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Gene for GeneTheory 拓庆荣21014032 目录 1植物基因对基因假说2抗病基因的作用机理3不同Avr与R蛋白互作的定位4病原物无毒基因及无毒蛋白5植物抗病基因6R基因编码R蛋白的结构特点7植物抗病基因的克隆8植物抗病基因的应用 HaroldH Flor 植物与病原微生物的侵袭 两者在自然生态系统中长期并存 相互影响乃至协同进化 使得植物的抗病性与病原物的致病性之间形成一种动态平衡 1971年 Flor根据亚麻对锈菌小种特异抗性的研究提出了基因对基因假说 Gene for genetheory 1植物基因对基因假说 该学说认为 植物对某种病原物的特异抗性取决于它是否具有相应抗性基因 而同时病原物的专一致病性取决于病原物是否具有无毒基因 也就是说寄主分别含有感病基因 r 和抗病基因 R 病原物分别含有毒性基因 Vir 和无毒基因 Avr 只有当具有相应抗病基因的植物 R 与具有无毒基因 Avr 的病原物相遇时 才会激发植物的抗病反应 其他情况下二者表现亲和 即寄主感病 植物与病原菌的分子交流决定了它们互作的最终结果 病原菌效应蛋白被送入寄主植物细胞后 能否被侵染的植物组织识别 决定了植物是感病还是抗病 由专化R基因介导的抗性符合 基因对基因 的互作模式 然而 从已克隆的R基因及其产物结构和功能看 有些R基因的抗病机制并不符合 基因对基因 模式 如玉米Hm1基因和大麦mlo基因 其抗性机制与病原菌的亲和因子有关 而不需要病原菌无毒因子的激活 2R与Avr基因互作的模式 受体 配体模型是从基因对基因假说发展而来的 该模型认为 病原体的avr基因直接或间接地编码一种配体 激发子 它与抗病基因 R 编码的产物 受体 相互作用 从而触发受侵染部位细胞内的信号传递过程 激活其他防卫基因的表达 产生超敏反应 HypersensitiveResponse HR 在病原体侵染部位出现枯死斑点症状 使植物获得抗性 http www cals ncsu edu course pp315 gene 2 1符合基因对基因关系的互作模式 2 1 1受体 配体模式 Receptorligandmodel 2 1 2警戒模式 Guardmodel 模式认为植物寄主中存在着病原菌效应蛋白 Avr effector 致毒性靶标 Virulencetarget 效应蛋白与之互作来调节植物活性 以利于病原菌生长和繁殖 NB LRR类R蛋白起警戒作用 一旦监测到靶蛋白被Avr改变 即可激活R蛋白与靶蛋白互作 以避免病原菌效应蛋白对靶蛋白的操纵 或引发一系列信号传导 启动植物的防御反应 2 1 3已提出的其他相关模式 a 受体 配体模式 b 共受体模式 无毒蛋白 A 先与共受体 C 上的高亲和位点结合 R蛋白再与C之间发生相互作用启动防御反应 c 警戒模式 d 蛋白水解酶依赖型防御启动 介于一些细菌 真菌和病毒的特点 预测这些基因可能会编码蛋白质水解酶 该论点认为Avr蛋白会对寄主中的某些蛋白的水解作用的处理后寄主内的R蛋白识别并与部分水解状态的蛋白结合 引起信号传导 引发植物的防御反应 2 2非R Avr基因互作的植物抗病模式 寄主植物中存在促进亲和反应的基因 即感病基因 其编码产物是一种 亲和性因子 通过对这类基因的修饰甚至诱发隐性突变 即可赋予植物对某一种甚至多种病原菌的广谱抗性 这类基因有大麦抗白粉菌 Erysiphegraminisfsp Hordei 基因mlo 豌豆抗白粉菌 E pisi 基因er 1 番茄抗白粉病 Oidiumlycopersici 基因ol 2和拟南芥抗白粉病基因PMR等 