Chap-5-Protein-Structure-C[1].ppt

1 生物化学 1 杨缜Office 实验楼S 329Tel 26534152e mail zyang 第5章蛋白质结构第6章酶第7章核酸苷与核酸第8章维生素与辅酶 2 第五章蛋白质结构 Introduction一级结构二级结构三级结构四级结构变性和折叠结构与功能的关系研究蛋白质构象的方法 3 I Introduction 蛋白质结构研究的里程碑蛋白质结构总述稳定蛋白质结构的重要作用力四级蛋白质结构 4 1 蛋白质结构研究的里程碑 I Introduction 5 TheNobelPrizeinChemistry1954 forhisresearchintothenatureofthechemicalbondanditsapplicationtotheelucidationofthestructureofcomplexsubstances LinusCarlPaulingUSACaliforniaInstituteofTechnology Caltech Pasadena CA USAb 1901d 1994 6 TheNobelPrizeinChemistry1958 forhisworkonthestructureofproteins especiallythatofinsulin FrederickSangerUnitedKingdomUniversityofCambridgeCambridge UnitedKingdomb 1918 7 TheNobelPrizeinChemistry1962 fortheirstudiesofthestructuresofglobularproteins MaxFerdinandPerutz1 2oftheprizeUnitedKingdomMRCLaboratoryofMolecularBiologyCambridge UnitedKingdom1914 2002 JohnCowderyKendrew1 2oftheprizeUnitedKingdomMRCLaboratoryofMolecularBiologyCambridge UnitedKingdom1917 1997 8 2 蛋白质结构总述 每一个蛋白有一个独立的结构氨基酸序列 三维空间结构 生物功能蛋白质结构的稳定性主要靠 四种非共价作用力二硫键 共价键 水有一些共同的结构模式蛋白质结构很灵活 flexible I Introduction 9 3 蛋白质结构稳定化的重要因素 I Introduction 10 4 蛋白质的四级结构 11 氨基酸序列的重要性氨基酸序列的测定 II 一级结构 12 1 氨基酸序列的重要性 氨基酸序列和生物功能之间的关系蛋白质的同源性分子病 Moleculardisease II Primarystructure 13 氨基酸序列 三维结构 生物功能有不同功能的蛋白质总是有不同的氨基酸序列 上千中遗传病是由于蛋白质缺陷引起的 从不同物种来源功能相似的蛋白通常有相近的氨基酸序列 e g Ubiquitin 1 氨基酸序列和蛋白质功能之间的关系 II Primarystructure Bovineinsulin 牛胰岛素 Cow pig dog goat horse Human pig dog rabbit spermwhale 14 2 蛋白质的同源性 不变残基 可变残基 同源蛋白质 II Primarystructure P 181 Cytochromec MW 12 500 100氨基酸28不变残基 保守变化 不保守变化 在不同生物体中行使相同或相似功能的蛋白质称同源蛋白质 同源蛋白质的氨基酸序列具有明显的相似性 成序列同源性 15 细胞色素c的进化树 II Primarystructure P 182 16 从蛋白同源性的研究所能得到的信息 不变残基 对蛋白质的结构和功能起重要的作用可变残基 氨基酸差异数与物种间的系统发生差异成正比氨基酸差异数与物种进化的分歧时间成正比不同物种来源的蛋白质的序列同源性和生物活性之间的关系 有相关生物功能的蛋白质经常表现出高度的序列同源性e g 珠蛋白家族 P 185序列同源性很高的蛋白质会显示出趋异的生物功能e g 丝氨酸蛋白酶家族 P 185一些生物活性很不相同的蛋白质具有共同的起源Lysozyme 溶菌酶 vs lactalbumin 乳白蛋白 Actin 肌动蛋白 vs hexokinase 己糖激酶 17 3 分子病 镰刀形红细胞白血病 基因突变 