《食品分析蛋白测定》PPT课件.ppt

食品分析FoodAnalysis 食品学院丛健Tel 61900381Email Jcong 第四章食品的一般成分分析 水分的测定灰分的测定脂类的测定碳水化合物的测定蛋白质和氨基酸的测定维生素的测定酸性物质的测定 第五节蛋白质和氨基酸的测定 蛋白质是含氮的有机化合物 分子量很大 主要由C H O N S五种元素组成 某些蛋白质中还含有微量的P Cu Fe I等 在食品和生物材料中常包括蛋白质 可能还包括有非蛋白质含氮的化合物 如核酸 含氮碳水化合物 生物碱等 含氮类脂 卟啉和含氮的色素 蛋白质和氨基酸的测定 蛋白质是生命的物质基础 人体11 13 总热量来自蛋白质 无论动物 植物都含有蛋白质 只是含量及类型不同 蛋白质是食品的最重要质量指标 其含量与分解产物直接影响食品的色 香 味 一般说来 动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品 例如牛肉20 0 猪肉9 5 兔肉21 鸡肉20 牛乳3 5 带鱼18 0 大豆40 面粉9 9 菠菜2 4 黄瓜1 0 苹果1 4 蛋白质的测定 蛋白质的测定方法分三大类 一类是利用蛋白质的共性即含氮量 肽键和折射率等测定蛋白质含量 另一类是利用蛋白质中的氨基酸残基 酸性和碱性基因以及芳香基团等测定蛋白质含量还有一类是使用色谱和质谱 通过色谱的分离 和质谱的质量分析进行测定 食品和其原料中蛋白质含量的测定 主要 也是最常用的 用凯氏定氮法测定总氮量 然后乘一个蛋白质换算系数 这里也包括非蛋白的氮 所以只能称为粗蛋白的含量 但马铃薯等非蛋白氮多的要单测 具体测定方法 凯氏定氮法 最常用的 国内外应用普遍 双缩脲反应 染料结合反应 酚试剂法红外分析仪 紫外分光光度法液相色谱和飞行时间质谱 蛋白质的定量测定 一般情况下 蛋白质的含氮量一般为15 17 6 有的上下浮动 据此 可以测出总氮N 从而推算样品中蛋白质含量 此数值 6 25 称为蛋白质系数 用F表示 不同种类食品的蛋白质系数有所不同 如玉米 荞麦 青豆 鸡蛋等为6 25 花生为5 46 大米为5 95 大豆及其制品为5 71 小麦粉为5 70 牛乳及其制品为6 38 凯氏定氮法 由Kieldhl于1833年提出 现发展为常量 微量 自动定氮仪法 半微量法及改良凯氏法 是通过测出样品中的总含氮量再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质的含量 此法的结果称为粗蛋白质含量 由于样品中含有少量非蛋白质含氮化合物 如核酸 生物碱 含氮类脂 卟啉以及含氮色素等非蛋白质的含氮化合物 凯氏定氮法是测定总有机氮量较为准确 操作较为简单的方法之一 可用于所有动 植物食品的分析及各种加工食品的分析 可同时测定多个样品 故国内外应用较为普遍 是个经典分析方法 至今仍被作为标准检验方法 三聚氰胺事件 2007 3 美国食品药品监督管理局 FDA 在中国出口的宠物食品原料小麦蛋白粉中查出三聚氰胺 C3N3H6 被怀疑是宠物中毒死亡的元凶 之后 中国政府开始严打三聚氰胺 蛋白精 饲料级蛋白精是以工业氮和异丁醛为原料在酸催化剂的情况下 经缩合反应而生成的 异丁叉二氮英文名 isobutyildenediurea 或尿素糊化淀粉 其蛋白高达100 常量凯氏定氮法原理 样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化 使蛋白质分解 其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出 而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵 然后加碱蒸馏 使氨蒸出 用H3BO3吸收后再以标准HCl溶液滴定 根据标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量 也可以用过量的标准H2SO4或标准HCl溶液吸收后再以标准NaOH滴定过量的酸 常量凯氏定氮装置 样品消化 2NH2 CH2 2 COOH 13H2SO4 NH4 2SO4 6CO2 12SO2 16H2O浓硫酸的作用 脱水作用 使有机物脱水并碳化为C H N氧化作用 将有机物炭化后的碳氧化为二氧化碳 硫酸则被还原成二氧化硫2H2SO4 C 2SO2 2H2O CO2二氧化硫使氮还原为氨 本身则被氧化为三氧化硫 氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中 加入硫酸钾的作用 提高溶液沸点而加快有机物的分解 3400C 4000C K2SO4 H2SO4 2KHSO42KHSO4 K2SO4 H2O SO3但硫酸钾加入量不能太大 否则消化体系温度过高 又会引起已生成的铵盐发生热分解而造成损失 NH4 2SO4 NH3 NH4 HSO42 NH4 HSO4 2NH3 2SO3 2H2O除硫酸钾外也可加入硫酸钠 氯化钾等盐类来提高沸点 但效果不如硫酸钾 加入硫酸铜的作用催化作用 加速有机物的氧化分解C 2CuSO4 Cu2SO4 SO2 CO2 Cu2SO4 2H2SO4 2CuSO4 2H2O SO2 此反应不断进行 待有机物被消化完后 不再有硫酸亚铜 褐色 生成 溶液呈现清澈的蓝绿色 消化完全指示 蓝绿色 蒸馏时碱性反应完全指示 变深蓝色或产生黑色沉淀 蒸馏在消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使呈碱性 加热蒸馏 即可释放出氨气 NH4 2SO4 2NaOH 2NH3 Na2SO4 2H2O 吸收用硼酸溶液 并加入混合指示剂 硼酸呈微弱酸性 Ka1 5 8 10 10 与氨形成强碱弱酸盐 酒红色 蓝绿色2NH3 4H3BO3 NH4 2B4O7 5H2O 滴定待吸收完全后 再用盐酸标准溶液滴定 蓝绿色 灰红色 NH4 2B4O7 2HCl 5H2O 2NH4Cl 4H3BO3 适用范围 此法可应用于各类食品中蛋白质含量测定仪器 试剂 500mL凯氏烧瓶 凯氏定氮装置消化用 浓硫酸 硫酸钾 硫酸铜蒸馏用 40 氢氧化钠溶液吸收用 4 硼酸滴定用 HCl标准溶液 0 1 甲基红乙醇溶液与0 1 溴甲酚绿乙醇溶液混合指示剂 计算 式中 W 蛋白质的质量分数 c 盐酸标准溶液的浓度 mol L V1 空白滴定消耗标准液量 mL V2 试剂滴定消耗标准液量 mL m 样品质量 g 0 014 氮的毫摩尔质量 g mmol F 蛋白质系数 微量凯氏定氮装置 微量凯氏定氮装置 微量凯氏定氮法操作步骤样品消化 蒸馏 吸收 滴定 样品消化 步骤 准确称取一定量的样品 加入硫酸铜0 5g 硫酸钾10g和浓硫酸20mL 玻璃珠数粒 小心移入干燥洁净的500mL凯氏烧瓶中 固体或粉末用纸卷成纸筒送入 轻轻摇匀 以45 斜支于有小孔的石棉网上 用电炉以小火加热 或先烧瓶放在距电炉较远处 待内容物全部炭化 泡沫停止产生后 加大火力 或将烧瓶放在电炉上 保持瓶内液体微沸 至液体变蓝绿色透明后 继续加热微沸30min 关闭电炉 取下烧瓶 冷却 转移至100mL容量瓶中 加水定容 蒸馏与吸收 按图安装好微量定氮蒸馏装置 于水蒸气发生瓶内装水至2 3容积处 加甲基橙指示剂数滴及硫酸数毫升 以保持水呈酸性 加入数粒玻璃珠 在接受瓶中加入10mL40g L硼酸及2滴混合指示剂 将冷凝管下端插入液面以下 准确吸取消化液10mL于反应管内 经漏斗再加入10mL氢氧化钠溶液 用少量蒸馏水冲洗漏斗 夹好漏斗夹并水封 加热煮沸水蒸气发生瓶内的水进行蒸馏 指示剂变绿色后继续蒸馏10min 将冷凝管尖端提离液面继续蒸1min 滴定将接受瓶内的硼酸液用0 01mol L盐酸标准溶液滴定至终点 同时做一试剂空白 除不加样品 从消化开始操作完全相同 注意问题 加入样品不要沾附在凯氏烧瓶瓶颈 消化开始时不要用强火 要控制好热源 并注意不时转动凯氏烧瓶 以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下并促进其消化完全 样品中若含脂肪或糖较多 在消化前应加入少量辛醇或液体石蜡或硅油作消泡剂 以防消化过程中产生大量泡沫 消化完全后要冷至室温才能稀释或定容 所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制 蒸馏 吸收注意问题 1 整套装置不能漏气 要注意各蒸汽控制夹子的操作 以防蒸汽受阻爆炸或吸收液倒吸 2 在蒸汽发生瓶中要加入硫酸和甲基橙使呈酸性以防氨蒸出 3 加碱量要足 应使消化液呈深蓝色或产生黑色沉淀 操作要迅速 漏斗要采用水封防氨逸出 4 冷凝管下端先插入硼酸吸收液液面以下才能蒸馏 吸收液温度不应超过40 若超过时可置于冷水浴中使用 蒸馏完毕后 应先将 冷凝管下端提离液面 再蒸1分钟 将附着在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶内 