大麦抗白粉病基因Mlo 是植物负向调控的广谱抗病基因 MLO是一种膜锚定蛋白 由533个氨基酸组成 含有7个TM 其N端位于细胞外侧 C端位于细胞内侧 含有一个核结合位点和两个酪氨酸激酶II编码区 MLO是类似于动物的G蛋白偶联受体 GPRs 是一类新型的钙调素 CaM 结合蛋白 CaM是MLO蛋白的活化因子 MLO CaM结合互作 可使细胞质Ca2 浓度瞬时急速增加 这一方面可能会激发寄主防御反应 但同时促进了亲和性互作 MLO蛋白可能是病原菌侵入植物的对接的分子 是大麦 大麦白粉菌 Bgh 发生亲和性互作所必需的因子 3不同Avr与R蛋白互作的定位 不同寄主与病原物Avr和R蛋白的互作定位 对一些细菌Avr和R蛋白的匹配性分析 揭示了普遍的空间相互依赖性 如上图 植物的R蛋白用深绿色标出 其他与植物抗性相关蛋白用浅绿色标出 细菌 真菌和预测的线虫Avr蛋白分别用红色 紫色和粉红色标出 微生物侵染结构用蓝色标出 三型分泌系统 TypeIIIsecretionsystem 是首先在革兰氏阴性菌中发现的一种针状结构蛋白质附属物 病原菌通过这一结构是将自身蛋白直接分泌到寄主细胞内 帮助细菌侵染真核生物有机体 3 1三型分泌系统 TTSS T3SS Atransmissionelectron microscopeimageofisolatedT3SSneedlecomplexesfromSalmonellatyphimurium Staskawiez等于1984年通过把含有无毒基因avrA的大豆丁香假单胞杆菌小种的Cosimd克隆结合转移到不含avrA的小种中 继之以遗传互补实验克隆了avrA基因 这是克隆的第一个无毒基因 随后 许多研究者通过类似的方法从不同的病原物中克隆了几十个无毒基因 这不仅有力地支持了基因对基因抗病性学说 而且也促进了对其本身的认识 4 1病原物无毒基因 4病原物无毒基因及无毒蛋白 虽然已有诸多的无毒基因被克隆和测序 但对其确切产物及功能有较详细了解的却仅限于AvrD Avr9 AvrBs3 AvrPto和烟草花叶病毒外壳蛋白等少数几种蛋白质 表1总结了蛋白质的某些特性 4 2病原物无毒蛋白 植物抗病基因产物可能有两个功能 识别相应的Avr衍生信号 激活下游信号传导 引发复杂的防御反应 目前已至少分离出50多个抗病基因 通过对克隆的R基因分析比较 发现多数R基因具有较高序列一致性 来源不同的R基因往往存在一些共同的结构基序 motifs 如富亮氨酸重复序列 leucinerichrepeat LRR 核苷酸结合位点 nucleotidebindingsite NB 亮氨酸拉链 leucinezipper LZ 跨膜结构域 transmembranedomain 丝氨酸 苏氨酸激酶 Ser Thrkinase STK 以及果蝇Toll蛋白细胞介素 1受体 Tollandinterleukin 1receptor TIR 等 依据基因结构特点和可能的功能 将克隆的R基因划分9个类型 如下表所示 5植物抗病基因 截至2004年底 已经有近50个抗病基因被克隆 尽管这些抗病基因所抗的病原物种类不同 有真菌 细菌 病毒等 但这些抗病基因所编码的产物中却存在着惊人的类似结构域 即不同抗病基因具有一定的同源性 根据抗病基因保守结构域的不同 抗病基因编码的蛋白 抗病蛋白 R蛋白 可分为5大类 6R基因编码R蛋白的结构特点 6 1核苷酸结合位点 Nucleotidebindingsite NBS 高度保守的抗病基因产物中的NBS结构域表明核苷i磷酸是这些蛋白发挥功能所必需的 抗病蛋白的NBS区有3个特征保守区 第1区域为磷酸结合环 P loop 又称激酶la