基于金属纳米材料的新型传感技术研究.doc

基于金属纳米材料的新型传感技术研究 基于金属纳米材料的新型传感技术研究生物传感器具有灵敏度高、响应速度快、选择性好，一般不需要对样品进行预处理，可实现连续在线检测等优点，它的出现和发展为生命科学研究提供了一种新的手段和技术支持，极大地推动生命科学研究的发展，也日益得到了科研工作者的重视。 近年来新兴的纳米材料由于其具有独特的物理、化学性质而受到人们的广泛关注。 本研究论文将纳米金、银纳米簇等纳米材料与荧光和化学生物传感技术的优势相结合，开发和建立了一些荧光和电化学检测新方法用于多核苷酸激酶、微球菌酶、胆固醇等与生命活动紧密相关的物质的检测，与传统方法相比，本论文所建立的方法灵敏度高，选择性好，具体研究内容如下 （1）基于外切酶对磷酸化DNA的降解以及利用链霉亲和素-金纳米粒子复合物和碱性磷酸酶对电化学信号的放大作用，提出了一种检测多聚核苷酸激酶（PNK）活性的双重信号放大的电化学方法（第2章）。 当体系中存在PNK时，固定于电极表面的PNK底物探针的5末端将会被磷酸化。 当底物探针和与之完全互补的生物素化的检测探针杂交后，底物探针将会被外切酶降解，使得检测探针从电极表面解离下来，链霉亲和素-金纳米粒子和生物素化的碱性磷酸酶不能与之结合，从而引起电化学信号降低。 当PNK的浓度在0.01U/mL至5U/mL范围内时，电化学信号与PNK浓度的对数呈线性关系，其检测限为0.01U/mL。 同时，也对硫酸铵对PNK酶活性的抑制作用进行了研究。 （2）基于外切酶对磷酸化末端的特异性降解和DNA酶对底物DNA的切割及其循环作用，建立了一种检测PNK酶活性的新方法（第3章）。 当体系中存在PNK时，C-DNA的5羟基将会被磷酸化，与互补序列E-DNA杂交成双链后将被外切酶识别并降解，使得E-DNA从双链中得以释放出来，在Mg2+的共同作用下，使得DNA酶被激活，识别并切割底物信标，使得信标分子上荧光基团的荧光信号得以恢复。 同时，E-DNA将得以释放，将与新的MB分子杂交，引发下一轮的催化切割，使得体系的荧光信号得到放大。 在最佳实验条件下，检测PNK的线性范围为0.5-100U/mL，检测限为0.16U/mL。 该实验方法为PNK酶活性检测提供了一种新的方法。 （3）基于过氧化氢对银纳米簇荧光的猝灭，建立了一种新的检测胆固醇含量的荧光方法（第4章）。 首先我们在文献报道的基础上，对合成银纳米簇的DNA模板分子进行了优化，实验结果表明，当在原模板分子的3末端加上1-2个G碱基时，荧光将显著增强，其最大发射波长为605nm。 同时，我们首次发现过氧化氢的存在能显著猝灭银纳米簇的荧光。 基于此原理，我们用优化后的模板合成的银纳米簇作为荧光指示剂测定了胆固醇的含量。 当胆固醇的浓度在0.2至200M范围内时，荧光强度与胆固醇浓度的对数呈现出良好的线性关系，其线性相关系数为R=0.9943，检测限为0.15M，该方法操作简单，灵敏，并具有良好的选择性，该方法也有望用于其他的在氧化过程中能产生过氧化氢的物质的检测。 （4）基于微球菌酶（MNase）对银纳米簇模板DNA的降解，建立了一种新的高灵敏，高选择性的非标记的荧光方法用于检测MNase活性（第5章）。 实验中所用的单链DNA为MNase的底物，同时也是合成银纳米簇的模板。 当体系中存在MNase时，单链DNA将被降解，从而合成的AgNCs的量随之减少，得到降低的荧光信号。 当MNase的浓度在110-5U/mL至210-4U/mL的范围内时，AgNCs荧光强度与MNase浓度呈线性相关，检测限为810-6U/mL。 该方法在均相中进行，无需对DNA链进行标记或者修饰，无需分离，简单，灵敏，快速，选择性高，同时该方法也可用于其它酶的检测。 （5）基于聚合酶延伸和借助链霉亲和素-金纳米粒子（SA-AuNPs）复合物和碱性磷酸酶实现的两步信号放大作用，提出了一种测定microRNA(miRNA)的电化学新方法（第6章）。 目标miRNA与固定于电极表面的DNA模板杂交，在DNA聚合酶和dNTPs的存在下，miRNA作为引物将沿着DNA模板进行延伸。 在延伸的过程中，由于biotin-11-dUTP的使用，生物素基团将被引入延伸产物当中。 因此，利用SA-AuNPs的桥梁作用，生物素化的碱性磷酸酶（biotin-ALP）将与延伸产物上的生物素结合，产生电化学信号。 当目标miRNA的浓度在1pM到10nM范围内时，电化学信号与miRNA的浓度的对数呈现出良好的线性关系，其检测限为0.9pM。 该方法具有很高的选择性，当目标RNA与其他RNA只存在一个碱基的差别时，该传感装置亦能对其进行区分。 正是由于该传感器所具有的优异性能，使得该装置作为一种重要的检测RNA的方法用于生物医学研究和医疗诊断等领域。 （6）基于磁性纳米粒子良好的分离富集作用和SYBR GreenI嵌入双链DNA后荧光增强的性质，建立了一种新的测定生物素的荧光方法（第7章）。 体系中的生物素与生物素修饰的DNA竞争与磁性纳米粒子上的链霉亲和素结合。 经磁性分离后，未结合的双链DNA将被洗去，随后加入的SYBR GreenI染料将嵌入被磁性纳米粒子捕获的双链DN