《谷氨酸发酵控制》PPT课件.ppt

4谷氨酸发酵过程控制 一般认为无论是野生株还是突变株 在增殖旺盛 进行正常代谢的微生物培养液中不存在特定的生物合成代谢中间产物大量地分泌累积的现象 因此 为了累积特定的氨基酸 必须用某些方法使微生物的代谢调节异常化 谷氨酸产生菌之所以能够大量积累谷氨酸 首先是菌体代谢调节异常 这种代谢异常的菌种对环境条件是敏感的 谷氨酸酸发酵是建立在容易变化的代谢平衡上 是受多种条件支配的 在不同的环境条件下 可生长大量菌体或者得到不同的代谢产物 表4 1由葡萄糖生产谷氨酸时谷氨酸与菌体的生成率 表4 1中生产培养时添加3 g L生物素 增殖培养时添加200 300 g L生物素 结果在生产培养时 葡萄糖多半是用于合成谷氨酸 与此相反 在增殖培养时近半量的葡萄糖用于合成菌体 而几乎不生成谷氨酸 生产培养的菌体形态与增殖培养的菌体形态存在显著差异 生产型菌体伸长呈膨润状态 边缘不完整 而增殖型菌体呈类球形或短杆状 且这两种细胞的表层结构和机能有很大差别 表4 2谷氨酸产生菌因环境条件改变而发生发酵转换 表4 2表示在不同环境条件下生成不同的代谢产物 在最适宜的培养条件下 谷氨酸产生菌可将60 以上的葡萄糖转化为谷氨酸 而只有极少量的副产物 与此相反 如果培养条件不适宜 几乎不产生谷氨酸 而得到大量菌体或者由谷氨酸发酵转换为积累乳酸 琥珀酸 酮戊二酸 缬氨酸 谷氨酰胺 N 乙酰谷氨酰胺等 这种现象称为 发酵转换 菌种的性能越高 使其表达接近它应有的生产潜力所必须的条件就越难满足 对环境条件的波动更为敏感 谷氨酸发酵正是如此 可见环境条件的控制对谷氨酸发酵的产酸率 糖酸转化率等的高低是非常重要的 目前国外较先进的发酵罐都可以用电子计算机进行参数 温度 罐压 搅拌速度 空气流量 pH 溶解氧 消泡 氧化还原电位 尾气等 测量和控制 但是一些对控制发酵过程至关重要的参数 如底物 产物 中间产物 细胞浓度 发酵液的黏度 气液界面面积等 却还不能顺利地进行联机 在线 测量和控制 这主要是由于缺乏可以发挥电子计算机潜在全部优点的 适合自动监控发酵过程中某些参数的传感器 随着生物传感器 自动化分析方法以及电子计算机与生物技术之间接口技术的发展 将扩大计算机技术在微生物工程方面的应用范围 使发酵生产过程实现高度自动化 应用电子计算机控制和管理发酵 使发酵工艺最佳化 用计算机可借在线分析做到间接测量 进而达到在线控制 由于计算机的计算速度 它们可以维持发酵的程序控制 提供底物和细胞浓度的瞬间读数 例如通过连续测定排气中O2和CO2浓度 进行氧平衡 计算出耗氧速率和呼吸商 从而获得细胞浓度 能准确地确定添加青霉素的时间 采用计算机控制流加糖 减少糖浓度波动 提高转化率 目前借助电子计算机控制的参数有 温度 压力 空气流量 pH 溶解氧 消泡 补料 排气中O2 排气中CO2 溶解氧系数 搅拌转速等 4 1发酵培养基 与种子培养基不同 发酵培养基不仅是供给菌体生长繁殖所需要的营养和能源 而且是构成谷氨酸的碳架来源 要积累大量谷氨酸 就要有足够量的碳源和氮源 其用量大大地高于种子培养基 对于菌体繁殖所必需的营养因子 生物素却要控制其用量 与其它发酵工业一样 谷氨酸发酵培养基包括碳源 氮源 无机盐 生长因子及水等 发酵工业原料主要是指发酵培养基中用量比较大的成分 这些原料的选择既要考虑到菌体生长繁殖的营养要求 更重要的要考虑到有利于大量积累谷氨酸 还要注意到原料来源丰富 价格便宜 发酵周期短和对产物提取无妨碍等 4 1 1碳源 碳源是供给菌体生命活动所需的能量和构成菌体细胞以及合成谷氨酸的碳架的来源 谷氨酸产生菌是异养微生物 只能从有机化合物中取得碳素的营养 并以分解氧化有机化合物产生的能量供给细胞中合成反应所需要的能量 通常用作碳源的物质主要是糖类 脂肪 某些有机酸 某些醇类和烃类 由于各种微生物所具有的酶系不同 所能利用的碳源往往是不同的 目前所发现的谷氨酸产生菌均不能直接利用淀粉 只有利用葡萄糖 果糖 蔗糖和麦芽糖等单糖或双糖 有些菌种能够利用醋酸 乙醇 正烷烃等 由于国内绝大多数味精厂采用的碳源为淀粉水解糖 因此这里主要介绍淀粉水解糖作业碳源的发酵 培养基中糖浓度对谷氨酸发酵有很大影响 在一定范围内 谷氨酸产酸率随糖浓度增加而增加 但当糖浓度过高时 由于渗透压增大 对菌体生长和发酵均不利 当工艺条件配合不当时 糖酸转化率相当低 同时培养基浓度大 氧溶解的阻力也增大 影响供氧效率 为了降低培养基中糖浓度而又提高产酸水平 目前国内普遍采用低浓度初糖的流加糖发酵工艺 初糖8 12 流加糖后总糖20 左右 产酸率可达11 以上 糖酸转化率达55 以上 淀粉水解糖质量对谷氨酸发酵的影响很大 如果淀粉水解不完全 如有糊精存在 不仅造成原料浪费 而且还会使发酵过程产生很多泡沫 影响发酵的正常进行 淀粉原料不同 液化 糖化工艺条件不同 使水解糖中生物素含量也不同 影响谷氨酸培养基中生物素含量的控制 由于双酶法 高温淀粉酶液化 糖化酶水解 对原料中生物素等营养因子破坏很少 因此采用双酶法制糖时 如果采用生物素亚适量工艺进行谷氨酸发酵 尽量采用精制淀粉 4 1 