竹叶椒化学成分与镇痛抗炎.doc

竹叶椒（Zanthoxylum armatum DC.）和簕欓（Z.avicenna（Lam.）DC.）的化学成分及竹叶椒镇痛抗炎活性研究郭涛 【摘要】：花椒属是芸香科分布最广的一属,主要分布在亚洲、非洲、美洲、大洋洲的热带和亚热带地区。我国有39种,14个变种。在我国民间,竹叶椒(Zanthoxylum armatum)被用于治疗腹痛、牙痛等；簕欓(Z avicenna)有活血止痛的功效。 疼痛是一种复杂的生理心理活动,是临床上最常见的症状之一。镇痛药物在人们的日常生活中使用的非常普遍。文献研究显示花椒属植物中木脂素和生物碱类化合物有抗炎、镇痛方面的活性,因此从花椒属植物中寻找具有镇痛活性的新化合物引起了研究者的广泛关注。 第一部分、植物化学研究 用常规的柱层析(CC)、制备薄层层析(PTLC)、重结晶等手段对竹叶椒和簕欓的化学成分进行了分离,并用UV、IR、MS、1H-NMR、13C-NMR、DEPT、2D-NMR、CD等光谱手段鉴定化合物的结构。 竹叶椒的根茎采集于广西南宁,从其乙酸乙酯部位共分离得到了48个化合物,鉴定了其中的41个。包括20个双四氢呋喃木脂素,4个三萜,2个甾体,5个异喹啉类和2个喹啉类生物碱,4个苯的衍生物,2个香豆素,1个脂肪酸和1个烷烃。其中armatumin (-5)和armatunine (-39)为新化合物。去-N-甲基-白屈菜红碱(I-7),isodecaline (-8),羽扇豆醇(I-13),pinoresinol-di-3,3-dimethylally lether (-19), N-nornitidine (-20), methylxanthoxylol (-22),5-demethoxyepiexcelsin (-23),对羟基苯甲酸(-24), demethoxyaschantin (-25), epiaschantin (-29), piperitol (-30), pinoresinol-3,3-dimethylallylether (-31),6-acetonyldihydrochelery-thrine(-41),这13个化合物为首次分离,其中I-23和I-29为首次从芸香科中分离得到。 簕欓的根茎采集于广西南宁,从其乙酸乙酯部位分离到16个化合物,鉴定了其中的9个,它们分别是香豆素(avicennin,-1; Luvangetin,-8; Xanthoxyletin,-9)、甾体(-谷甾醇,-2)、三萜(-香树脂醇,-5；-香树脂醇,-6；羽扇豆醇,-7)、生物碱(去-N-甲基-白屈菜红碱,-3)和苯的衍生物(邻苯二甲酸二异丁酯,-4)。其中-2到-9,这8个化合物是首次从该植物中分离得到。 第二部分、HPLC方法鉴定竹叶椒乙酸乙酯部位的主要成分 流动相：乙腈水。洗脱条件：0-20min,30%-50%乙腈；20-35min,50%乙腈；35-50min,50%-90%乙腈；50min-57min,90%乙腈。流速：1ml/min。检测波长：233nm。乙酸乙酯部位主要的峰达到了基线分离,鉴定了其中8个主要色谱峰。它们分别是eudesmin, horsfieldin, (-)-fargesin, kobusin, sesamin, L-asarinin, planispine A和pinoresinol-di-3,3-dimethylallyl。 第三部分、抗炎镇痛药理作用研究 第一节、体内试验 药理活性研究主要采用经典的动物行为学模型,包括醋酸扭体试验、福尔马林试验、热板法和二甲苯致炎法。选择民间长期使用、临床疗效确定的竹叶椒进行研究。对中草药竹叶椒进行活性跟踪,依次对其乙醇提取物,各个溶剂萃取部位,不同剂量的乙酸乙酯部位及其四个流份,以及部分单体化合物的镇痛和抗炎作用展开研究,得到以下几个主要的结果： 1)竹叶椒的乙醇粗提物在三种镇痛模型上都表现出了镇痛活性。尤其在醋酸扭体试验和福尔马林试验的第二相,所有被选择的剂量均表现出显著性。 2)阿片受体拮抗剂纳洛酮显著的拮抗了竹叶椒粗提物对福尔马林第一相的镇痛作用,并对第二相也有一定的抑制性。 