再将吸收瓶移开 最后关闭电源 绝不能先关闭电源 否则吸收液将发生倒吸 5 在每次测定前及两次测定之间 均要洗涤反应管 倒吸法 在吸收瓶中加入蒸馏水 其余同测定时的做法 在蒸汽发生器中水剧烈沸腾后 立即移开电炉 水即从吸收瓶中倒吸入反应管 再倒吸入汽水分离管或蒸汽发生器中 打开夹子 即可放出废水 6 混合指示剂在碱性溶液中呈绿色 在中性溶液中呈灰色 在酸性溶液中呈红色 4 结果计算式中 W 蛋白质的质量分数 c 盐酸标准溶液的浓度 mol L V1 空白滴定消耗标准液量 mL V2 试剂滴定消耗标准液量 mL m 样品质量 g 0 014 氮的毫摩尔质量 g mmol F 蛋白质系数 分光光度法测定蛋白质含量 原理 试样与硫酸和催化剂一同加热消化 使蛋白质分解 分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵 然后在pH 4 8的乙酸 乙酸钠缓冲溶液中 铵与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的化合物 在波长400nm处测定吸光度 与标准系列比较定量 结果乘以蛋白质系数 即为蛋白质含量 分光光度法测定蛋白质含量 氨氮标准溶液 1 0g L 精密称取经105 干燥的硫酸铵0 4720g 用水溶解并定容至100mL 临用时用水稀释至0 1g L 双缩脲法 双缩脲的性质 当脲被小心地加热至150 160 时 可由两个分子间脱去一个氨分子而生成双缩脲 其与碱及少量硫酸铜溶液作用生成紫红色的配合物 此反应称为双缩脲反应 蛋白质含有两个以上的肽键 与双缩脲中肽键相似 因此有双缩脲反应 在一定条件下其颜色深浅与蛋白质含量成正比 用吸收光度法来测定蛋白质含量 最大吸收波长为560nm 双缩脲反应 碱性环境 多肽及蛋白质分子结构中均含有许多肽键 其结构与双缩脲分子中的亚酰胺键相同 因此 在碱性条件下与铜离子也能呈现出类似于双缩脲的呈色反应 其反应过程如下 氨基酸的测定 双指示剂甲醛滴定法电位滴定法茚三酮显色法氨基酸的分离及测定 氨基酸的测定 蛋白质可以被酶 酸或碱水解 其水解的最终产物为氨基酸 氨基酸是构成蛋白质的最基本物质 构成蛋白质的氨基酸主要是其中的20种 它们对人体有着极其重要的生理功能 常会因其在体内缺乏而导致患病或通过补充而增强了新陈代谢作用 氨基酸的测定 随着食品科学的发展和营养知识的普及 食物蛋白质中必需氨基酸含量的高低及氨基酸的构成 愈来愈得到人们的重视 为提高蛋白质的生理效价而进行食品氨基酸互补和强化的理论 对食品加工工艺的改革 对保健食品的开发及合理配膳等工作都具有积极的指导作用 因此 食品及其原料中氨基酸的分离 鉴定和定量也就具有极其重要的意义 氨基酸的测定 氨基酸的含量一直是某些发酵产品如调味品的质量指标 也是目前许多保健食品的质量指标之一 其中的含氮量可直接测定 不同于蛋白质的氮 故称为氨基酸态氮 氨基酸态氮反映的是样品中游离氨基酸的总量 氨基酸态氮的测定 双指示剂甲醛滴定法 电位滴定法 双指示剂甲醛滴定法 原理氨基酸具有酸性的 COOH基和碱性的 NH2基 它们相互作用而使氨基酸成为中性的内盐 当加入甲醛溶液时 NH2基与甲醛结合 从而使其碱性消失 这样就可以用强碱标准溶液来滴定 COOH基 并用间接的方法测定氨基酸的总量 方法特点及应用 此法简单易行 快速方便 在发酵工业中常用此法测定发酵液中氨基酸含量的变化 以了解可被微生物利用的氮源的量及利用情况 并以此作为控制发酵生产的指标之一 脯氨酸与甲醛作用时产生不稳定的化合物 使结果偏高 酪氨酸含有羟基 滴定时会消耗碱液使结果偏高 溶液中若有铵存在也可与甲醛反应 往往使结果高 特别适合浅色样品的测定 试剂 40 中性甲醛溶液 以百里酚酞作指示剂 用氢氧化钠将40 甲醛中和至淡蓝色 0 1 百里酚酞乙醇溶液 0 1 中性红50 乙醇溶液 0 1 mol L氢氧化钠标准溶液 操作方法 预处理 移取含氨基酸约20 30mg的样品溶液2份 中和游离酸 用中性红作指示剂 先测定其它游离酸的含量 其中1份加入3滴中性红指示剂 用0 1mol L氢氧化钠标准溶液滴定至由红变为琥珀色为终点 记录V1 滴定氨态氮 用百里酚酞作指示剂测定氨基酸和游离酸的总含量 另1份加入3滴百里酚酞指示剂及中性甲醛20ml 摇匀 静置1分钟 用0 1mol L氢氧化钠标准溶液滴定至淡蓝色为终点 记录V2 计算 式中 c 氢氧化钠标准溶液的浓度 mol L V1 