白酶 thermolysin R2 Phe Trp Tyr Leu Ile Met以及其它疏水性强的氨基酸 水解速度较快 R2 Gly Pro不水解R1和R3 Pro抑制水解 嗜热菌蛋白酶 确定肽段在多肽链中的次序利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠 拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序 所得资料氨基末端残基H羧基末端残基S第一套肽段第二套肽段OUSSEOPSWTOUEOVEVERLRLAAPSHOWTHO HOWT OUS EOVE RLA PS 第一套肽段 第二套肽段 HO WTOU SEO VERL APS 推断全顺序HOWTOUSEOUVEPLAPS 借助重叠肽确定肽段次序 末端残基HS 末端肽段HOWTAPSOUS 一般采用胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链 利用电泳技术分离开各个肽段 用过甲酸处理后 在垂直方向上再次电泳 由于二硫键断裂后 肽段的大小 电荷性质会发生变化 因此 会出现偏离对角线的现象利用已知的肽段组成和排序 可以推知二硫键位置 胰岛素原包括A B链和C链C链即连接肽 在储存颗粒 storagegranule 中 可以为特殊的肽酶切去 而转变成活性的胰岛素 3 613 n 3 螺旋 毛发的结构 一根毛发周围是一层鳞状细胞 scaIecell 中间为皮层细胞 corticalcelI 皮层细胞横截面直径约为20 m 在这些细胞中 大纤维沿轴向排列 所以一根毛发具有高度有序的结构 毛发性能就决定于 螺旋结构以及这样的组织方式 角蛋白的结构 角蛋白分子中的二硫键 卷发 烫发 的生物化学基础 永久性卷发 烫发 是一项生物化学工程 biochemicalengineering 角蛋白在湿热条件下可以伸展转变为 构象 但在冷却干燥时又可自发地恢复原状 这是因为 角蛋白的侧链R基一般都比较大 不适于处在 构象状态 此外 角蛋白中的螺旋多肽链间有着很多的二