碱基取代 蛋白质突变 氨基酸取代 InheritedblooddisorderMoleculardiseaseCausedbymutanthemoglobin 突变型血红蛋白 Productofgenealteration ExcruciatingpainEventualorgandamageEarlierdeath Symptoms HbAandHbS的 链片断 正常人的血红蛋白 HbA 镰刀形的血红蛋白 HbS Val His Leu Thr Pro Glu Glu Lys Val His Leu Thr Pro Val Glu Lys 18 19 血红蛋白 HbA HbS 载氧力低 基因突变 红血球 cup shaped Sickled shaped 寿命短 小血管堵塞 贫血 脱氧 HbS O2 20 1 一般步骤 P 168 1812 分离多肽链3 确定N端4 确定C端5 部分断裂多肽链6 肽链测序举例7 测序的其他方法 2 氨基酸序列的测定 II Primarystructure 21 1 一般步骤 确定蛋白质中多肽链的数目拆分蛋白质分子的多肽链确定每条链的氨基酸组成确定每条链的C 端和N 端裂解多肽连链成较小的片断 并进行其氨基酸组分和序列的分析重复e 用不同的断裂方法把多肽链降解成几套重叠的肽段重建完整多肽连的一级结构确定二硫键的位置 II Primarystructure P 168 181 22 2 多聚蛋白质亚基的解离 由非共价作用连接的亚基 用以下试剂处理 强酸 强碱6M盐酸胍8M尿素由共价作用的二硫键连接的亚基 断裂二硫键 II Primarystructure 23 II Primarystructure 二硫键的断裂 巯基乙醇 过甲酸 P 171 24 3 N端的确定 DNFB Sanger smethodDNSPITC Edman smethod氨肽酶 II Primarystructure P 169 25 DNP aminoacid yellow II Primarystructure PTH aminoacid colorless DNS aminoacid fluorescent DNSmethod 丹黄酰氯法 Sanger smethod DNFB法 Edman smethod PITC法 N端的确定 也可用于序列分析 26 4 C端的确定 NH2NH2 肼解 LiBH4 还原 羧肽酶 II Primarystructure P 170 27 C端的确定 II Primarystructure 肼解法 还原法 氨基酸酰肼化物 28 5 部分断裂多肽链 II Primarystructure P 173 29 6 氨基酸序列分析举例 Sanger smethod Edman法降解 DNFB PITC II Primarystructure 30 水解 DNFB 定N 末端 胰蛋白酶 CNBr II Primarystructure Anexample 氨基酸组成 N 端 二硫键断裂 裂解成片断 排序 31 用外切酶的酶降解法 P 177质谱 P 177根据DNA序列的推定法 P 177蛋白质数据库 P 181 7 氨基酸序列分析的其他方法 II Primarystructure 32 肽平面常见二级结构元件超二级结构结构域纤维状蛋白质举例 III 二级结构 33 1 肽平面 肽平面是蛋白质分子的基本结构单位肽平面由肽键形成 肽键具有部分双键性质肽键具有反式构型 C vsC Co C 和C N两键可自由转动刚性平面相邻的两个肽平面之间由C 连接二面角的概念拉氏构象图 III Secondarystructure carbon carbon P 204 34 35 二面角的定义 P 204两个二面角的变化范围 180o 180o有些角度在空间上受限制 如 0o 0o 180o 180o 0o肽链的骨架有二面角决定 二面角 and N Co C C P 204 36 二面角的定义 and C N键 C Co键0o当 或 键所在的肽平面二等分H C R所在的平面 且该旋转键两侧的主链处于顺式构型时 规定 0o或 0o and 从C 沿键轴方向观察 顺时针旋转的 或 为 值逆时针旋转的 或 为 值 N Co C C P 204 37 0o 不允许 180o 充分伸展 38 拉氏构象图 III Secondarystructure 允许区 不完全允许区 不允许区 39 2 常见二级结构元件 螺旋 折叠片 转角无规卷曲常见二级结构元件的二面角和各氨基酸出现的几率 III