用中性红作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液的体积 mL V2 用百里酚酞作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液的体积 mL m 测定用样品溶液相当于样品的质量 g0 014 氮的毫摩尔质量 g mmol 注意事项 此法适用于测定食品中游离的氨基酸 固体样品应先进行粉碎 准确称取后用水萃取 萃取可在50 水浴中进行0 5h即可 液体样品可直接进行测定 若样品颜色较深 可加适量活性炭脱色后再测定 或用电位滴定法进行测定 与本法类似的还有单指示剂 百里酚酞 甲醛滴定法 此法用标准碱完全中和 COOH时的pH为8 5 9 5 但分析结果稍偏低 即双指示剂法的结果更准确 电位滴定法 原理根据氨基酸的两性作用 加入甲醛以固定氨基的碱性 使羧基显示出酸性 将酸度计的玻璃电极及甘汞电极同时插入被测液中构成电池 用氢氧化钠标准溶液滴定 依据酸度计指示的pH值判断和控制滴定终点 仪器 酸度计 磁力搅拌器 碱式滴定管 刻度吸管试剂酚酞乙醇指示液 1 甲醛 36 38 氢氧化钠标准溶液 0 05mol L 标定 操作 吸取含氨基酸约20mg的样品溶液 置于100mL容量瓶中 加水至刻度 混匀后吸取20 0mL烧杯中 加60mL水 开动磁力搅拌器 用0 05mol L氢氧化钠标准溶液滴定至酸度计指示pH8 2 记下消耗0 05mol L氢氧化钠标准溶液的毫升数V 可计算总酸含量 加入10mL甲醛溶液 混匀 再用0 05mol L氢氧化钠标准的溶液继续滴定至pH9 2 记下消耗0 05mol L氢氧化钠标准溶液的毫升数V1 同时取80mL水 先用0 05mol L氢氧化钠溶液调节至pH为8 2 再加入10 0mL甲醛溶液 用0 05mol L氢氧化钠标准溶液滴定至pH9 2 做试剂空白试验 记下消耗0 05mol L氢氧化钠标准溶液的毫升数V2 第一次滴定是除去其它游离酸 所消耗的NaOH溶液体积不用于计算氨基酸态氮 但可计算总酸含量 第二步滴定才是测定氨基酸 用消耗的NaOH溶液体积进行计算 在测定过程中为什么要加入中性甲醛的作用是什么 计算 式中 W 氨基酸态氮质量浓度 c 氢氧化钠浓度 mol L V1 加入甲醛后耗NaOH的量 ml V2 空白试验加甲醛后耗NaOH量 ml 0 014 氮的毫摩尔质量 g mol m 样品量 g 说明 本法准确快速 可用于各类样品游离氨基酸含量测定 对于混浊和色深样液可不经处理而直接测定 结果要求精密度 10 即在重复条件下两次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的10 茚三酮显色法 原理 氨基酸在碱性溶液中与茚三酮作用 生成蓝紫色化合物 除脯氨酸外均有此反应 该化合物的颜色深浅与氨基酸的含量成正比 在570nm处测吸光度 用氨基酸标准溶液绘制标准曲线 样品溶液需澄清 通常采用活性炭脱色处理 氨基酸的分离与测定一 薄层色谱法 薄层层析法 TLC法 ThinLayerChromatography简介 近年来发展起来的一种微量而快速的层析方法 它把吸附剂或支持剂均匀的铺在玻璃板上成一薄层 把样品点在薄层上 然后用合适的溶剂展开 从而达到分离 鉴定和定量的目的 因为层析在薄层上进行 所以称为薄层层析 它的应用范围比纸上层析更广泛 常用来分析氨基酸 农药残留量 黄曲霉毒素等 一 原理 取一定量经水解的样品溶液 滴在制好的薄层板上 在溶剂系统中进行双向上行法展开 样品各组分在薄层板上经过多次的被吸附 解吸 交换等作用 同一物质具有相同的Rf值 不同成分则有不同的Rf值 因而各种混合物可达到彼此被分离的目的 然后用茚三酮显色 与标准氨基酸进行对比 鉴别各种氨基酸种类 从显色斑点颜色的深浅可以大致确定其含量 Rf a b a b 样点 溶剂前沿 点样原点 优点 展开时间短 一般在20 30分钟 展开距离通常只需10cm 且分离效果好 层析后得到的斑点小而清晰 能够使用多种显色剂 点样量少 灵敏度高 比纸层析高10 100倍 精确到0 01ug 也可用于大量分离 500mg 作为样品制备层析 缺点 Rf值重现性比纸上层析差 分类 按层析的原理可分为 吸附 分配 离子交换 凝胶等 三 操作方法 薄层板制备 样品液制备 点样 距薄板底端2cm处 用针画一标记作为原点 再以点样距扳子宽窄可点几个点同时展开 点与点之间间隔1 2cm a 可用毛细玻璃管 