2氮源 氮源是合成菌体蛋白质 核酸等含氮物质和合成谷氨酸氨基的来源 同时 在发酵过程中一部分氨用于调节发酵液pH 形成谷氨酸铵 因此 谷氨酸发酵需要的氮源比一般的发酵工业要高 一般发酵工业碳氮比为100 0 2 2 0 而谷氨酸发酵的碳氮比为100 15 30 当培养基中碳氮比在100 11以上才开始积累谷氨酸 在谷氨酸发酵中 用于合成菌体的氮仅占总耗用氮的3 8 而30 80 用于合成谷氨酸 在实际生产中 由于一部分氨用于调节pH 一部分随空气逸出 造成实际用量较大 当培养基中糖浓度为14 时碳氮比为100 32 8 碳氮比对谷氨酸发酵影响很大 在发酵的不同阶段 控制碳氮比以促进以菌体生长为主的阶段向产酸阶段转化 在长菌阶段 如NH4 过量也会抑制菌体生长 在产酸阶段 如NH4 不足 酮戊二酸不能还原并氨基化 几乎不积累谷氨酸 而积累 酮戊二酸 氮源有无机氮和有机氮之分 无机氮如尿素 液氨 氨水 碳酸氢铵 硫酸铵 氯化铵和硝酸铵等 菌体利用无机氮源比较迅速 而利用有机氮较缓慢 铵盐 尿素和液氨等比硝基氮优越 因为硝基氮需先经过还原后才能被利用 一般要根据菌种和发酵特点合理地选择氮源 采用不同的氮源其添加方法不同 如液氨 尿素等可采取流加方法 液氨作用快 对pH影响大 应采取连续流加 尿素加入后先经过谷氨酸产生菌中脲酶水解成氨后再利用 因此会滞后 一般根据菌种的脲酶活力分3 6次分批流加 用硫酸铵等生理酸性盐为氮源时 由于NH4 被利用而残留的SO42 等酸根 使pH下降 因此在培养基中需要加入CaCO3以自动中和 维持pH相对稳定 但是添加大量CaCO3容易导致染菌 且Ca2 对产物提取有影响 因此一般生产上不采用此法 目前 考虑到生产成本 操作方便等因素 谷氨酸发酵已全部采用液氨作为无机氮源 由于液氨作用快 对pH影响大 故生产上都采用连续流加方法 有机氮源主要是蛋白质 蛋白胨和氨基酸等 谷氨酸发酵的有机氮源常用玉米浆 麸皮水解液 米糠水解液 豆饼水解液和糖蜜等 有机氮 尤其是氨基酸丰富则有利于长菌 谷氨酸发酵时对有机氮的需要量不大 4 1 3无机盐 无机盐是微生物生命活动所不可缺少的物质 其功能如下 构成菌体成分 作为酶的组成部分 酶的激活剂或抑制剂 调节培养基的渗透压 调节pH和氧化还原电位等 一般微生物所需要的无机盐为磷酸盐 硫酸盐 氯化物和含钾 钠 镁和铁的化合物 还需要一些微量元素 如锰 铜 锌 钴 钼 碘和溴等 微生物对无机盐的需要量很少 但对菌体的生长和代谢产物的产生影响很大 磷酸盐磷是一些蛋白质和核酸的组成分 腺二磷 ADP 腺三磷 ATP NADPH等是重要的能量传递者 参与一系列的代谢反应 磷酸盐在培养基中还具有缓冲作用 微生物对磷的需要量一般为0 005 0 01mol L 工业生产上常用的磷酸盐为KH2PO4 K2HPO4 3H2O Na2HPO4 12H2O和NaH2PO4 2H2O等 也可用磷酸 当采用K2HPO4 3H2O时 添加量一般为0 1 考虑到生产成本 一般采用Na2HPO4 12H2O或NaH2PO4 2H2O 但另外要添加KCl 磷酸盐对谷氨酸发酵影响很大 当磷酸盐偏高时 菌体代谢转向合成缬氨酸 但如磷酸盐过低 菌体生长也不好 造成延长发酵时间 影响谷氨酸的合成 硫酸镁Mg2 许多重要酶 如己糖磷酸化酶 异柠檬酸脱氢酶 羧化酶等 的激活剂 如果Mg2 含量太少 就会影响其底物的氧化 一般革兰氏阳性菌对Mg2 的最低要求为25mg L 革兰氏阴性菌为4 5mg L MgSO4 7H2O中含Mg2 9 87 发酵培养基中添加0 5g LMgSO4 7H2O时 Mg2 浓度约为50mg L 硫存在于细胞蛋白质中 是含硫氨基酸 半胱氨酸和蛋氨酸 的组成部分 也是一些酶的活性基团重要组成部分 由于培养基中硫已在硫酸镁中供给 因此不必另外添加 钾盐钾一般不参与细胞结构物质的组成 但它是许多酶 EMP途径和TCA循环中一系列酶 的激活剂 谷氨酸生物合成时所需要的钾盐比菌体生长需要量高 菌体生长时需要钾盐0 1g L 以K2SO4计 以下同 谷氨酸生成时需钾盐为0 2 1 0g L 钾对谷氨酸发酵影响明显 钾盐少长菌体 钾盐足够时产谷氨酸 当培养基中配用1 0g LK2HPO4 3H2O时 其钾浓度约为0 38g L 如果采用Na2HPO4 12H2O时 应配用0 3 0 6g LKCl 此时钾浓度为0 35 0 70g L 微量元素微生物需要量十分微小但又不可完全没有的元素称为微量元素 Mn2 是某些酶的激活剂 羧化反应必需Mn2 如谷氨酸生物合成途径中 草酰琥珀酸脱羧生成 酮戊二酸是在Mn2 存在下完成的 一般培养基添加0 01g LMnSO4 4H2O Fe2 是细胞色素氧化酶 过氧化氢酶的组成部分 又是若干酶的激活剂 一般培养基添加0 01g LFeSO4 4H2O 一般作为碳氮源的农副产品天然原料中 本身就含有某些微量元素 不必另外添加 而某些重金属离子 特别是汞和铜等离子 具有明显的毒性 抑制菌体生长和谷氨酸合成 因此 必须避免有害离子混入到培养基中 生长因子从广义来说 凡是微生物生长不可缺少的微量有机物质 