Secondarystructure 40 A 结构参数 每一转 0 54nm 3 6个残基 13个原子 3 613 螺旋每个残基 100o 0 15nm 57o 47o一般都是右手螺旋B 手性和旋光性 右手螺旋稳定性 充分利用链内氢键偶极 III Secondarystructure 肌红蛋白 1 螺旋 P 207 41 每一转 0 54nm3 6residues13atoms每个残基 100o0 15nm Helix C O N H 42 43 III Secondarystructure Helix的氢键 3 613 helix 44 手性和旋光性 偶极和极性 右手 螺旋和左手 螺旋不是对映体 蛋白质中的 螺旋几乎都是右手的 45 相邻R基的电荷相邻R基的大小相隔3 4个残基的R基之间的相互作用Pro和Gly 均不常见肽链末端残基的相互作用 螺旋稳定性的影响因素 P 208 46 多聚赖氨酸 多聚谷氨酸 47 共同特性 折叠片由两条或两条以上肽链片段并排而成 折叠片中每条肽链称为 折叠股每条 折叠股充分伸展成锯齿状起稳定作用的氢键是在股间而不是在股内形成形成 折叠片的肽链片段可以位于不同肽链上或同一条肽链的相邻或相距很远的位置每条 折叠股上相邻的氨基酸残基的R基团交替出现 2 折叠片 P 209 III Secondarystructure 48 反平行式 平行式 折叠片 平行式和反平行式 III Secondarystructure C 49 反平行式 平行式 反平行式比平行式更稳定 50 折叠片 平行式和反平行式的比较 51 3 转角 非重复性结构每一转涉及4个氨基酸残基经常出现在 转角中的氨基酸残基 Gly 体积小 结构灵活Pro 环状结构和固定的 通常连接相邻两段反平行式 折叠片末端通常处在蛋白质分子的表面 III Secondarystructure P 211 52 4 无规卷曲 泛指不能被归入明确的二级结构的多肽区段这些区段多数既不卷曲 也不是完全无规 受侧链相互作用的影响较大 III Secondarystructure P 212 53 5 常见二级结构元件的二面角和各氨基酸出现的几率 54 是一种 螺旋束组成 螺旋束的每一股是右手 螺旋整个 螺旋束是左手卷曲螺旋是纤维状蛋白质的主要结构模式 由两段平行 折叠股和一段作为连接链的 螺旋组成 由 转角连接的反平行 折叠片 3 超二级结构 III Secondarystructure 二级结构是蛋白质分子中由若干相邻的二级结构元件组合在一起形成的稳定的结构组合及其相互作用 P 220 55 超二级结构的主要类型 Rossman折叠 hairpin 发夹 meander 曲折 Greekkey 希腊钥匙拓扑结构 III Secondarystructure 56 4 结构域 P 222 57 结构域 结构域是多肽链折叠形成的相对独立的紧密球状实体从多肽链上分离出来的结构域通常仍保持其三维结构不同的结构域通常有不同的功能 酶的活性中心通常位于两个结构域之间 见图5 35 P 224 III Secondarystructure 58 角蛋白 螺旋 P 212 角蛋白 折叠片 P 214 丝心蛋白 反平行式 折叠片 P 214 胶原蛋白 三股螺旋 P 215 5 纤维状蛋白举例 III Secondarystructure 59 头发的结构 1intermediatefilament 4初原纤维 8protofilaments 16coiledcoils 32股 角蛋白 Right handedhelix Left handedsupertwist 初原纤维 60 胶原蛋白 III Secondarystructure 61 胶原蛋白的结构 棒状分子 分子量300 000 长度 3000 1000氨基酸残基 厚度 15 由三股 链缠绕组成的超螺旋 链 螺旋 每条 链 左手螺旋 每转3个氨基酸残基 三股螺旋 右手螺旋 链的氨基酸重复序列 Gly X Pro Gly X HyPro氨基酸含量 35 Gly 11 Ala 21 Pro HyPro紧密包装 抗张强度 比同样横截面积的钢丝强 III Secondarystructure 62 Helix keratin conformation keratin Moistheat Cooling RearrangementofHbonds RearrangementofS SbondsandHbonds III Secondarystructure