微量吸管或微量注射器 注意要等一个点干了再点另一个点 b 用一小直径 3mm滤纸片 浸入样液 埋到板子上先挖好一个小洞穴 展开 点样完了 放入密闭容器中 展开槽 倾斜一定角度10 30 下端浸入展开剂1cm 千万别让溶剂浸过了样点 到离顶端一部分 取出样板 晾干 显色 a 展开剂的有关情况 主要是低沸点的2 3种有机溶剂组成的溶剂系统 分离效果主要决定于展开剂的选择 因为吸附剂在一定情况下是恒定的 吸附剂的选择余地远远小于展开剂的选择 b 展开剂的选择方法 微量圆环法 用小载波片试验 微量展开剂展开5cm 图解法 样品极性小 选吸附剂活性高 展开剂极性低的 样品极性大 选吸附剂活性低 展开剂极性高 有机溶剂极性由小到大为 石油醚 环己烷 四氯化碳 三氯乙烷 甲苯 苯 二氯甲烷 氯仿 乙醚 乙酸乙酯 丙酮 正丙醇 乙醇 甲醇 水 吡啶 有机酸类等 c 展开的方式 上行法 下行法 双向展开 单向多次展开 双向多次展开 双向展开 显色 a 喷适当的溶液 使斑点显色 即喷雾显色 b 喷有荧光反应的物质 在紫外光下观察斑点 c 将涂有荧光指示剂的薄层板放在紫外灯下观察 涂板时把荧光指示剂加入到固体吸附剂中 定性 在同一块板上 同等条件下操作 被测样与标准样同时展开 显色 同Rf值即是 查手册找相同的Rf值 定量 a 目视定量法 以标准斑点对照 相当于样品斑点中含量ug数 b 斑点面积定量法 c 将样点取下来 定容 离心 比色 d 利用薄层色谱扫描仪 例 日本岛津CS 910型双波长薄层色谱扫描仪 介绍离心薄层色谱仪 1 LBG 1型离心薄层色谱仪北京产2 7924型离心薄层色谱仪美国Harrison公司研制3 CLC 5型离心制备液体色谱仪 日本日立公司 带紫外检测器 记录器和自动收集器 制备量可达10g 二 氨基酸自动分析仪法三 气相色谱法四 高效液相色谱法 氨基酸自动分析仪 10 3 食品中挥发性盐基氮的测定 挥发性盐基氮是指动物性食品由于酶和细菌的作用 在腐败过程中 是蛋白质分解而产生氨以及胺类等碱性含氮物质 如伯胺 仲胺及叔胺等 挥发性盐基氮属于蛋白质分解产物 这些分解产物的含量与动物性食品的新鲜程度有明显的对应关系 故此指标可用于评价动物性食品的新鲜度 此类物质具有挥发性 在碱性溶液中蒸出后 用标准酸溶液滴定计算含量 挥发性盐基氮的测定 半微量定氮法 微量扩散法 蛋白质分解后产生的碱性含氮物质 在氧化镁碱性条件下蒸馏以氨的形式释效 再用酸滴定以定量 所得结果为挥发性盐基氮 半微量定氮法测挥发性盐基氮 将样品除去脂肪 骨及腱后 切碎搅匀 称取10g 置于锥形瓶中 加100mL水 不时振摇 浸渍30min后过滤 滤液置冰箱备用 预先将盛有10mL吸收液并加有5 6滴混合指示液的锥形瓶置于冷凝管下端 并使其下端插人锥形瓶内吸收液的液面下 吸取5 0mL上述样品滤液于蒸馏器反应室内 加5mL1 氧化镁混悬液 迅速盖塞 并加水以防漏气 通入蒸气 待蒸气充满蒸馏器内时即关闭蒸气出口管 由冷凝管出现第一滴冷凝水开始计时 蒸馏5min即停止 吸收液用0 01mol L盐酸标准溶液滴定 终点至蓝紫色 同时做试剂空白试验 微量扩散法测挥发性盐基氮 微量扩散法测挥发性盐基氮 第六节维生素的测定 维生素是维持人体正常生命活动所必需的一类天然有机化合物 其种类很多 目前已确认的有30余种 其中被认为对维持人体健康和促进发育至关重要的有20余种 这些维生素结构复杂 理化性质及生理功能各异 有的属于醇类 有的属于胺类 有的属于酯类 还有的属于酚或醌类化台物 维生素都具有以下共同特点 这些化合物或其前体化合物都在天然食物中存在 它们不能供给机体热能 也不是构成组织的基本原料 主要功用是通过作为辅酶的成份调节代谢过程 需要量极小 它们一般在体内不能合成 或合成量不能满足生理需要 必须经常从食物中摄取 长期缺乏任何一种维生素都会导致相应的疾病 我们在评价食品的营养价值 开发利用高含量维生素的食品资源 指导人们合理调整膳食结构 指导制定加工工艺或贮存条件 最大限量地保留各种维生素 还要控制强化食品中加入量 防中毒 都离不开分析检测工作 维生素分类 脂溶性 A D E K 水溶性两类 B族 C 脂溶性V的测定 VA VD VE 与类脂物一起存于食物中 摄食时可吸收 可在体内积贮 脂溶性维生素具有以下理化性质 1 溶解性 脂溶性维生素不溶于水 易溶于脂肪 乙醇 丙酮 氯仿 乙醚 苯等有机溶剂 2 耐酸碱性 维生素A D对酸不稳定 对碱稳定 维生素E对碱不稳定 但在抗氧化剂存在下或惰性气体保护下 