3)在竹叶椒各个溶剂萃取部位镇痛活性筛选中,乙酸乙酯部位的镇痛作用最强(P0.001),其它部位也表现出一定的镇痛作用(P0.05)； 4)三种所选动物模型中,不同剂量(800,400,200,100mg/kg)的乙酸乙酯部位,均有很好的抗炎和镇痛活性。 5)对乙酸乙酯的几个流份进行镇痛研究,随着极性增大其镇痛作用呈现逐渐减弱的趋势。相同剂量下,乙酸乙酯各个流份对小鼠扭体次数的抑制率要弱于总乙酸乙酯部位。 6)在醋酸扭体动物试验中,芝麻素在80mg/kg,去-N-甲基-白屈菜红碱在20、40mg/kg时表现出显著的镇痛效果。在小鼠耳肿胀试验中,(-)-fargesin在80mg/kg、(-)-yangambin在30mg/kg时表现出显著的抗炎作用。 根据以上研究结果,得出如下结论： 1)竹叶椒镇痛作用机制主要是抗炎镇痛作用,阿片受体也有部分的参与。 2)竹叶椒的镇痛作用可能是多种成分协同作用的结果。 3)结合已有的文献,生物碱和木脂素类化合物可能是竹叶椒镇痛作用的主要活性成分；木脂素类化合物是其抗炎作用主要活性成分。 4)本研究得到了镇痛活性成分芝麻素和去-N-甲基-白屈菜红碱,以及抗炎活性成分(-)-fargesin和(-)-yangambin。 在炎症发生时,巨噬细胞通过释放前炎性因子(TNF-, IL-6),以及炎症介质(NO, PGE2)而积极参与炎症反应过程。TNF-和IL-6是炎症中的关键因子,NO和PGE2的过度生成在炎性生理反应过程中也发挥着重要作用。本文中,采用脂多糖(LPS)诱导RAW264.7建立炎症模型,来研究竹叶椒的抗炎机制。主要得到以下主要的结果： 1)芝麻素、L-细辛脂素、(-)-fargesin、pinoresinol-di-3,3-dimethylally lether、去-N-甲基-白屈菜红碱、木兰碱都对NO的生成在不同程度上有抑制作用。 2)L-细辛脂素和木兰碱在100M时对Raw64.7诱导的IL-6的产生有显著的抑制作用。 3)芝麻素对LPS诱导的TNF-的生成有抑制作用。 4)芝麻素、L-细辛脂素、(-)-fargesin、pinoresinol-di-3,3-dimethylally lether、去-N-甲基-白屈菜红碱、木兰碱都在不同浓度上对PGE2的生成有显著的抑制作用。 竹叶椒抗炎的机制涉及对前炎症细胞因子(TNF-、IL-6)、炎症介质(NO、PGE2)释放的抑制。 今后我们将对分离得到的主要化合物(尤其是木质素和生物碱类成分)进行制备。继续通过体内试验来筛选活性成分,并对主要活性成分通过体外试验进行机制研究。 以上竹叶椒和筋模化学成分及竹叶椒药理活性的研究结果为花椒属植物的分类、鉴定提供参考,也为进一步开发利用花椒属药用植物资源提供科学依据。【关键词】：竹叶椒 簕欓 抗炎镇痛 木脂素 生物碱 【学位授予单位】：复旦大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2011【分类号】：R284【目录】： 摘要7-10 ABSTRACT10-14 前言14-16 第一章 竹叶椒抗炎镇痛作用研究16-35 1.材料与方法17-18 1.1.植物材料17-18 1.1.1.乙醇提取物17 1.1.2.各萃取相的制备17 1.1.3.乙酸乙酯部位各流份的制备17-18 1.1.4.单体化合物的制备18 1.2.试药18 1.3.实验动物18 2.药理试验18-19 2.1.镇痛试验18-19 2.2.抗炎试验19 2.3.数据分析19 3.药理实验结果19-29 3.1.镇痛植物筛选20-21 3.2.竹叶椒粗提物镇痛的作用21-23 3.2.1.醋酸扭体试验21-22 3.2.2.福尔马林试验22-23 3.2.3.热板法23 3.3.不同溶剂萃取部位的镇痛作用23-24 3.4.乙酸乙酯部位的镇痛抗炎的作用24-26 3.4.1.醋酸扭体试验24-25 3.4.2.福尔马林试验25-26 3.4.3.抗炎试验26 3.5.乙酸乙酯部位四个馏分的的镇痛的作用26-27 3.6.单体化合物的镇痛抗炎作用27-29 3.6.1.单体化合物在醋酸扭体试验中的镇痛作用27-29 3.6.2.单体化合物在耳肿胀试验中的抗炎作用29 4.讨论29-33 4.1.粗提物的镇痛作用30-31 4.2.