Permanentwavingisbiochemicalengineering 63 IV 三级结构 纤维状蛋白和球状蛋白球状蛋白的结构通性肌红蛋白球状蛋白的分类 64 1 纤维状蛋白和球状蛋白 65 2 球状蛋白的结构通性 含多种二级 超二级结构和结构域紧密球状结构疏水侧链 在内侧亲水侧链 在外侧4 分子表面的空穴 裂沟是底物等配体与蛋白质结合的场所5 在一级结构中彼此远离的基团在球状蛋白结构中互相靠近 IV Tertiarystructure P 228 66 细胞色素c 溶菌酶 核糖核酸酶 IV Tertiarystructure 表面轮廓图解 带式图解 67 IV Tertiarystructure 单链蛋白质中 螺旋和 折叠片的相对含量 68 3 肌红蛋白 1个血红素8段 螺旋 MW16 700一条多肽链含153个氨基酸 69 抹香鲸肌红蛋白的三级结构 Polypeptidebackbone A mesh image Asurfacecontourimage Aribbonrepresentation Aspace fillingmodel 70 全 结构蛋白质 肌红蛋白全 结构蛋白质 or 结构蛋白质富含金属或二硫键蛋白质 4 球状蛋白的分类 IV Tertiarystructure P 224 71 V 四级结构 与四级结构有关的几个概念 P 242血红蛋白四级结构的对称性 P 246四级缔合的驱动力 P 243四级缔合在结构和功能上的优越性 P 247 72 1 与四级结构相关的几个概念 蛋白质 单体蛋白质 多聚蛋白质 同多聚蛋白质e g hexokinase 4 杂多聚蛋白质e g chymotrypsin 血红蛋白 2 2 两个原体 组成的一个二聚体 四个单体 2 2 组成的四聚体 Polypeptide 多肽 Subunit 亚基 Protomer 原体 Monomer 单体 IV Quaternarystructure Polypeptidechaine g myoglobin P 242 73 2 血红蛋白 亚基 亚基 血红素基团 血红蛋白 分子量64 5004个亚基2 2 4个血红素基团 Space fillingmodel Ribbonpresentation 74 3 四级结构的对称性 旋转对称 密闭结构二面体对称 四面体对称八面体对称二十面对称2 螺旋对称 开放结构 IV Quaternarystructure P 246 75 蛋白质中的旋转对称 二面角对称 二十面体对称 76 Poliovirus 脊髓灰质炎病毒 Icosahedralsymmetry 二十面体对称 Viralcapsids Tobaccomosaicvirus 烟草花叶病毒 Helicalsymmetry 螺旋对称 77 4 四级缔合的驱动力 亚基的缔合伴随着有利和不利的能量变化有利的 范德华力氢键离子键疏水作用二硫键不利的 熵的减少 IV Quaternarystructure 免疫球蛋白 P 243 78 增强结构稳定性蛋白质的表面积 体积之比下降蛋白质内部的相互作用力增加疏水残基被屏蔽提高遗传经济性和效率编码容量蛋白质生物合成的准确率使催化基团汇集在一起使来自不同亚基的催化基团汇集以形成完整的催化部位 e g glutaminesynthetase 在不同亚基上催化不同的但有关的反应 e g tryptophansynthase 协同性和别构效应 5 四级缔合在结构和功能上的优越性 IV Quaternarystructure P 247 79 色氨酸合酶 2 2 Indoleglycerolphosphate Glyceraldehyde 3 phosphate Indole Indole L Serine L Tryptophan subunit subunit 80 协同性和别构效应 Effector 正协同性 激活剂 负协同性 抑制剂 协同性 正协同性 负协同性 别构效应 同促效应 异促效应 底物 效应物 底物 效应物 P 247 81 别构酶的亚基相互作用 82 VI 蛋白质变性 变性与复性变性条件TheAnfinsenexperiment疯牛病 P 233 83 天然折叠状态 变性的解折叠状态 变性 复性 蛋白质变性导致 结构变化生物活性丧失物理化学性质变化生物化学性质变化 1 蛋白质的变性和复性 蛋白质变性不等于其结构完全解折叠蛋白质变性不涉及一级结构共价键的破裂 注意 84 强酸强碱有机溶剂变性剂还原剂重金属离子温度变化机械应力 2 变性条件 VI DenaturationandFolding 85 