如氨基酸 碱基 嘌呤 嘧啶 维生素等均称为生长因子 生长因子不是所有微生物都必需的 它只对于那些自身不能合成这些成分的微生物才是必不可少的营养物 目前以糖质原料为碳源的谷氨酸产生菌均为生物素 VH 缺陷型 以生物素为生长因子 有些菌株还以硫胺素 VB1 为生长因子 有些变异株为油酸缺陷型还以油酸作为生长因子 生物素是B族维生素的一种 又称维生素H或辅酶R 其结构式如下 生物素作为酶的组成成分 参与机体的三大营养物质 糖 脂肪和蛋白质的代谢 是动物机体不可缺乏的重要营养物质之一 在谷氨酸发酵中 生物素的作用主要影响谷氨酸产生菌细胞膜的合成 从而影响谷氨酸通透性 同时也影响菌体的代谢途径 即代谢产物的生成 生物素浓度对菌体生长和谷氨酸积累都有影响 谷氨酸产生菌大量合成谷氨酸所需要的生物素浓度比菌体生长所需的生物素浓度要低得多 即为菌体生长所需的 亚适量 谷氨酸发酵最适生物素浓度随菌种不同 碳源种类和碳源浓度以及供氧条件不同而不同 一般为5 g L左右 如果生物素过量 菌体大量繁殖而不产或少产谷氨酸 而转产乳酸或琥珀酸 在生产中表现为长菌快 耗氧快 pH低 液氨消耗多 若生物素不足 菌体生长不好 谷氨酸产量也低 表现为长菌慢 耗糖慢 发酵周期长 当供氧不足 生物素过量 发酵向乳酸发酵转换 供氧充足 生物素过量 糖代谢倾向于完全氧化生成CO2和水 菌体从培养液中摄取生物素的速度是很快的 远远超过菌体繁殖所消耗的生物素量 因此 培养液中残留的生物素量很低 在发酵过程中 菌体内生物素含量由丰富向贫乏过渡 试验结果表明 当菌体内生物素从20 g g干菌体降到0 5 g g干菌体 菌体就停止生长 开始发酵 在适宜条件下就大量积累谷氨酸 维生素B1是由嘧啶环和噻唑环结合而成的一种B族维生素 又称硫胺素或抗神经炎素 维生素B1为无色结晶体 溶于水 在酸性溶液中很稳定 在碱性溶液中不稳定 易被氧化和受热破坏 维生素B1主要存在于种子的外皮和胚芽中 如米糠和麸皮中含量很丰富 在酵母菌中含量也极丰富 硫胺素对某些谷氨酸菌种的发酵有促进作用 提供生长因子的农副产品原料玉米浆是一种用亚硫酸浸泡玉米而得的浸泡水的浓缩物 含有丰富的氨基酸 核酸 维生素等 玉米浆的成分因玉米原料来源及处理方法而变动 每批发酵原料变动时均需进行小型发酵试验以确定其用量 玉米浆用量还应根据淀粉原料不同 糖浓度及发酵条件不同而异 一般用量为0 4 0 8 麸皮水解液可代替玉米浆 但蛋白质 氨基酸等营养成分比玉米浆少 用量一般为1 以干麸皮计 左右 可用酵母膏 酵母浸出液或直接用酵母粉 其氨基酸 核苷酸和维生素含量丰富 甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜均可代替玉米浆 但氨基酸等有机氮含量较低 甘蔗糖蜜中生物素含量也会与产地 处理方法 贮存期长短等有关 故每批原料变动时均需小试以确定用量 甘蔗糖蜜用量为0 1 0 4 4 2温度对谷氨酸发酵的影响 4 2 1发酵热及其测量 发酵热引起发酵过程温度变化的原因是发酵过程所产生的热量 称为发酵热 发酵热包括生物热 搅拌热 蒸发热和辐射热等 生物热在发酵过程中 由于菌体的生长繁殖和形成代谢产物 不断地利用营养物质 将其分解氧化获得能量 其中一部分能量用于合成高能化合物 如ATP 供合成细胞物质和合成代谢产物所需要的能量 其余部分则以热的形式散发出来 这就是生物热 生物热随菌种和培养条件不同而不同 一般菌种活力强 培养基营养丰富 菌体代谢旺盛 产生的热量就多 发酵过程产生的热量具有强烈的时间性 即不同培养阶段菌体呼吸作用和发酵作用强度不同 所产生的热量也不同 在发酵初期 菌体处于适应期 菌体数量较少 呼吸作用缓慢 产生的热量少 当菌体处于对数生长期 菌体繁殖快 代谢旺盛 菌体浓度高 产生的热量就多 特别是从对数生长转入平衡期时 菌体浓度最大 代谢旺盛 产生的热量最多 一般谷氨酸发酵3 5h就开始产生生物热 温度升高 发酵12 22h产生热量最多 应注意控制温度 但采用高生物素 添加青霉素工艺 则明显提前 发酵7 20h产生热量最大 搅拌热机械搅拌通气发酵罐 由于机械搅拌带动发酵液进行运动 造成液体之间 液体与设备之间的磨擦作用 产生大量的热量 称为搅拌热 搅拌热与搅拌轴功率有关 可用下式计算 Q搅 P 3600 kj h 式中Q搅 搅拌热 kj h P 搅拌功率 kW 3600 机械能转变为热能的热功当量 kj kW h 汽化热通风时 会引起发酵液部分水分蒸发 发酵液因蒸发而被带走的热量称为汽化热 Q汽 4 18G I出 I进 kj h 式中G 空气的质量流量 kg h I出 进口空气的热焓 kj kg I进 出口空气的热焓 kj kg 辐射热因发酵液温度与周围环境温度不同 发酵液的部分热量通过罐体向外辐射 辐射热大小取决于罐内外温度差 冬天大些 夏天小些 一般不超过5 发酵过程需要用冷却方法带走的发酵热 Q总 Q生 Q搅 Q汽 Q辐 发酵热的测定和计算 通过测量一定时间内冷却水的流量和进出口温度 用下式计算发酵热 Q发 GC t2 t1 V 通过发酵温度自动控制 先使罐温达到恒定 