基因表达系列分析(Serial Analysis of Gene Expression,SAGE)技术.doc

SAGE 技术 MRNA 结合到微珠子上(Microscopic Bead and mRNA) mRNA 转录成 DNA(mRNA binds to bait and is copied into DNA) 用酶切开DNA的一小段(An enzyme cuts the DNA) 另一个酶定在DNA末端以便切下一小段(An enzyme locks onto the DNA and cuts off a short tag),这一小段就被视为这个基因的标签 两个标签连在一起(Two tags are linked together) 在末端的定位分子被切掉(Enzymes cut off the Docking Molecules) 都连成一条线(Di-Tags are combined into large concatemers) DNA上所携带的遗传信息，需要通过RNA为中介体，合成出组织和正常生理功能所需要的蛋白质，这个过程被称为基因的表达。在生物体中不同的组织和器官所表达的基因群是不一样的，我们把基因群的表达状况称为基因表达谱。目前，高通量地研究基因表达谱的方法主要有两种，即生物芯片和基因表达串联分析（serial analysis of gene expression, SAGE）。基因芯片所能检测的基因必须是已知的基因，放在芯片上几种基因的探针就只能检测这几种基因的表达谱；相比之下，SAGE能以远高于DNA芯片的精确度和重复性来检测在病理条件下基因表达谱的改变，而不必考虑所检测的基因是已知的还是未知的。因此在检测疾病相关的新基因，特别是无法用基因芯片进行检测的低表达量致病基因时，SAGE是目前的最佳手段，无可取代。SAGE技术为Genzyme公司所拥有的专利技术。其技术简介如下：SAGE技术得以建立的理论基础首先，一段来自于任一转录本特定区域的标签（Tag），即长度仅9-14bp的短核苷酸序列，就已包含足够的信息以特异性地确定该转录本。例如：一个9碱基的序列能有49=262144种不同的排列组合，而人类基因组据估计仅编码80000种转录本，因此在理论上每一个9碱基标签就能够代表一种转录本的特征序列。第二，如果将短片段标签相互连接、集中形成长的DNA分子，则对该克隆进行测序将得到大量连续的单个标签，并能以连续的数据形式进行处理，这样就可对数以千计的mRNA转录本进行批量分析。第三，各转录本的表达水平可以用特定标签被测得的次数进行定量。SAGE的主要实验阶段：1）以biotin-oligo dT为引物将mRNA反转录合成双链cDNA，以一种锚定酶（Anchoring Enzyme, AE）进行酶切后，收集其cDNA的3端部分。锚定酶通常为识别4碱基位点的III类限制性内切酶，如Nla III、Sau3A I等。由于大多数mRNA的长度要大于44=256个碱基，因此使用这种锚定酶可以保证在每一个转录本上至少有一个酶切位点。2）将收集的3端cDNA等分为两部分，分别同接头A、B相连接。每一种接头的结构都由PCR扩增引物A或B的序列-标签酶识别位点-锚定酶识别位点三部分组成。标签酶（Tagging Enzyme, TE）是一种IIS类限制性内切酶，如BsmF I等，它在距识别位点下游约20个碱基的位置切割DNA双链。3）连接产物以标签酶酶切后用Klenow酶补平5突出端，得到两组分别带有接头A、B的短cDNA片段（约50个碱基）。混合并连接两组短cDNA片段，形成一个约100个碱基的双标签体（ditag）群，并以引物A和B对其进PCR扩增。4）用锚定酶切割扩增产物，分离纯化去除接头后的双标签体（约26个碱基），并使之相互连接成为大片段的连接体，克隆至质粒载体内形成一个SAGE文库以备集中测序。5）对测序得到的标签数据进行分析处理。在所测得序列中的每个双标签体之间由锚定酶序列相间隔，一般一个测序反应的结果可得到约20个双标签体，亦即包含了约40个转录本的信息。由于双标签体的长度基本相同，不会产生PCR扩增的偏态性；同时数量和种类极大的转录本群体使得由同两个标签重复连接成双标签体的可能性极小，因此通过计算机软件的分析统计能够相当精确地得到上千种基因表达产物的标签序列及其丰裕度。