强酸强碱的变性作用 蛋白质侧链基团的质子化 去质子化蛋白质分子的氢键和盐桥的改变适当控制pH可使蛋白质沉淀 VI DenaturationandFolding 86 与蛋白质的极性或非极性的R基作用与水和蛋白质的极性基团形成H键破坏蛋白质分子的疏水作用 有机溶剂的变性作用 VI DenaturationandFolding 87 变性剂的变性作用 尿素和盐酸胍 与蛋白质竞争氢键 破坏二级结构削弱蛋白质的疏水作用 破坏三级结构SDS 破坏蛋白质的疏水作用使蛋白质分子解折叠 SDS 尿素 胍 88 还原剂 如巯基乙醇 要和变性剂 如尿素 一起用 尿素 使蛋白质解折叠 分子内部的二硫键暴露出来 巯基乙醇 打断二硫键 还原剂的变性作用 VI DenaturationandFolding 89 重金属离子 e g Hg2 Pb2 对蛋白质分子结构的影响 与带负电荷的基团形成离子键 从而破坏蛋白质分子的盐桥与巯基成键铅中毒的症状之一是贫血 重金属离子的变性作用 VI DenaturationandFolding 90 由升高温度引起的变性作用 热变性 熔点 Tm 升高温度使蛋白质分子内的弱的相互作用 如氢键 受到破坏 从而导致蛋白质的解折叠 91 3 TheAnfinsenexperiment Denaturationandredenaturationofribonuclease 核糖核酸酶的变性与复性 证明蛋白质三维结构由其氨基酸序列决定的一个早期实验 加入尿素 巯基乙醇 除去尿素 巯基乙醇 VI DenaturationandFolding P 234 92 TheNobelPrizeinChemistry1972 forhisworkonribonuclease especiallyconcerningtheconnectionbetweentheaminoacidsequenceandthebiologicallyactiveconformation ChristianB Anfinsen 1916 1995 oftheprizeNationalInstituteofHealthBethesda MD USA 93 4 疯牛病 EuropaandtheBullbyGustaveMoreau watercolour 1869 94 Madcowdisease 疯牛病 Bovinespongiformencephalopathy 海绵状脑软化症 PrPc PrPsc Richin helix Richin sheets Misfolding Infectiousagent 朊蛋白 PrP MW28 000 PrPsc 95 Theabnormalprotein PrPsc 与正常蛋白有相同的氨基酸序列作为PrPc PrPsc转化的模板只溶于很强的溶剂不易被蛋白酶降解在死后器官中存活对以下各项有强抵抗力 热正常的消毒过程阳光没有免疫反应 Spongiformappearanceingraymatter Howtoidentifyifyourcowhasmadcowsdisease CreateditbyLennyBurnsonApril21 1997 whenhewasotherwisebored 97 TheNobelPrizeinPhysiology Medicine1997 forhisdiscoveryofPrions anewbiologicalprincipleofinfection StanleyB PrusinerUSAUniversityofCaliforniaSchoolofMedicineSanFrancisco CA USA 98 概述载氧蛋白 肌红蛋白 血红蛋白肌红蛋白结构蛋白结构对氧结合的影响氧结合曲线血红蛋白结构结合氧后的结构变化协同性的氧结合H CO2和BPG对氧结合的影响 VII 结构与功能的关系 99 1 概述 1 蛋白质与配体的可逆结合配体和结合位点互补性 大小 形状 电荷 疏水 亲水相互作用专一性2 蛋白质的构象易变对蛋白质功能非常必需诱导契合3 蛋白质 配体相互作用可被调节别构效应 VII Structure functionrelationship 100 别构蛋白 别构效应 同促效应 异促效应 底物 效应物 底物 效应物 Effector 正协同性 激活剂 负协同性 抑制剂 协同性 正协同性 负协同性 101 1 共同点 两者都是氧合血红素蛋白质 缀合蛋白质2 两者都属珠蛋白家族 同源蛋白质 二级 三级结构相近3 区别 2 载氧蛋白 肌红蛋白 血红蛋白 102 