再关闭自动控制装置 测量温度随时间上升的速率 按下式求出发酵热 Q发 M1C1 M2C2 S V 根据化合物的燃烧热计算生物热 4 2 2温度对谷氨酸发酵的影响 温度对谷氨酸发酵的影响是多方面的 对菌体生长和代谢产物形成是由各种因素综合表现的结果 从酶反应动力学来看 温度升高 反应速率加快 生长速率快 产物生成提前 但是 酶是蛋白质 受热容易失活 温度愈高失活愈快 温度还通过影响发酵液的性质来间接影响发酵 温度还影响细胞中酶的活性 从而影响代谢途径方向 各种微生物在一定条件下 都有一个最适的生长温度范围 微生物种类不同 所具有的酶系不同 所要求的温度也不同 同一微生物 由于培养条件不同 其最适温度也不同 谷氨酸产生菌的最适生长温度为30 34 其中T6 13及其变异株比较耐高温 产生谷氨酸的最适温度为37 甚至在较短时间内可39 40 也行 在谷氨酸发酵前期长菌阶段和种子培养时应满足菌体生长最适温度 若温度过高 菌体容易衰老 在生长上表现为OD增长慢 pH高 耗糖慢 发酵周期长 谷氨酸生成少 在发酵中后期菌体生长已停止 为了大量积累谷氨酸 需要适当提高温度 有利于提高谷氨酸产量 谷氨酸发酵开始时因菌体数量少 释放的热量也少 当菌种进入生长旺盛时期 呼吸加强 放出大量热量 后期趋于稳定 释放的热量又减少 因此 发酵正常 表现为前期温度上升缓慢 中期剧烈 后期逐渐缓慢 若前期上升剧烈 有可能是杂菌污染 4 3pH对谷氨酸发酵的影响 pH对微生物生长和代谢产物的形成都有很大影响 不同种类的微生物对pH要求不同 大多数细菌的最适生长pH为6 5 7 5 霉菌一般为pH4 0 5 8 酵母为pH3 8 6 0 谷氨酸产生菌的最适生长pH6 5 8 0 各种菌种又有所不同 黄色短杆菌672pH7 0 7 5 北京棒杆菌AS1 299pH6 0 7 5 T6 13pH7 0 8 0 pH主要通过以下几方面影响微生物的生长和代谢产物形成 影响酶的活性 pH的高或低能激活或抑制微生物体内某些酶的活性 影响微生物细胞膜所带电荷 从而改变细胞膜通透性 影响微生物对营养物质的吸收和代谢产物的分泌 影响培养基中某些营养物质和代谢产物的离解 从而影响微生物对这些物质的利用 pH的改变往往引起菌体代谢途径的改变 使代谢产物发生变化 4 3 1pH对谷氨酸发酵的影响谷氨酸产生菌在中性和微碱性条件下积累谷氨酸 在酸性条件下形成谷氨酰胺和N 乙酰谷氨酰胺 谷氨酸发酵在正常情况下 为了保证足够的氮源 满足谷氨酸合成的需要 发酵前期控制pH7 2 7 3 发酵中期pH7 2左右 发酵后期pH7 0左右 在将近放罐时 为了后道提取谷氨酸 pH控制在6 5 6 8为好 4 3 2发酵过程中pH变化及控制 在谷氨酸发酵过程中 由于菌体对培养基中营养成分的利用和代谢产物的积累 使培养基的pH不断变化 而变化的结果 则表现为pH的升降 因此 pH的变化被认为是谷氨酸发酵的一个重要指标 pH的变化是主要取决于菌体的特性 培养基的组成和工艺条件 菌种不同 所含酶系及其活力不同 培养基中糖 氮的种类和配比不同以及通风 搅拌强度不同 调节pH方法不同等 pH的变化规律性就不相同 但是 当这些条件一定时 在正常发酵情况下其pH的变化具有一定的规律性 谷氨酸发酵过程pH调节方法 液氨或氨水流加法在发酵过程中根据pH变化流加液氨或氨水调节pH 同时作为氮源 液氨含氮量高 运输方便 价格相对便宜 由于作用快 应采用连续流加的方法 最好能自动控制连续流加 该方法是目前氨基酸发酵普遍采用的方法 氨水如果浓度较低则带菌 且明显增加发酵体积 故目前国内基本不采用此法 尿素流加法这是上个世纪七八十年代味精厂普遍采用的方法 其优点是由于尿素的分解 利用及pH变化具有一定的规律性 容易控制 缺点是尿素价格相对较高 发酵过程中pH波动较大 影响产酸率和糖酸转化率 4 4供氧对谷氨酸发酵的影响 氨基酸发酵为通风发酵 氧的需要量是相当大的 氧的供应对好氧发酵来说是一个关键因素 对菌体的生长和代谢产物的积累都有很大的影响 因此研究供氧问题 对氨基酸发酵工艺管理的最佳化和工艺过程的放大具有重要意义 同时 合理的供氧对节省动力消耗也是很重要的 好气性发酵的供氧问题 包括化学工程学和微生物生理学两方面问题 即如何提高供氧效率和如何最适合于微生物的好气性培养 其中后一问题又包含微生物生长的最适需氧量和代谢产物生成的最适需氧量 4 4 1溶解氧与谷氨酸产生菌的需氧量谷氨酸产生菌和其它好气性微生物一样 对培养液中的溶解氧浓度有一个最低的要求 在此溶解氧浓度以下 微生物的呼吸速率随溶解氧浓度降低而显著下降 此一溶解氧浓度称为临界溶解氧浓度 以C临界表示 或以临界溶解氧分压pL临界表示 如图4 1所示 在临界溶解氧浓度以下 氧成为微生物生长的限制性底物 在此范围内微生物的耗氧速率符合米氏方程 图4 1细胞呼吸速率与溶解氧浓度之间的关系 一般好气性微生物的临界溶解氧浓度很低 约为0 003 0 03mmol L 约0 1 1 0ppm 当然氧在纯水的溶解度也只有8ppm 在发酵液则更低 表4 5氨基酸发酵pL临界和 ab QO2 X 4 