Kinasela 其共有序列为GM GPP GNGKTT aPT 第2区域为激酶2 共有序列为X XPR XaaaaDDV WPD 第3区域为激酶3a 其保守区为SraaaT TPS R NBS结构域在植物抗病中的作用机制还不十分清楚 未来的研究将集中在核苷三磷酸的合成与水解过程以及这些过程对植物抗病蛋白活性的作用等方面 核苷三磷酸的结合可能改变抗病蛋白与其防御信号之问的相互作用 6 2富含亮氨酸区域 Leucinerichrepeats LRR LRR存在于多种不同的蛋白中 与蛋白质之问的相互作用及信号传导密切相关 在功能方面 LRR决定着与配体结合的专一性 即决定着寄主与病原的特异性识别 1996年 Dixon等提出了LRR促进抗病蛋白与其他参与抗病信号传导的蛋白之间的结合等模 抗病蛋白所含的LRR结构可大至分为2类 定位于胞外的LRR 定位于胞质的LRR 胞外LRR的共有序列为 LXLXXLXXLXLXXNXLXGXIPXX 而胞质LRR的共有序列为 aXXXXXLXXLXLXX XPC XXXXXaXXX 可以看出所有LRR都具有 XLXXLXLXX 结构 6 3丝氨酸P苏氨酸蛋白质激酶 SPTproteinkinase SPT蛋白质激酶是植物的受体类蛋白激酶 Receptor like kinase RLX 的主要形式 其功能主要有以下几点 是与一些信号分子如激酶 生长因子 性因子等相互作用的传导信号 参与防御反应 如B细胞中的抗体和T细胞中的受体通过识别外来分子启动下游激酶产生一系列级联反应 最终产生免疫作用 在细胞分裂过程中控制分裂时期 对一些自然逆境如缺乏关键元素产生反应 SPT蛋白激酶的2个特征保守区分别为DaKXXN和GTaGYXAPCNPE 6 6 4亮氨酸拉链 Leucinezipper LZ LZ存在于一些寡聚蛋白中 许多DNA结合蛋白就含有LZ LZ在真核生物转录因子的同源及异源二聚体形成中起着重要作用 相似的卷曲螺旋结构域 Coiled coildomains 促进了蛋白之间的相互作用 并导致许多其他功能的产生 但它们在抗病蛋白功能发挥中所起的作用目前还知之甚少 6 5白细胞介素 1受体相似的区域 TIR 果蝇的Toll蛋白及哺乳动物的白介素 1受体 在各自的免疫系统信号传导中起重要作用 通过对病原物的结合 将信号传导给传导因子 如果蝇的Dif因子和哺乳动物的NF KB因子 这些传导因子获得由细胞质向细胞核内运输的能力 并与各免疫反应基因的启动子相结合 引起免疫反应基因的表达 从而对病原物产生抗性 越来越多的证据表明 植物中可能也存在与哺乳动物和昆虫自然免疫系统相似的抗病途径 世界上第一个被克隆的抗病基因是玉米抗圆斑病菌基因 Hml Hml位于玉米第l染色体的长臂上 编码1个依赖NADPH的HC2毒素还原酶 HCTR 能使病原菌产生的致病因子HC 毒素丧失活性 植物抗病基因的克隆方法有以下几种 7植物抗病基因的克隆 7 1转座子标签法 Transposontagging 其基本原理是利用转座子或t DNA插入到抗病基因的内部或邻近位点 获得抗病功能丧失的突变体 然后利用插入的片段 转座子或t DNA 作探针 通过Southern杂交或PCR技术从基因组文库中分离克隆抗病基因 转座子标签法运用的前提条件是被操作的植物有现成的遗传转化操作系统或有成熟的根癌农杆菌转化系统以及有效的大规模突变体筛选的方法和手段 7 2图位克隆法 Map basedcloning 在目标基因精确定位到染色体的特定位置以后 运用与目标基因紧密连锁的分子标记筛选含有目标基因的大片段基因组文库BAC 细菌人工染色体载体 或YAC 酵母人工染色体 再通过染色体步移筛选到含有目标基因的亚克隆 