G6PD的临床生化化学检测.ppt

G6PD的临床生物化学检测 中国 南宁黄崇庭2020 3 24 目录一 G6PD与G6PD缺乏症二 G6PD的发病机制三 G6PD的流行病学与遗传规律四 G6PD临床生物化学检测五 华南常见G6PD试剂盒的概况六 美康G6PD调试经验七 案例分享 一 G6PD与G6PD缺乏症 1 什么是G6PD G6PD是葡萄糖6磷酸脱氢酶的简称 是一种存在于人体红细胞内 协助葡萄糖进行新陈代谢的一种重要的酶类 在这代谢过程中会产生NADPH 还原型辅酶 的物质能以保护红细胞免受氧化物质的威胁 G6PD缺乏时 若身体接触到具氧化性的特定物质或服用了这类药物 红血球就容易被破坏而发生急性溶血反应 G6PD对于磷酸戊糖旁路至关重要 而该途径可为髓鞘脂酸形成提供NADPH 2 什么是G6PD缺乏症 G6PD缺乏症是由G6PD基因突变 导致该酶活性降低 红细胞因为缺乏NADPH而不能抵抗氧化损伤而遭受破坏 引起溶血性贫血的一种遗传病 常因食用蚕豆而发病 俗称 蚕豆病 二 G6PD的发病机制 葡萄糖的代谢途径 主要是糖酵解进入三羧酸循环 产生ATP 次要途径是磷酸戊糖途经 产生NADPH和磷酸核糖 二 G6PD的发病机制 磷酸戊糖途经 磷酸戊糖途经 G6PD G6P6 磷酸葡萄糖酸内脂 NADPH G6PD 谷胱甘肽还原型 氧化性物质谷胱甘肽氧化型 NADPH 在红细胞内 谷胱甘肽还原型可以抵抗氧化性的物质 在维持红细胞的细胞膜稳定方面起到重要作用 如果G6PD缺乏导致NADPH不足 谷胱甘肽的作用降低 从而使红细胞模受损 在一定条件下容易产生红细溶血 引起一些不良症状 三 G6PD的流行病学与遗传规律 1 G6PD流行病学据估计 全球约有4亿人受累 我国华南及西南各省较常见 主要分布在热带和亚热带 我国的南方地区是高发区 尤其是广西 广东 云南 福建等省 北方地区较少见 我国各地发生率报道不一 上海为0 78 长沙0 90 南昌为1 20 南宁为7 20 昆明为2 50 此病广东地区平均发病率为5 10 广州市为3 70 东莞3 20 深圳2 30 中山发生率4 20 2 G6PD的遗传规律G6PD缺乏程度与性别的关系 G6PD缺乏是伴X不完全显性遗传 基因位于X染色体上 缺失 男性只有一条X染色体 一旦这唯一的染色体缺失G6PD基因 则表现为G6PD重度缺乏 而女性有两条X染色体 如果仅有1条X染色体缺失G6PD基因 则为杂合子 表现为中度缺乏 只有两条X染色体均缺G6PD基因才表现为重度缺乏 基因突变 不同的基因突变类型 可以导致G6PD结构不一样 酶活性有差异 即使G6PD基因没有缺失 也有可能存在不同程度缺乏 四 G6PD临床生物化学检测 1 G6PD检测的临床意义 红细胞G6PD催化反应生成的NADPH是谷胱甘肽还原酶的辅酶 还原型谷胱甘肽 GSH 是保持血红蛋白稳定性及红细胞膜完整性的必要条件 红细胞G6PD缺乏者 在服用某些药物 如抗在药 酬类药 伯氨哇附中 磺胶等 及食用蚕豆后 代谢产生的氧自由基 或与氧合血红蛋白作用形成的H2O2使GSH氧化成的琉基失去GSH的保护 被氧化变性形成Heinz小体 红细胞膜失去疏基保护而功能受损 导致溶血 所以检测患者G6PD 可以对多种溶血性病进行早期诊断和早期预防 适用人群 新生儿及其父母 可以早期筛查新生儿是否缺乏G6PD 了解家庭遗传方式 婚检 分析后代可能缺乏G6PD的概率 溶血性疾病患者 鉴别和分析溶血性病类型和原因 有利于临床采取适当治疗措施和药物治疗 2 G6PD的检测方法2 1比色法 生化仪 G6PD活性校正值测定原理 红细胞G6PD催化G6P生成6 磷酸葡萄糖内脂 后者很快氧化成6 磷酸萄糖酸 6 PGA 同时NADP被还原成NADPH 在340nm处监视NADPH吸光度的升高 计算酶的活性 红细胞中还含有6 磷酸葡萄糖酸脱氢酶 6PGD 催化6 PGA脱羧 生成核酮体糖 5 磷酸 同时使辅酶NADP还原成NADPH 在本测定系统中 由6 PGA和G6P组成的底物系统 测得的酶活性 减去单独以6 PGA为底物时测得的酶活性 代表真正G 6 PD的活性 本法测定包含如下2个反应式 1 G6P NADP 6PGA NADPH H 2 6PGA NADP R 5 P NADPH H CO2 G6PD 6 PGD 血红蛋白测定氰化高铁血红蛋白测定法原理 血液在Hb转化液中溶血后 除SHb外各种Hb均可被高铁氰化钾氧化为高铁Hb再与CN 结合生成稳定的棕红色氰化高铁Hb