4 2供氧对谷氨酸发酵的影响 在谷氨酸发酵中 供氧对菌体的生长和谷氨酸的积累都有很大的影响 供氧量多少应根据不同菌种 发酵条件和发酵阶段等具体情况决定 在菌体生长期 糖的消耗最大限度地用于合成菌体 在谷氨酸生成期 糖的消耗最大限度地用于合成谷氨酸 在菌体生长期 供氧必须满足菌体呼吸的需氧量 即rab QO2 X PL PL临界 当PL PL临界 即亚硫酸盐氧化速率rab 13 8mmol L h 时 菌体生长需氧量得不到满足 菌体呼吸受到抑制 引起乳酸等副产物的积累 但是供氧并非越大越好 当pL pL临界时 供氧满足菌的需氧量 菌体生长速率达最大值 如果再提高供氧 不但不能促进生长 反而造成浪费 而且由于高溶氧水平而抑制菌体生长 同时高溶氧水平下生长的菌体不能有效地合成谷氨酸 与菌体生长期相比较 谷氨酸生成期需要大量的氧 谷氨酸发酵在细胞最大呼吸速率时 谷氨酸产量大 因此 在谷氨酸生成期要求充分供氧 以满足细胞最大呼吸的需氧量 在条件适当时 耗氧速率rab 60mmol L h 谷氨酸产生菌将60 以上的糖转化为谷氨酸 4 4 3供氧与其它发酵工艺条件的关系 在谷氨酸发酵中 耗氧速率与菌种性能 培养条件等有关 一般培养基营养丰富 糖浓度高 生物素含量高 则需氧量大 因为糖浓度高相对要求生物素含量大 菌体浓度高 代谢旺盛 耗氧量大 如果供氧不增加时 就造成供氧不足 另一方面 培养基浓度大 氧的传递阻力大 需要增加供氧 生物素浓度影响菌体生长繁殖 但不影响单位细胞的呼吸活性 也就是说生物素浓度大 长的菌体多 体积耗氧速率增大 耗氧速率与菌体生长速率 耗糖速率和谷氨酸生成速率有关 当生物素浓度增加时 耗糖速率增大 引起供氧不足 使谷氨酸产量降低 控制溶解氧的发酵 随生物素浓度的增加 谷氨酸产量降低不明显 琥珀酸生成量也少 而供氧不足的发酵 即使在低生物素条件下也产生大量琥珀酸 由此可见 谷氨酸向琥珀酸发酵的转换 供氧条件比生物素的影响更大 4 4 4谷氨酸发酵的物质能量代谢 氨基酸发酵中 需氧是菌体代谢的需要 有以下两个原因 经过好气性的能量代谢可以有效地获得菌体生长和氨基酸生物合成所需的ATP 以完成生物氧化作用 氨基酸生物合成过程中产生的NAD P H2需要在氧存在下被氧化成NAD P 由于氨基酸生物合成过程所消耗的ATP摩尔数和生成的NAD P H2摩尔数不同 所需要的氧就不同 因此 在讨论氨基酸发酵的通风搅拌效果时 以各种氨基酸生物合成所必须的ATP摩尔数及生成NAD P H2摩尔数为基准是很有意义的 谷氨酸的生物合成中 由于草酰乙酸的生成方式不同 就有不同的合成途径 谷氨酸对糖收率不同 在生物合成过程中所消耗的ATP和生成的NAD P H2数也不同 1 5葡萄糖 谷氨酸 8NAD P H2 FADH2 3ATP 图4 2谷氨酸生物合成途径 I 从图4 2的谷氨酸生物合成途径可知 由3 2mol葡萄糖生成3mol乙酰CoA 其中2mol乙酰CoA与草酰乙酸反应生成2mol异柠檬酸 1mol异柠檬酸经过 酮戊二酸生成谷氨酸 另1mol异柠檬酸分解为琥珀酸和乙醛酸 两者都生成草酰乙酸 剩余的1mol乙酰CoA与乙醛酸生成草酰乙酸时被利用 在这样的反应体系中 谷氨酸的生成可由下式表示 葡萄糖 谷氨酸 3NAD P H2 ATP 图4 3谷氨酸生物合成途径 II 从图4 3的谷氨酸生物合成途径可知 由1mol葡萄糖生成2mol磷酸烯式丙酮酸 其中1mol磷酸烯式丙酮酸经羧化反应生成草酰乙酸 另外1mol磷酸烯式丙酮酸经脱羧生成乙酰CoA 1mol乙酰CoA与1mol草酰乙酸缩合反应生成1mol柠檬酸 经过异构后1mol异柠檬酸经过 酮戊二酸生成1mol谷氨酸 谷氨酸的生成可由下式表示 C 氨基酸生物合成时 每消耗lmol葡萄糖所消耗的ATP和生成的NAD P H2见表4 6 表4 6氨基酸生物合成中每消耗lmol葡萄糖所生成NAD P H2和消耗ATP物质的量 mol 供氧条件对谷氨酸族氨基酸生产的影响 由谷氨酸生物合成谷氨酰胺 脯氨酸 精氨酸等谷氨酸族氨基酸 其生物合成与三羧循环关系密切 这些氨基酸发酵的产物积累 受供氧条件的影响极大 在供氧充足的条件下 细菌呼吸充足 溶氧分压 PL 大于或等于临界溶氧分压 PL临界 的培养中 可以得到最大产酸量 反之 供氧不足 菌呼吸受抑制 生产收率显著减少 当氧满足率 ab KrM 1 0时 菌株呼吸受抑制 产酸明显下降 其下降程度要比其它氨基酸发酵大得多 图4 4在限制供氧下精氨酸 脯氨酸 谷氨酸与谷氨酰胺的生产性 在氧不足条件下产酸最高的亮氨酸 苯丙氨酸和缬氨酸发酵 多数氨基酸发酵都是在菌体呼吸充足的通风搅拌条件下 ab KrM 1 0或PL PL临界 产酸最高 但是 亮氨酸 苯丙氨酸和缬氨酸发酵却是在供氧较低的条件下 产酸最高 在亮氨酸发酵中 ab KrM 0 85 在缬氨酸发酵中 ab KrM 0 6 在苯丙氨酸发酵中 ab KrM 0 55 是最适的通风搅拌条件 图4 5在限制供氧下与脯氨酸相比亮氨酸 苯丙氨酸与缬氨酸l的生产性 供氧条件对天冬氨酸族氨基酸生产的影响 供氧条件对赖氧酸 异亮氨酸 