各个溶剂萃取部位的镇痛作用31 4.3.乙酸乙酯部位镇痛抗炎作用31-32 4.4.乙酸乙酯各个馏分的镇痛作用32 4.5.单体化合物的镇痛抗炎作用32-33 本章小结33-34 参考文献34-35 第二章 化学成分研究35-64 第一节、竹叶椒化学成分研究35-55 1.结果与讨论35-53 1.1.新化合物的结构解析35-40 1.2.化合物的主要理化数据40-53 2.实验材料、仪器和化学试剂53-54 2.1.供试材料53 2.2.仪器53 2.3.化学试剂53-54 3.提取分离54-55 第二节、簕欓化学成分研究55-59 1.化合物的主要理化数据55-58 2.实验材料、仪器和化学试剂58-59 2.1.供试材料58 2.2.仪器与化学试剂58 2.3.提取分离58-59 本章小结59-60 参考文献60-64 第三章 竹叶椒乙酸乙酯部位主要成分HPLC鉴定64-67 1.仪器与材料64 2.样品及对照品的处理64 2.1.样品64 2.2.对照品的处理64 3.色谱条件64 4.实验结果与讨论64-66 本章小结66 参考文献66-67 第四章、体外抗炎作用机制初步研究67-85 1.试验材料67-68 1.1 细胞系67 1.2 细胞培养耗材67-68 1.3 试剂及药品68 1.4 试剂盒68 1.5 主要仪器68 2.试验方法68-72 2.1 细胞复苏与培养68 2.2 细胞冻存68-69 2.3 MTT试验69 2.3.1 基本原理69 2.3.2 试验方法69 2.4 上清的收集69-70 2.5 NO的释放量70-71 2.5.1 基本原理70 2.5.2 NO的释放量的测定70-71 2.6 前细胞因子释放量的测定71 2.6.1 基本原理71 2.6.2 测定及操作要点71 2.7 PGE2的测定71-72 2.7.1 基本原理71 2.7.2 测定及操作要点71-72 3.数据分析72 4.试验结果与分析72-82 4.1 RAW264.7细胞的形态72-73 4.2 药物细胞毒性的检测73-74 4.3 NO的测定74-76 4.4 IL-6测定76-78 4.5 TNF-的测定78-80 4.6 PGE_2的测定80-82 5. 讨论82-84 本章小结84 参考文献84-85 总结与展望85-86 一、总结85 二、展望85-86 花椒属化学成分及药理研究进展(文献综述)86-127 参考文献117-127 致谢127-128 在校期间已发表的论文128-129 附图目录129-130 附图130-146 花椒生物碱成分分离、感官评定及药理作用研究关荣琴 【摘要】：花椒(Zanthoxylum bungeanum)属芸香科(Rutaceae)植物,是我国一种传统药食两用原料。生物碱具有抗炎止痒、镇痛杀菌和抗肿瘤等多种生理活性。花椒中生物碱含量丰富,但国内外对其研究较少。本文对花椒生物碱的测定方法进行了研究,采用溶剂浸提法提取花椒生物碱,优化提取工艺后对其进行分离纯化、感官评定和活性研究。试验主要内容如下： 选用乙醇作为溶剂,先进行单因素试验,再通过正交试验设计方法,以总生物的得率为考察指标,考察温度、提取时间、乙醇浓度、pH对花椒生物碱的得率的影响。结果显示各因素对生物碱提取得率的影响程度由大到小依次为：乙醇浓度pH值提取温度提取时间,最佳提取工艺条件为：乙醇浓度70%,pH值为3,提取温度60,料液比1：20,提取提取时间3h,总生物碱的平均得率为0.8898%。 研究大孔树脂纯化花椒总生物碱的条件。利用NKA-9大孔树脂吸附纯化花椒生物碱,通过薄层色谱法和紫外分光光度法鉴定生物碱。结果表明,大孔树脂纯化花椒生物碱的洗脱条件为,将花椒提取液上柱吸附2 h,依次用3倍柱体积的水,50%、70%的乙醇进行洗脱；70%乙醇洗脱部分为生物碱,50%乙醇洗脱部分为黄酮类物质；花椒生物碱可达到分离和纯化的目的。 应用高速逆流色谱法从花椒中分离生物碱,以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(5：5：7：5)为溶剂体系,上相为固定相,下相为流动相,流速2mL/min,仪器转速800r/min,检测波长254 nm,上样量800mg。