HiCN最大波峰在540nm 最小吸收峰为504nm 特定标准条件下 毫摩尔消光系数为44L mmol 1 cm 因此 根据标本的吸光度 即可测定Hb浓度 HiCN试剂 氰化钾 KCN 高铁氰化钾无水磷酸二氢钾特别提醒 该法是测定血红蛋白的标准方法 但是试剂中含有氰化钾剧毒物 操作时必须小心 实验后的废液也要小心处理 G6PD活力计算 G6PD G6PD 6PGD 6PGD U L G 6 PD U gHb G6PD Hb意义 每克血红蛋白中G6PD的活性参考值 健康成年人 红细胞G6PD活性 己校正6 PGD 8 34 1 59U gHb红细胞活6PGD性为6 8 12 0U gHb注意一 NADPH比值法或G6PD 6GPD法 在上面基础上不采用两个指标相减 而是相除 原理是6GPD尚未报道在G6PD患者和正常人之间有差异 通过比值法筛查 一定程度上可以确认女性杂合子 也就是G6PD基因缺陷携带者 此法受到一些试剂厂家和医院青睐 G6PD活性直接测定法G6PD活性校正值测定虽然能提供G6PD活性真值和6GPD的活性 但在溶血性疾病的检查中尚未发现红细胞6PGD活性正常而掩盖G6PD活性缺乏的现象 因此 就临床使用而言 G6PD活性的的简易测定法己能满足临床 原理 G6P NADP 6PGA NADPH H 在波长340nm处监测NADPH的吸光度增高 计算G6PD活性 活性计算 G 6 PD U gHb G6PD Hb参考值 健康成年人 红细胞G6PD活性为8 18U gHb 注意 医院可以根据需要决定是否需要6PGD校正 G6PD 其他方法 2 2高铁血红蛋白还原试验 2 3免疫斑点杂交法 G6PD活性测定注意事项 1 Mg2 是G6PD的激活剂 铜离子和锌离子有轻度抑制作用 汞离子和对氯汞苯甲酸有完全抑制作用 因此日常使用中尽量避免抑制剂的污染 2 避免样本溶血 样本溶血后G6PD活性不稳定 影响其活性测定 溶血后活性降低很快 25min内需要及时测定 五 华南常见G6PD试剂盒概况 目前 市场常见的生化仪比色试剂盒分为两种方法 一是G6PD直接测定法 速率法 直接测量G6PD活性 二是NADPH比值法 测定G6PD 6PGD 有的试剂盒提供血红蛋白测定试剂 多数没有提供血红蛋白测试试剂 G6PD直接测定法的厂家有 宁波美康 北京利德曼 上海执成 长春汇力 广州科方参考值 成人1300 3600U L儿童1700 4000U LNADPH比值法的厂家有 广州科方 广州米基参考值 成人G6PD 6PGD1 0 2 3 0 95 1 05为可疑 建议复查 新生儿 脐带血 静脉血 1 1 2 5 1 05 2 05为可疑 建议复查 不同厂家试剂盒比较 1 底物方面 长春汇力说明书反应底物为G6PDNa2外 其它厂家为G6P 但是实际上两者是同一物质的不同叫法 2 样本类型 宁波美康 上海执成 北京利德曼采用压积红细胞 长春汇力 广州科方 广州米基可以采用全血 脐带血 长春汇力还可以采用末梢血 3 参考值方面 G6PD直接测定法一般为成人1300 3600U L儿童1700 4000U LNADPH比值法成人G6PD 6PGD1 0 2 3 0 95 1 05为可疑 建议复查 新生儿 脐带血 静脉血 1 1 2 5 1 05 2 05为可疑 建议复查 长春汇力与以上有所区别 具体如下 全血G6PD 638 1980U L4 2 14 5U gHb脐带血或末梢血G6PD 832 2460U L4 9 14 5U gHb血清G6PD 0 5U L北京利德曼对参考值也规定的比较细 EDTA抗凝血 1300U L以上正常 600 1300U L可疑 需要血红蛋白校正 肝素抗凝血 1100U L以上正常 500 1100U L可疑 需要血红蛋白校正 每克血红蛋白中G6PD活性 3 8U gHb4 G6PD活性校正 G6PD活性测定与血红蛋白含量和红细胞老幼有关 因此正确的做法是与血红蛋白求比值来校正 长春汇力提供血红蛋白试剂校正 其他均无此试剂 由于血红蛋白测定有剧毒试剂以及占用通道和试剂 一般都不测定 G6PD 6PGD在筛查基因突变杂合子方面比较有优势 其他厂家没有5 美康G6PD测定副波长为660nm 其他为405nm 六 美康G6PD调试经验 1 参数按照说明书 定标方式有因子法 两点定标 试剂盒自带定标液 配有两个水平质控 定标液定出K因子为230000左右 与理论因子209084偏高10 两种方法做两个水平质控