也能经受碱的煮沸 3 耐热性 耐氧化性 耐热性氧化性VA好 能经受煮沸易被氧化 光 热促进其氧化 VD好 能经受煮沸不易被氧化VE好 能经受煮沸在空气中能慢慢被化 光 热 碱促进其氧化 根据上述性质 测定脂溶性维生素时 通常 皂化样品水洗去除类脂物有机溶剂提取脂溶性维生素 不皂化物 浓缩溶于适当的溶剂测定 在皂化和浓缩时 为防止维生素的氧化分解 常加入抗氧化剂 如焦性没食子酸 维生素C等 对于A D E共存的样品 或杂质含量高的样品 在皂化提取后 还需进行层析分离 国际单位 IU InternationalUnit 1IU 0 3 gVA 0 025 gVD 0 6 g 胡萝卜素 3 gVB1 维生素A的测定维生素A存在于动物性脂肪中 主要来源于肝脏 鱼干油 蛋类 乳类等动物性食品中 植物性食品中不合VA 但在深色果蔬中含有胡萝卜素 它在人体内可转变为VA 故称为VA原 高效液相色谱法测定食物中VA VC GB T5009 82 2003中第一法 高效液相色谱法测定维生素A是近几年发展起来的方法 此法能快速分离和测定视黄醇和它的同分异构体 酯及其衍生物 这里介绍的是同时测定维生素A和维生素E的方法 试剂 重蒸水 蒸馏水中加少量高锰酸钾 临用前再蒸馏一次 比色法测定VA的含量 GB T5009 82 2003中第二法 原理在氯仿溶液中 VA与三氯化锑可生成蓝色可溶性络合物 在620nm波长处有最大吸收峰 其吸光度与VA的含量在一定的范围内成正比 故可比色测定 适用范围及特点本法适用于维生素A含量较高的各种样品 高于5 10 g g 对低含量样品 因受其他脂溶性物质的干扰 不易比色测定 该法的主要缺点是生成的蓝色络合物的稳定性差 比色测定必须在6秒钟内完成 否则蓝色会迅速消退 将造成极大误差 注意 1 维生素A见光易分解 整个实验应在暗处进行 防止阳光照射 或采用棕色玻璃避光 2 三氯化锑腐蚀性强 不能沾在手上 三氯化锑遇水生成白色沉淀 因此用过的仪器要先用稀盐酸浸泡后再清洗 胡萝卜素的测定 GB T5009 83 2003 第一方法是HPLC 第二方法为纸层析法 胡萝卜素是一种广泛存在于有色蔬菜和水果中的天然色素 有多种异构体和衍生物 总称为类胡萝卜素 其中在分子结构中含有 紫罗宁残基的类胡萝卜素 在人体内可转变为维生素A 故称为维生素A原 如 胡萝卜素 其中以 胡萝卜素效价最高 胡萝卜素原只存在于植物性食品中 但以含有胡萝卜为食物的家禽 兽类 水产动物及其加工产品 以及为着色而添加胡萝卜素的食品 当然也含有胡萝卜素 胡萝卜素的结构如下 胡萝卜素对热及酸 碱比较稳定 但紫外线和空气中的氧可促进其氧化破坏 因系脂镕性维生素 故可用有机溶剂从食物中提取 胡萝卜素本身是一种色素 在450nm波长处有最大吸收 故只要能完全分离 便可定性和定量 但在植物体内 胡萝卜素经常与叶绿素 叶黄素等共存 在提取 胡萝卜素时 这些色素也能被有机溶剂提取 因此在测定前 必须将胡萝卜素与其它色素分开 常用的方法有纸层析 柱层析和薄层层析法 维生素D的测定 维生素D是指含有抗伺楼病活性的一类物质 具有维生素D活性的化合物约有10种 其中最重要的是维生素D2 维生素D3及其维生素D原 维生素D2无天然存在 维生素D2只存在于某些动物性食物中 但它们都可由维生素D原 麦角固醇和7 脱氢胆固醇 经紫外线照射形成 维生素D2药片吃多了中毒 分析方法中较好的是比色法和高效液相色谱法 是AOAC选定的正式方法 一 三氯化锑比色法 二 液相色谱法它的的灵敏度较比色法高30倍以上 且操作简便 精度高 分析速度快 是目前分析维生素D的最好方法 水溶性维生素的测定 水溶性维生素B1 B2和C 广泛存在于动植物组织中 饮食来源充足 但是由于它们本身的水溶性质 除满足人体生理 生化作用外 任何多余量都会从小便中排出 为避免耗尽 需要经常地由饮食来提供 水溶性维生素都易溶于水 而不溶于苯 乙醚 氯仿等大多数有机溶剂 在酸性介质中很稳定 既使加热也不破坏 但在碱性介质中不稳定 易于分解 持别在碱性条件下加热 可大部或全部破坏 它们易受空气 光 热 酶 金属离子等的影响 维生素B2对光 特别是紫外线敏感 易被光线破坏 维生素C对氧 铜离子敏感 易被氧化 根据上述性质 测定水溶性维生素时 一般都在酸性溶液中进行前处理 维生素Bl B2盐酸水解酶解提取纯化维生素C通常采用草酸 草酸 醋酸 偏磷酸 醋酸溶液直接提取 在一定浓度的酸性介质中 可以消除某些还原性杂质对维生素C的破坏作用 草酸价廉 使用方便 