通过逆流色谱可获得A(130 mg)和B(15 mg),TLC分析为生物碱,HPLC检测纯度分别为92.8%和85.4%,结果表明HSCCC对于制备、分离纯化花椒生物碱具有较大的优越性。 感官评价是一门人类通过味觉、触觉、视觉、嗅觉和听觉而感知感觉并制定、测量、分析和说明感觉的学科。本研究参考辣椒辣度的测定方法,用乙醇提取测试样品中的麻味成分,然后过滤,将该提取液制成不同麻味浓度的糖水溶液,通过感官分析品评,找出刚好尝出麻味时溶液的稀释倍数,由此计算麻度级别。结果显示花椒醇提物、花椒大孔树脂洗脱物的麻度级别分别为七级、八级。该评定方法操作简单,结果可靠,可以考虑作为花椒及其制品的麻度测定方法之一。 皮肤瘙痒症为常见、多发病,是由组胺、蛋白酶、血管舒张素及某些肽素等介质刺激皮肤,引起的一种病症。对于皮肤瘙痒治疗以改善瘙痒症状为核心,如能兼顾抗炎、镇痛和抑制皮肤化脓性感染则疗效更好。本文探讨花椒生物碱局部外涂的药理作用,采用滤纸片法、小鼠热板法、二甲苯致炎法及低分子右旋糖酐-40诱发小鼠皮肤瘙痒法研究花椒生物碱在抑菌、镇痛、抗炎、止痒方面的作用。结果显示花椒生物碱对金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用,能较强抑制二甲苯所致小鼠耳肿胀,能提高小鼠对热的痛阈值及致痒阈值,且持续时间较长,与空白对照组比较差异显著。由此可见,花椒生物碱具有较强的抑菌、抗炎、镇痛、止痒作用,有待进一步开发研究。【关键词】：花椒 生物碱 提取 分离纯化 感官评定 药理作用 【学位授予单位】：吉林大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2011【分类号】：R284;R285花椒和青椒的生药学、化学成分和药效学比较研究李惠勇 【摘要】： 花椒药材来源于芸香科花椒属植物花椒(Zanthoxylum bungeanum Maxim.)和青椒(Z. schinifolium Sieb. et Zucc.)的干燥成熟果皮,为临床常用中药。花椒为两基原品种,中国药典自1985年版以来将花椒和青椒同作花椒药材来源,但有关花椒和青椒这两个品种是否可等同如药以及两者之间的生药学、化学成分、药效学比较研究未见报道。本课题首次对药典收载的花椒(Zanthoxylum bungeanum Maxim.)和青椒(Z. schinifolium Sieb. et Zucc.)的这两个不同基原的花椒药材进行了深入系统地对比研究；从本草学考证、生药学、化学成分以及药效学等方面比较花椒和青椒的异同,为二者是否可等同入药提供了科学依据。研究内容及实验结果如下： 1.本草考证结果 花椒别名川椒、蜀椒,花椒始载于诗经,称“大椒”,花椒入药最早见于神农本草经,认为花椒可以“坚齿发”、“耐老”,花椒之名始见于本草纲目,据考证历代本草所述的“秦椒”、“蜀椒”即为花椒(Zanthoxylum bungeanum Maxim.),古今药用品种一致；青椒别名香椒子、崖椒,作者考证了历代本草,未见有关于青椒(Z. schinifolium Sieb. et Zucc.)药用的记载。 2.生药学比较 2.1性状鉴定 花椒表面红色、紫红色、或棕红色,表面皱缩,腺点排列不规则,腺点清晰,凸起或显著凸起成瘤状；青椒表面棕褐色或棕绿色,网纹隆起或皱缩明显,腺点细小或不易见,凸凹状况肉眼不易分辨,二者外观性状差异明显。 2.2显微鉴定 青椒与花椒果皮横切面的主要区别点：青椒外缘呈皱缩状凹陷,内含较多橙皮苷结晶,直径1025m。中果皮有约20个椭圆形油室,长径11034m,短径6016m,薄壁细胞含草酸钙簇晶,直径152m,并有淀粉粒。内果皮厚7823m,由数列厚壁细胞排列成编织网状,细胞壁厚1-1.5m,微木化。 青椒与花椒果皮粉末特征的主要区别点：表皮细胞垂周壁平直,外平周壁条状角质纹理皱缩,长短不一,不规则排列,细胞内充满橙皮苷结晶。内果皮细胞多呈长条形或类长方形,镶嵌排列或上下层垂直交错,壁平直,具单斜纹孔。少数呈石细胞状,壁厚约2m,弱木化,具孔沟。淀粉粒众多,卵圆形,长36m,直径27m。草酸钙簇晶数量较少,直径14-23m。 