O2与血红素基团的结合 血红素辅基 103 含有一个Fe2 和一个原卟啉Fe2 sp3d2 有6个配位键Fe2 与O2可逆结合Fe3 不与O2结合自由血红素分子和含血红素的蛋白质静脉和动脉血 静脉血 O2 depleted 暗红色动脉血 O2 rich 鲜红色为什么CO对需氧生物毒性很高 COisastealthykiller血红素Fe对CO的亲合度比对O2的高干扰血红素的功能与其他血红素蛋白和金属蛋白结合 血红素辅基如何工作 VII Structure functionrelationship 104 鲸鱼的肌红蛋白和人的血红蛋白的 链的氨基酸序列 VII Structure functionrelationship 105 肌红蛋白 血红蛋白的结构相似性 肌红蛋白 血红蛋白 VII Structure functionrelationship 106 3 肌红蛋白 结构蛋白结构对氧结合的影响氧结合曲线 VII Structure functionrelationship 107 1 肌红蛋白的结构 存在于几乎所有哺乳动物的肌肉组织MW16 700含一个亚基 153个氨基酸残基 1个血红素基团8个 螺旋段 A H 78 的氨基酸都处在 螺旋区两个重要的组氨酸 His93 HisF8 近侧His64 HisE7 远侧 N 端 C 端 P 252 108 2 蛋白结构对结合氧的影响 DistalHis 远侧 ProximalHis 近侧 氧结合位点 分子运动ValE11和PheCD1之间产生的空穴与HisE7产生的氢键与不同配体结合的亲合度 CO O2自由血红素 20 000肌红蛋白中的血红素 200蛋白分子的疏水环境使Fe2 不容易被氧化成Fe3 结合氧使蛋白构象发生轻微变化 P 254 109 MbO2 Mb O2 MbO2 Mb O2 K 解离常数 MbO2 MbO2 Mb Y 氧分数饱和度 被O2占据的氧结合位点数 总的氧结合位点数 pO2 pO2 K Y Hillplot Y 1 Y log 当Y 0 5时 pO2 K P50 氧合曲线 3 氧结合曲线 logpO2 logK P 255 O2 O2 K pO2 pO2 P50 O2 O2 K 110 O2与肌红蛋白结合的Hill图 logpO2 0 Y 1 Y log 斜率 1 0 logP50 O2与肌红蛋白紧密结合 P50 0 26kPa Y Y 1 Y log logpO2 logK Y 0 5 111 结构氧结合引起的结构变化协同性的氧结合H CO2 BPG对氧结合的影响 4 血红细胞 VII Structure functionrelationship 112 1 血红蛋白的结构 MW64 5004个亚基 2 2 链 141个残基 链 146个残基与血红蛋白结构相似别构作用氧的运输 动脉血 96 被O2饱和静脉血 64 被O2饱和 P 257 Hemoglobin 113 两种主要构象态 T态 R态O2对R态比对T态更亲和氧结合引发T R的构象转变 Fe II HisF8和HelixF向卟啉环平面的移动一些稳定T态的相互作用被断裂 如P 261 图6 13 e g AspFG1 D HisHC3 H 盐桥一些稳定R态的新的相互作用形成 链之间形成的口袋变窄以释放BPG 2 氧结合引起的蛋白质结构变化 P 259 Hemoglobin 114 O2 Tstate 紧张态 去氧血红蛋白 Rstate 松弛态 氧合血红蛋白 H His146orHisHC3D Asp94orAspFG1 TheT RTransition O2 115 因结合氧引起的血红素辅基附近的构象变化 Hemoglobin 116 稳定脱氧血红蛋白T态的一些离子对 去氧血红蛋白T态的部分结构 稳定T态的部分盐桥 117 AspFG1 Asp94 HisHC3 His146 LysC5 118 S形氧结合曲线Hill图别构效应 3 协同性氧结合 Hemoglobin 119 氧结合曲线 Hemoglobin Y R态 T态 配体激活剂正同促效应物 O2 肌红蛋白 双曲线血红蛋白 S形曲线 120 氧结合的定量计算 MbO2 Mb O2 MbO2 Mb O2 K 解离常数 MbO2 MbO2 Mb Y 氧分数饱和度 pO2 pO2 K Y Hill方程 Y 1 Y log logpO2 logK 氧合曲线 K P50 双曲线 Hb O2 4 Hb 4O2 Hb O2 4 Hb O2 4 K Y pO2 n pO2 n K Y Y 1 Y log K P50 n S