对维生素C有很好的保护作用 一 维生素Bl的测定 维生素B1又名硫胺素 抗神经炎素 通常以游离态 或以焦磷酸酯形式存在于自然界 在酵母 米糠 麦胚 花生 黄豆以及绿色蔬菜和牛乳 蛋黄中含量较为丰富 分析方法 GB T5009 84 2003中唯一的方法是荧光计法 二 维生素B2的测定 维生素B2即核黄素 在食品中以游离形式或磷酸酯等结合形式存在 膳食中的主要来源是各种动物性食品 其中以肝 肾 心 蛋 奶含量最多 其次是植物性食品的豆类和新鲜绿叶蔬菜 分析方法 GB T5009 85 2003中第一法为荧光法 第二法为微生物法 三 维生素C的测定 维生素C是一种己糖醛基酸 有抗坏血病的作用 所以又称作抗坏血酸 维生素C广泛存在于植物组织中 新鲜的水果 蔬菜 特别是枣 辣椒 苦瓜 柿子叶 猕猴桃 柑桔等食品中含量尤丰富 维生素C具有较强的还原性 对光敏感 氧化后的产物称为脱氢抗坏血酸 仍然具有生理活性 进一步水解则生成2 3 二酮古乐糖酸 失去生理作用 一 2 6 二氯靛酚滴定法 1 原理还原型抗坏血酸可以还原染料2 6 二氯靛酚 该染料在酸性溶液中呈粉红色 在中性或碱性溶液中呈蓝色 被还原后颜色消失 还原型抗坏血酸还原染料后 本身被氧化成脱氢抗坏血酸 在没有杂质干扰时 一定量的样品提取液还原标准染料液的量 与样品中抗杯血酸含量成正比 二 2 4 二硝基苯肼比色法GB T5009 86 2003 蔬菜 水果及其制品中总抗坏血酸含量测定方法 第二法 三 荧光法GB T5009 86 2003第一法试样中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸后 与邻苯二胺 OPDA 反应生成有荧光的喳唔琳 gainoxaline 其荧光强度与抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比 以此测定食品中抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量 脱氢抗坏血酸与硼酸可形成复合物而不与OPDA反应 以此排除试样中荧光杂质产生的干扰 第七节酸性物质的测定概述 一 酸度的概念1 食品中的几种酸度 总酸度 指食品中所有酸性成分的总量 包括在测定前已离解成H 的酸的浓度 游离态 也包括未离解的酸的浓度 结合态 酸式盐 其大小可借助标准碱液滴定来求取 故又称可滴定酸度 有效酸度 指被测溶液中H 的浓度 反映的是已离解的酸的浓度 常用pH值表示 其大小由pH计测定 pH的大小与总酸中酸的性质与数量有关 还与食品中缓冲物的质量与缓冲能力有关 人的味觉只对H 有感觉 所以 总酸度高 口感不一定酸 在一定的pH下 人类对酸味的感受强度不同 如 醋酸 甲酸 乳酸 草酸 盐酸一般食品在pH 3 0 难以适口 pH 5为酸性食品 pH5 6无酸味感觉 食品色香味化学 黄梅丽等编轻工出版社 挥发酸 指食品中易挥发的有机酸 如甲酸 乙酸 醋酸 丁酸等低碳链的直链脂肪酸 其大小可以通过蒸馏法分离 再借标准碱液来滴定 挥发酸包含游离的和结合的两部分 牛乳酸度外表酸度 固有酸度 真实酸度 发酵酸度 牛乳总酸度由两部分组成 外表酸度 指刚挤出来的新鲜牛乳本身所具有的酸度 主要来源于酪蛋白 白蛋白 柠檬酸盐 磷酸盐等 约占牛乳的0 15 0 18 以乳酸计 真实酸度 指牛乳在放置过程中 在乳酸菌作用下使乳糖发酵产生了乳酸而升高的那部分酸度 不新鲜的牛乳总酸量 0 20 牛乳酸度表示法牛乳除按乳酸表示总酸外 还有一种表示法 用 T表示 滴定酸度简称 酸度 牛乳 T 指滴定100mL牛乳样品 消耗0 1mol LNaOH溶液的mL数 或滴定10mL样品 结果再乘10 新鲜牛乳的酸度常为16 18 T 二 酸度测定的意义 有机酸影响食品的色 香 味及稳定性 食品中有机酸的种类和含量是判断其质量好坏的一个重要指标 利用食品中有机酸的含量和糖含量之比 可判断某些果蔬的成熟度 果蔬及其食品中常见的有机酸 7 7 7 7 7 三 食品中酸的来源 生产加工不当 贮藏 运输中污染 原料带入 加工过程中人为加入 生产中有意让原料产酸 各种添加剂带入 酸度的测定 一 总酸度的测定 滴定法 一 原理用标准碱液滴定食品中的酸 中和生成盐 用酚酞做指示剂 当滴定终点 pH 8 2 指示剂显红色 时 根据耗用的标准碱液的体积 计算出总酸的含量 反应式 RCOOH NaOH RCOONa H2O 试剂 0 1mol LNaOH标准溶液 质量 体积浓度 