从花椒和青椒表面颜色、横切面所见中果皮油室的数目、内果皮细胞的排列及细胞壁的增厚程度、果皮粉末中表皮细胞的角质层纹理、气孔的形状和大小橙皮苷结晶的有无及分布、表皮及下皮细胞的内含色素情况、淀粉粒的形状及大小等,对花椒和青椒的鉴别具有显著的意义。 3.化学成分比较 3.1挥发油成分 运用GC-MS方法对花椒和青椒的挥发油成分进行分析,花椒挥发油含量为6.05%,GC-MS分析鉴定成分35个；二者相对百分含量在0.1%以上的共有7个共有成分,青椒挥发油含量为4.27%,GC-MS分析鉴定成分16个。花椒挥发油主要含有1.8桉叶素(11.43%),柠檬烯(20.33%),B-月桂烯(12.52%),芳樟醇(23.47%),a-松油醇(3.68%),青椒挥发油主要含有爱草脑(82.66%),桧烯(3.67%),1-甲基-4-(1-甲基乙基)-环己烯(5.50%),二者挥发油含量和组成差异较大。 3.2黄酮类成分 以HPLC法测定了20批花椒中芦丁的含量,结果20批花椒药材样品中芦丁含量测定结果在0.234-1.155%之间,10批花椒中芦丁平均含量为1.011%,10批青椒中芦丁平均含量为0.286%,花椒中芦丁平均含量约为青椒的3.5倍；以分光光度法测定了20批花椒中总黄酮的含量,结果20批花椒药材样品中总黄酮含量测定结果在3.15-10.11%之间,10批花椒中总黄酮平均含量为8.83%,10批青椒中总黄酮含量为3.41%,花椒中总黄酮平均含量约为青椒的2.5倍。 4.药效学比较 根据花椒“温中止痛、杀虫止痒”的传统功效,对花椒和青椒对胃肠道及镇痛作用进行了比较研究。采用番泻叶致小鼠急性腹泻实验,结果显示花椒青椒均有显著的抗腹泻作用,且同剂量下的花椒与青椒相比有显著性差异；采用醋酸扭体法对花椒和青椒的镇痛作用进行研究,花椒有显著镇痛作用,青椒则没有镇痛作用；正常小鼠小肠推进实验表明,花椒和青椒均能显著抑制正常小鼠的小肠推进运动,且同剂量下的花椒与青椒相比有显著性差异。 综上所述,花椒和青椒的本草学记载、以及生药学、化学成分、药效学等几方面均存在较大差异,建议新版药典将二者分开使用。【关键词】：花椒 青椒 生药学 化学成分 药效学 比较研究 【学位授予单位】：成都中医药大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2009【分类号】：R285;R284.1竹叶椒木脂素成分的研究胡昀 【摘要】： 竹叶椒(Zanthoxylum planispinum Sieb.et Zucc.)为芸香科(Rutaceae)花椒属(Zanthoxylum Linn)植物。别名狗花椒,灌木或小乔木,高可达4米,常生长在灌丛、路旁及阴湿的环境中。治疗感冒、咳嗽、吐泻、牙痛等症。本属植物全世界约有250种,我国约有45种,13变种。花椒属药用成分的研究,国内外已有许多报道。花椒的果实、根、茎和叶均可入药。近年来发现该植物有明显的凝血功能、镇痛、镇静、抗炎、抑菌杀虫、抗肿瘤等药理活性,引起国内外学者对该属研究的极大兴趣。 本文利用系统溶剂提取法、正相和反相硅胶柱色谱法、高效液相色谱法等现代分离技术,从恩施巴东竹叶椒树皮的甲醇提取物乙酸乙酯中分离了18个化合物,运用现代波谱学技术鉴定了这18个化合物,其中5个为新化合物,化合物17和18为一对区域异构体,其他13个已知化合物为首次从该植物中得到。 新化合物分别命名为:planispine A (14),planispine B (15),biplanispine A (16),biplanispine B (17),biplanispine C (18)。 已知化合物分别鉴定为:eudesmin (1),松脂醇单甲醚(pinoresinol monomethyl ether) (2),松脂素(pinoresinol) (3),(1R, 2S, 5R, 6S)-6-(4-hydroxy-3- methoxyphen yl)-2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,7-dioxabicyclo3.3.0 octane (4),里立脂素-B-二甲醚(yangamb