和苏氨酸等天冬氨酸族氨基酸生产的影响 介于脯氨酸发酵与亮氨酸发酵之间 在菌呼吸充足条件下 产酸最高 而在氧不足的情况下 产酸略有降低 氧不足 发酵生产受到轻微抑制 在天冬氨酸族氨基酸发酵中 ab KrM 1 0时的生产性位于脯氨酸发酵和亮氨酸发酵中间 图4 6在供氧不足的条件下与脯氨酸和亮氨酸相比 赖氨酸 异亮氨酸和苏氨酸的生产性 4 4 5CO2对谷氨酸发酵的影响 CO2对谷氨酸发酵有一定的影响 谷氨酸生物合成需要CO2固定反应 由磷酸烯醇式丙酮酸羧化生成草酰乙酸 提供合成谷氨酸所必需的四碳二羧酸 如果CO2含量过高 也会影响菌体正常呼吸作用 然而 在供氧条件一定时 CO2对谷氨酸发酵的影响不显著 与供氧效果相比 CO2的作用较小 已知谷氨酸发酵在菌体呼吸充足时显示最大产量 必须供给菌体充足氧气 氧的满足程度要求达到1 0 可以采用间断或连续测定排气中CO2浓度的办法来调节通气量 以满足供氧要求 一般控制CO2在13 左右 发酵开始4 5h排气中CO2迅速上升至13 以上 保持通风 以保持13 当大于13 须加大通风 当小于13 降低通风 发酵中期至后期 通风需下降 才能保持排气中CO2在13 左右 发酵后期可降到10 最后放罐前也要控制在8 以上 绝不能降到0 以免后期通风过大而影响产酸 控制排气中CO2简便易行 一方面可以保证供氧 另一方面还能帮助发现污染杂菌或噬菌体 4 5泡沫的消除 4 5 1泡沫对发酵的影响在通风发酵中 由于通气和搅拌 产生少量泡沫是空气溶解于发酵液中以及产生CO2的结果 因此 发酵过程中产生少量泡沫是正常的 但是如泡沫过多也会影响发酵的正常进行 泡沫过多产生如下问题 引起大量逃液而造成浪费和污染 泡沫上升到罐顶可能从轴封渗漏而造成杂菌污染 减少发酵罐的装填系数 降低设备利用率 影响氧的传递和通气搅拌效果 当泡沫稳定时 代谢气体不能及时排出 影响菌体的正常呼吸作用 甚至造成菌体自溶 因此 发酵过程中避免泡沫过多生成和及时消除是关系到发酵的成败问题 4 5 2泡沫的形成和性质 泡沫是气体分散在少量液体中的胶体体系 是由许多气泡堆积在一起而形成的 泡沫形成的必要条件 气 液二相共存 存在能降低液体表面张力的物质 在发酵工业中所形成的泡沫 其分散相是空气和CO2 连续相是发酵液 按发酵液的性质不同 一般有两种泡沫 一种存在于发酵液的液面上 叫做表面泡沫 这类泡沫气相所占比例特别大 泡沫是密集的 含有许多被液膜隔开的单个气泡 其形状是多面体的 泡沫与它下面的液体之间有能分辨的界线 谷氨酸正常发酵所形成的就是这一类 另一种泡沫出现在黏稠的发酵液中 当谷氨酸发酵感染杂菌或噬菌体等不正常发酵时就形成这种泡沫 叫做内部泡沫 这种泡沫分散很细 且均匀 比较稳定 它没有明显的液面界线 泡沫中气泡是球形的 也称为流态泡沫 泡沫的稳定性 主要与液体的性质 如表面张力 表面黏度和泡沫机械强度等有关 表面张力是一种沿着液体表面并与表面平衡的 力图使表面缩小的力 各种物质由于它们分子问的相互作用力不同 表面张力就不同 凡能够降低液体表面张力的物质叫做表面活性物质 液体表面张力降低就增加了泡沫的稳定性 表面活性剂在气泡周围形成坚固的保护膜 大大增强了泡沫的机械强度 表面活性剂分子中具有亲水的极性部分 如 OH COOH COR NH2等极性基团 和疏水的非极性部分 它们在水溶液的表面层有规则的排列 极性的一端向着水溶液 非极性端向着空气 致使泡沫的机械强度增大 一般起泡剂分子的烃链越长 链间的分子引力 范德华引力 越大 膜的机械强度越大 蛋白质除分子间引力外 还有氢键引力 故蛋白质形成泡沫比较牢固 泡沫的稳定性很大程度上还取决于液体的黏度 气泡间的液膜由于受地心引力和曲面压力的作用 使气泡间的液体流失 液膜不断变薄 最后使泡沫破裂 如果液体表面黏度足够大 气泡间液体流失减少 液膜便能克服外力的振动 使泡沫稳定 此外 泡沫的表面积 温度 pH 溶液浓度等对泡沫的稳定性均有影响 4 5 3发酵过程泡沫形成的规律 发酵过程泡沫的形成有一定的规律性 泡沫的多少 一方面与搅拌 通风有关 另一方面与培养基性质有关 蛋白质原料如蛋白胨 玉米浆 黄豆粉 酵母粉等是主要的发泡剂 葡萄糖等本身起泡能力很差 但丰富培养基中浓度较高的糖类增加了培养基的粘度 使泡沫稳定 培养基灭菌方法和操作条件会影响培养基成分的变化面影响泡沫的生成 谷氨酸产生菌本身有稳定泡沫的作用 特别是当感染杂菌和噬菌体时 泡沫特别多 发酵条件不当 菌体自溶时泡沫增多 通气和搅拌强度大 泡沫增加 代谢旺盛 排出CO2多 泡沫也增加 4 5 4泡沫的消除 消泡的方法物理方法 机械方法和化学消泡剂消泡等三种 机械消泡是借助于机械力将泡沫打破或借压力变化使泡沫破裂 机械消泡的优点是不需要在发酵液中加入其它物质 节省消泡剂 减少加入消泡剂所引起的污染机会 其缺点是不能从根本上消除引起泡沫稳定的因素 消泡效果不如化学消泡剂迅速可靠 化学消泡剂消泡是在发酵液中加入一种消泡剂以消除起泡因素 其优点是消泡效果好 作用快 尤其是合成消泡剂效率高 用量少 其缺点是需要消泡剂 如果选择不当会影响菌体生长或代谢产物的生成 