最后通过遗传转化和功能互补试验进行验证 利用该法克隆的抗病基因主要有番茄Pto基因 拟南芥RPS2基因 RPMI基因和NPRI基因以及水稻Xa21基因和Pi b基因等 图位克隆法以高密度的分子标记图谱为基础 其关键是寻找与目标基因紧密连锁的分子标记 核心任务是染色体步行 但是对于基因组较大 重复序列较多的一些植物 采用该方法分离克隆抗病基因不仅投资大而且效率低 因此 该方法也受到一定的限制 7 3根据抗病基因同源序列 RGA 克隆 定位抗病基因 前面已经提到抗病基因所编码的蛋白 R蛋白 间存在着类似结构域 而编码这些类似结构的抗病基因序列也一定有着同源性 抗病基因同源序列标记就是从这些同源序列出发来定位 克隆抗病基因的一种新的方法 具体方法是根据抗病基因中编码蛋白质功能保守区序列设计特异或简并引物 扩增基因组DNA从而获得RGA 这些RGA可以作为一种基于特异或简并引物多聚酶链式反应的DNA标记m1 自V Kanazin和YuG Yong于1996年在Sci连续2篇关于用抗病蛋白的保守序列为引物来扩增RGA的文章发表以来 现已在大豆 豌豆 蚕豆 水稻和大麦 油菜 甜瓜 紫花苜蓿 小麦 番茄 辣椒 莴苣和葡萄等多种植物上扩增出RGA 8 1植物信号转导研究 植物R因的克隆及其保守功能区的确定 以及由此而来对R基因介导的抗病防卫反应途径的研究 为植物信号转导的阐明建立了一条很有希望的道路 R基因主要是起识别作用 其产物直接或间接地与来自病原无毒基因的产物进行识别互作 然后通过信号转导启动植物防卫反应途径 表达出功能性产物造成抗病反应 通过对多个无毒基因 抗病基因的克隆及其相互作用的研究 为此过程的正确性提供了证据 8植物抗病基因的应用 8 2通过转化已克隆的R基因获得新的抗病品种 用克隆的R基因去转化敏感植株能很快地产生新的抗性系 利用转基因技术可允许R基因在种问转移 这对于还没有鉴定出有效抗病基因的作物很有意义 现已在烟草中成功地转入Pro基因 但R基因发挥作用还要与防卫机制的其他成分相配合 因此这种种问转移并不能总获得理想结果 8 3创造新的具广谱抗病性R基因 通过对已克隆R基因的结构分析发现 R基因的功能与结构是相一致的 且不同的R基因间存在很好的保守性 因此 在实验室中创造出新一的可增强抗病性的R基因也成为可能 用马铃薯X病毒表达系统将组装的Pto导入细胞后发现该Pto同类物可控制细胞对Fen的敏感性等 7 从植物抗病性是相对保守的R蛋白与易变的Avr蛋白相互识别 相互作用的结果 在野生的植物居群中 抗病基因座一般是复合的 通常存在着抗病基因簇 而且通过基因座内发生重复和重组 转座及病原菌识别区适应性选择等途径使基因家族成员的抗性得以演变和进化 在这种包含多种R基因的混合群体中 既使病原菌Avr突变产生新毒性小种 其适应性很难快速提高 由于人为因素 农作物栽培品种的植物抗病基因过于简化 虽然向农作物引入R基因可赋予其对当前流行的病害产生抗性 可一旦Avr基因突变 这种R基因介导的抗性很快就会丧失 而具有这种R基因的品种就成为毒性小种的哺育品种 因此 在植物育种上 要全面开发新抗源 在同一品种中应尽可能多地聚积不同类型R基因 而在农作物生产上 一定要保证多样性抗源 且具有不同R基因的品种要合理布局 以R基因的遗传多样性来抑制新毒性小种的产生和蔓延 8 4从互作的角度看待R基因的应用 越来越多的实验证据表明 植物抗病原细菌和真菌的R基因 绝大多数R蛋白只是 抗病复合体 的一部分 其主要功能是监控寄主的少数关键蛋白 如病原菌效应蛋白致毒性靶蛋白 结构及其活性的改变 启动植物防御反应 如果确实如此 那么R基因介导的抗性存在上位性作用 由此我们必需思考这样一个问题