对于在已知的数据库中找不到相同序列的标签，还可以利用约13个碱基的寡核苷酸探针（锚定酶识别位点标签序列）对cDNA文库进行筛选，以寻找新基因。SAGE可以检测不同细胞间已知基因表达的具体差异（可精确到每个细胞中大约有多少拷贝），可建立较全面的基因表达谱，系统地分析基因表达的差异。基因是生物制药事业的源头，生长点和制高点，源于基因的技术拓展将是21世纪制药企业开发新品的基础，基因研究现在成为全球瞩目的焦点。目前，世界上各大制药，化工和农业公司都在积极地进行改组、合并和建立新联盟，以通过基因相关的研究和开发加强自己的竞争实力。尽管基因产业所需的投资数目非常大，探索工作也非常艰辛（比如分离囊性纤维病变基因花了十年时间，耗资1.5亿美元以上），但一旦找到一个能够编码重要功能的蛋白的基因后，其回报将是无比丰厚的，发现者获得该基因的专利。科研人员可以之进行相关研究并设计相关的防治药物，医药公司可在专利期满之前获取市场巨额垄断利润。可见一个基因可以成为一个企业，甚至带动一个产业。基因是一种有限资源，人体共有约3万4千个基因，人类基因组只有一套，世界各国投入巨资寻找基因的研究实为一场基因抢夺战基因侦探们在这3万4千个基因中逐个探索，谁占有较多的基因专利，谁就将在人类基因的商业开发方面抢得先机。SAGE技术研究基因表达谱是1995年才开始的工作，有相当高的技术难度，目前全世界仅有数家实验室能完全掌握SAGE技术。用SAGE技术得到的数据比DNA芯片有高得多的可靠性和再现性，利用其可高效率地进行基因表达谱数据库的收集工作。通过后续的生物信息学处理、转基因等研究方法，可以高效率地找到疾病相关基因，开发出疾病诊断的新方法，为新药研究和新治疗法的开拓提供坚实可靠的基础。两者比较基因表达序列分析（SAGE）和大规模平行测序技术（MPSS）是两个基于短标签测序的方法。它们可以通过短的序列标签（SAGE短的序列标签为10或17bp，MPSS大规模平行测序技术短的序列标签为13或20 bp），能够量化基因的表达，这些标签在多聚腺苷酸转录物内，毗邻NlaIII（SAGE）或DpnII（MPSS）的3端。SAGE和MPSS实验的结果是短序列集，某一特定标签的频率代表对应转录物的丰度。虽然SAGE和MPSS可以产生类似的输出结果，即一系列的标签，但它们的实验方案是完全不同的。例如，SAGE使用传统的克隆及DNA测序方法，MPSS则基于酶消化和杂交，利用新的克隆和专属的平行测序方案。因此，SAGE平均输出包含10万个标签，而MPSS能够输出包含超过1,000,000个标签。 一个在SAGE和MPSS数据分析中的重要步骤就是正确指定/定位标签到基因。基本上有三种策略来完成这个过程：(1) 基于数据库的注解，数据库通过内部电脑方案构建；(2) 注解，标签对标签，通过网络站点完成，如SAGE Genie数据库和SAGEmap数据库。SAGEmap是美国国家癌症研究所（NCI）提供的一个在线SAGE分析工具，其数据库包含多种正常组织、癌前病变组织和肿瘤组织的SAGE文库。SAGE Genie数据库在SAGEmap的基础上提供了更为友好的界面，通过查询SAGE Genie数据库，可以获知基因在正常组织和癌变组织中的相对表达量；(3) 利用参考数据库大规模注解。 SAGE分析的另一个重要步骤是识别每个样本中的不同标签。为此，有几种方法可以采取，与Baggerly等人、Thygesen和Zwinderman以及Zuyderduyn所描述的一样。SAGE的显著特点是快速高效地、接近完整地获得基因组的表达信息，它可以定量分析已知基因及未知基因表达情况。在疾病组织、癌细胞等差异表达谱的研究中，SAGE可以帮助获完整转录组学图谱，发现新的基因及其功能、作用机制和通路等信息。MPSS是对SAGE的改进，它能在短时间内检测细胞或组织内全部基因的表达情况，是功能基因组研究的有效工具。但它需要的配套软硬件较为昂贵，目前国内外相关的应用报道不多。MPSS技术对于致病基因的识别、揭示基因在疾病中的作用、分析药物的药效等都非常有价值，该技术的发展将在基因组功能及其相关领域研究中发挥巨大的作用。SAGE和MPSS技术自出现以来，就被人们广泛应用（特别是SAGE技术）。许多公布的实验，尤其是癌症研究实验都已经开始用这些方法来分析基因的整体表达。最早对人类癌基因组进行全面基因分析的技术是SAGE。