1 酚酞指示剂称取酚酞1g溶解于100ml95 乙醇中 变色范围pH 8 2 10 0 为何以pH8 2为终点而不是pH7 因为食品中有机酸均为弱酸 用强碱滴定生成强碱弱酸盐 显碱性 一般pH8 2左右 故选酚酞为指示剂 此盐在水解时生成金属阳离子 弱酸 OH 故显碱性 例 CH3COONa H2O CH3COOH Na OH 二 操作方法 样液的制备 固体样品 干鲜果蔬 蜜饯及罐头样品用粉碎机或高速组织捣碎机粉碎 混合均匀 取适量样品 约25g 精确至0 01g 最后用碱量 5mL 最好在10 15mL 用150ml水将样品移入250mL容量瓶中 在75 80 水浴上加热半小时 冷却 加水至刻度 用干燥滤纸过滤 弃去初液 收集滤液备用 含CO2的饮料 酒类 要先除CO2 调味品及不含CO2的饮料 酒类 直接取样 咖啡样品 粉碎 加乙醇 放置过夜 固体饮料 加水研磨 定容 过滤 测定滴定用移液管吸取滤液50ml 注入三角瓶中 加入酚酞指示剂3 5滴 用0 1mol L的NaOH溶液滴定至浅 微 红色且30秒不褪色 记录消耗的NaOH量 注 用碱式滴定管 先用水洗净 检查是否漏液 排气泡 再使用 三 计算因食品中含有多种有机酸 总酸度的测定结果通常以样品中含量最多的那种酸表示 要在结果中注明以哪种酸计 K值的变化各种酸的换算系数分别为 苹果酸 0 067 乙酸 0 060 酒石酸 0 075 柠檬酸 0 064 柠檬酸 0 070 含一分子结晶水 乳酸 0 090 盐酸 0 036 磷酸 0 049 式中 X 每公斤 或每斤 样品中酸的克数 g kg 或g L c 氢氧化钠标准滴定溶液的浓度 mol LV1 滴定试液时消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积 mLV2 空白试验时消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积 mLF 试液的稀释倍数m V0 试样的取样量 g或mLK 酸的换算系数 四 讨论1 上述方法适用于各种浅色食品的总酸的测定 如果是深色样品可采取以下措施 滴定前把 50mL样液已放入三角瓶内的 再用无CO2水稀释一倍 若还不行 在上述快到终点时 用小烧杯取出2 3mL液体 再加入20mL水稀释 观察 如果样液颜色过深或浑浊 则宜用电位滴定法 经测pH值来定终点 一边滴定 一边电磁搅拌 到规定的pH值时为终点 二 有效酸度 pH 值的测定 在食品酸度测定中 有效酸度 pH值 的测定 往往比测定总酸度更有实际意义 更能说明问题 表示食品介质的酸碱性 测H 的活度 近似认为是浓度 pH值的测定方法 电位法 pH计法 比色法 化学法 利用蔗糖的转化速度重氮基醋酸乙酯或乙缩醛的分解速度来求pH值 电位法 pH计法 1 原理以玻璃电极为指示电极 饱和甘汞电极为参比电极 插入待测样液中 组成原电池 该电池电动势的大小 与溶液pH值有直线关系 E E 0 0591pH 25 2 适用范围本方法适用于各种饮料 果蔬及其制品 以及肉 蛋类等食品中pH值的测定 测定值可准确到0 01pH单位 3 仪器 酸度计pHS 29A型 手提式 pHS 2型 实验中使用的 pHS 25型 老型号 pHS 3C型 数字显示 Ph HJ90B型 盒式 231型或221型玻璃电极玻璃电极头部是由特殊的敏感玻璃薄膜制成 是电极的主要部分 仅对氢离子有作用 里边为Ag AgCl泡在0 1mol L盐酸溶液中 a 231型玻 232型甘汞电极 可测试pH0 14 221型玻 222型甘汞电极 可测试pH1 9 b 新电极或很久未用的干燥电极 必须先浸在蒸馏水或0 1mol L的盐酸溶液中24小时以上 c 每换一次样液 须将电极用蒸馏水清洗一次 擦干再用 232型或222型甘汞电极甘汞电极内装HgHg2Cl2KCl 饱 a 甘汞电极的两个橡胶小帽 使用时应摘下 用完后还应戴上 b 检查内部KCl是否能接近侧口 不能有气泡存在 c 安装时要让内部KCl液面高于外边被测样的液面 现有复合电极将两个电极装在一起 有保护措施 E 201 0型试剂 缓冲溶液 标准 注意使用温度是20 见实验讲义p22 自己配制要用优级纯试剂 也可购买配好的药品 溶解后使用 色谱纯 优级纯 分析纯 化学纯 工业纯 4 操作方法 1 样品制备 一般液体样品摇匀后可直接取样测定 含CO2的液体样品 除CO2后再测 方法同总酸 果蔬样品 榨汁后 取汁液直接测pH 果蔬干制品