操作上增加了染菌机会 若添加过量会影响氧的传递 从而影响菌体正常代谢 如用植物油 由于生物素含量多 用量多会影响谷氨酸积累 消泡剂消泡的机理在发酵液中加入消泡剂 一方面是起破泡作用 另一方面是起抑泡作用 当消泡剂加入发泡体系中 由于消泡剂的表面张力低 相对于发泡体系 在消泡剂接触液膜面时 成为泡膜的一部分 使泡膜面扩大 使泡膜变薄 同时使泡膜局部表面张力降低 气泡破裂 合并 最后导致泡沫破灭 抑泡作用 可以看成是除去发泡剂的吸附层 而抑泡剂的分子优先吸附 当在发酵过程中吸附了消泡剂的发酵液 由于表面黏度在局部地方显著降低 该部分泡膜就容易破裂 消泡剂及选用原则发酵工业中使用的消泡剂必须具有以下特点 a 必须是表面活性剂 b 具有一定的亲水性 c 在水中的溶解度极小 保持持久的消泡或抑泡作用 d 无毒或低毒 对菌体生长和代谢几乎无影响并不影响产物提取和产品质量 e 不干扰溶氧 pH等测定仪表的使用 最好不影响氧的传递 f 具有良好的热稳定性 g 来源方便 价格便宜 发酵工业上常用的消泡剂主要有四类 天然油脂类 高碳醇 脂肪酸和脂类 聚醚类 硅酮类 以聚醚类和硅酮类的性能比较优越 应用广泛 在谷氨酸发酵上常采聚醚类消泡剂 目前 味精厂普遍采用BAPE 聚氧乙烯聚氧丙醇胺醚 PPE 聚氧乙烯聚氧丙烯季戊四醇醚 作为消泡剂 BAPE和PPE属非离子型表面活性剂 消泡能力强 用量少 毒性低和使用方便 消泡剂的使用在发酵培养基配料时一次加入 一般添加量为0 02 0 04 中间流加法 在消泡罐中将消泡剂配制成20 30 浓度 经灭菌冷却 当发酵产生泡沫时加入 以上两种方法结合使用 在配料时加入少量消泡剂 对发酵前期控制泡沫有较好作用 然后根据需要流加 有利于发挥消泡剂的作用 目前谷氨酸发酵普遍采用此法 4 6发酵过程主要变化及中间代谢控制 谷氨酸发酵是复杂的生物化学反应过程 而且不同菌种 不同原料和不同发酵工艺其发酵过程的变化是不同的 然而在一定条件下 发酵过程的变化具有一定的规律性 发酵过程变化由多种参数所反映 根据菌体在发酵过程中变化和作用 可把发酵过程分为四个阶段来叙述 适应期在发酵初期即种子刚接入发酵罐时 菌体处于适应期 以适应新的环境条件 细胞进行呼吸作用 利用贮存物质合成大分子物质和所需能量 菌体个体长大 但没有分裂 此时糖等营养物质消耗很慢 适应期的长短取决于菌体活力 接种量 发酵培养基和发酵条件 对于谷氨酸发酵一般3h左右 但采用高生物素 大接种量和添加青霉素工艺时适应期明显缩短 对数生长期菌体经过适应期后就开始繁殖 并很快进入对数生长期 代谢逐渐旺盛 菌体大量繁殖 OD直线上升 菌体形态与二级种子相同 绝大多数为八字形排列 耗糖速率逐渐加快 糖作为碳源和能源用于合成细胞和合成反应所需要的能量 pH下降 应及时通氨保持pH稳定 由于菌体代谢活动 放出热量 温度上升 一般发酵5h左右温度开始上升 应注意降温 耗氧量很快增加 发酵液的溶氧下降 应根据情况提高风量 特别是对数生长期末期应注意风量 对数生长期一般为发酵3 8h或4 10h 转化期在生物素限量的情况下 部分菌体内生物素由丰富转向贫乏 该部分菌就停止繁殖 在条件适宜时开始伸长 膨胀 形成产酸型细胞 开始积累谷氨酸 但由于菌体增殖并非完全同步 还有部分菌体为增殖型 这就是菌体由增殖型向生产型转化的时期 时间约为发酵8 14h或10 18h 转化期为代谢最旺盛阶段 耗糖加快 谷氨酸积累迅速增加 耗氧速率加快 并接近最大值 发酵控制方面必须充分供氧 即风量达到最大 由于开始大量合成谷氨酸 故pH下降很快 应提高通氨速率 保持pH7 2左右 此时放热也达到最大 应及时降温维持在适宜的发酵温度 由于发酵旺盛 泡沫也显著增加 注意消泡 转化期控制的好坏是发酵成败的关键 一般来说 加大风量对菌体的伸长 膨大有促进作用 产酸期菌体完成由增殖型向生产型转化后 菌体形态几乎都是伸长 膨大 边缘不完整 像花生 产酸速率达到最大 糖酸转化率60 以上 因产酸快 pH下降亦快 应加大通氨速率 使pH维持在7 2左右 为了加快产酸速率可适当提高发酵温度 随着发酵时间的延长 糖已逐渐耗尽 菌体活力也逐渐降低 因此在发酵后期可适当降低风量 pH亦可降至6 8 7 0 如果菌种质量不好 菌体生长失调 或者环境条件改变 不利于正常发酵 就得不到正常发酵的规律性 而引起不正常的发酵现象 由于谷氨酸发酵是一系列的生化反应过程 影响因素很多 所产生的异常现象也是多种多样的 4 7异常发酵现象及其处理 发酵前期pH过高 原因种子感染噬菌体或培养基贫乏 处理方法如感染噬菌体应按感染噬菌体处理 如培养基原因则根据情况补料 菌体生长缓慢或不长 原因是感染噬菌体 培养基贫乏 菌种老化 前期通风过大 处理方法如感染噬菌体按感染噬菌体处理 如培养基贫乏 则补料 如菌种老化 则换种或补种 如前期风量过大 则停搅拌 小通风 中后期耗糖慢 产酸低 原因是菌种老化 前期通风过大 种子或发酵温度前期过高 生物素不足 处理方法降风量 如残糖较高 则补种或并罐发酵 生物素不足则补料 发酵12 14h后OD还继续上升 原因是生物素过量或染菌 处理方法生物素过量则提高风量 提高温度 如染菌则按染菌处理 耗糖快 pH偏低 产酸低 原因生物素过量 pH低 通风不足或染菌 处理方法提高风量 提高pH 如染菌则按染菌处理 发酵液变红色 原因是生物素过量 通风不足 处理方法提高风量 谷氨酸生成后又下跌 原因 pH偏低 NH4 过量 谷氨酸转变为谷氨酰胺 大量下跌 可能染菌 处理方法 及时流加液氨 提高pH 按染菌处理 泡沫太多 原因 水解糖质量不好 染菌 处理方法如水解糖质量不好则改进水解糖质量 如染菌则按染菌处理 4 8提高发酵产率的主要措施 1964年 国内应用发酵法生产味精获得成功 并在上海首先采用发酵新工艺投产 之后在国内逐步推广 有力地推动了我国味精工业的崛起 自从发酵法生产谷氨酸成功以来 人们从各方面进行研究 以获得谷氨酸发酵的最大产率 使底物葡萄糖能迅速地最大限度地用于合成谷氨酸 许多重要的研究成果已经利用于谷氨酸的生产 使谷氨酸的产量 对糖转化率均有很大提高 发酵周期也不断缩短 目前 国内发酵法制造味精的生产技术进步较大 尤其近几年进展更快 无论菌种还是工艺方法及装备水平 逐步缩小与国际问的差距 但是 目前国内在技术上与国外先进水平比较还有较大的差距 还需要进行很多工作 谷氨酸发酵的经济效益主要体现在产酸率 对糖转化率 发酵周期 单位体积设备产量和动力消耗等方面 谷氨酸发酵是一复杂的生化反应过程 影响因素很多 提高谷氨酸发酵的生产水平必须从以下几方面进行 选育优良的高产菌种 适宜的环境条件 好的原料质量 合理的发酵设备 有效的管理措施 一 选育高产菌种 改良菌种性能 选育高产稳产的新菌种是提高谷氨酸发酵产率的主要途径之一 日本等国发酵界一直致力于探索选育各种生化标记的菌株 20世纪70年代已阐明了选育长链不饱和脂肪酸缺陷型和甘油缺陷型的方法和效果 随后又选育出温度敏感突变株 各种抗药物突变株 各种药物敏感突变株 各种酶活力变化突变株及其它生化特性突变株 许多生化标记突变株的谷氨酸发酵对糖转化率比亲株有大幅度提高 有些超过60 同时采用遗传工程和细胞工程新技术改造原有高产菌株的性能 提高了生长 耗糖和产酸速度 而且耐高温 高糖和高酸 二 改进发酵工艺 高初糖发酵高初糖发酵是指初糖浓度达180 200g L进行发酵 这种发酵的优点是操作方便 设备利用率高 谷氨酸浓度高 容易提取 但是 糖浓度高 渗透压大 菌体不适应 同时糖浓度高 氧传递阻力增大 必须强化供氧 要实施该工艺 首先要选育出耐高渗透压的菌种 然后控制好发酵工艺条件 在高初糖谷氨酸发酵中 高玉米浆用量和高生物素用量可以明显降低高初糖对菌体细胞的抑制作用 且在接种量为10 玉米浆用量为0 55 生物素用量为10 g L 初糖为190g L的谷氨酸发酵中 流加500g L的浓糖 30h的产酸率达到145 8g L 糖酸转化率达到60 32 降低发酵初糖浓度 连续流加糖发酵降低发酵的初糖浓度 可降低渗透压 有利于菌体生长和代谢产物的分泌 同时提高氧的传递速率 提高溶氧水平 特别是对采用高生物素 大种量 添加青霉素的强制发酵工艺更为重要 青霉素发酵工艺 由于菌体细胞壁被破坏 细胞膜部分失去细胞壁的保护作用 对外界环境非常敏感 在低渗透压下细胞代谢稳定 有利于发酵 同时 与控制生物素用量的发酵相比 由于种量大 繁殖快 适应期短 产酸快 发酵周期短 混合碳源发酵据报道 采用葡萄糖和醋酸混合碳源比单一葡萄糖为碳源的发酵谷氨酸对糖转化率提高30 即使是全部为糖质原料也可选用不同种原料混合使用 既可用部分廉价原料又能提高产酸 4 9低糖流加工艺及后期补糖工艺 谷氨酸发酵工业化的实现源于氮源的流加 而高产酸的突破关键应归功于碳源的流加 即补糖分批发酵工艺 近年来 我国谷氨酸发酵行业不断应用新技术 使谷氨酸发酵水平大幅度提高 有不少厂家已经接近世界先进水平 目前 我国谷氨酸发酵领先水平主要表现在发酵30h产酸率达到12 15 糖酸转化率达到56 62 而达到这些指标的厂家都应用大接种量 8 10 生物素亚适量 5 8 g L 流加浓糖 50 的发酵工艺 在谷氨酸发酵中某一生长阶段 生长菌摄氧率与底物消耗速率之间存在着线性关联 据此 补料速率可用摄氧率控制 将其控制在与基质消耗速率相等的状态 流加糖时间选择在发酵中前期较好 此时 菌体生长旺盛 活力强 耗糖快 转化率高 一般在残糖3 5 时开始添加 因此 应在12 14h时开始流加 尽可能使流加糖与耗糖速率保持平衡 流加 补糖 发酵工艺 中后期残糖浓度应根据不同菌种经过多次试验确定 一般在1 5 5 之间 补料分批发酵 流加高浓度 高质量糖液是提高谷氨酸生产水平和降低生产成本的较好工艺 是我国谷氨酸发酵的发展方向 4 10糖蜜原料发酵生产谷氨酸 甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜是很好的发酵原料 用糖蜜原料发酵生产谷氨酸 可省去淀粉制糖工序 降低成本 节约能源 节约酸 碱 简化操作 便于采用大种量 添加青霉素 或表面活性剂 低糖流加发酵工艺 有利于产酸和转化率的提高 国外 谷氨酸发酵主要是以糖蜜为发酵原料 采用大种量 10 左右 添