《鱼类细胞工程基础》PPT课件.ppt

鱼类细胞工程基础实验 指导老师王敏汤蓉辅助研究生尹晓燕童娜 2 课程安排 3 4 5 动物细胞工程 动物细胞工程 是应用细胞生物学和分子生物学的理论和方法 按照人们的设计 进行在细胞水平上的遗传操作 从而获得新型生物 6 动物细胞工程常用技术 动物细胞培养技术动物细胞融合技术单克隆抗体技术胚胎移植技术细胞核移植技术 7 动物细胞培养 细胞培养是指从动物活体中取出小块组织分离出细胞 在模拟机体内的生理环境条件下 进行培养 使之继续生存 生长 增殖 原代培养传代培养永久细胞系 8 细胞培养在水产业的应用 鱼类病毒学 病毒的分离 鉴定以及病毒疫苗的制备鱼类细胞毒理学 评价样品的细胞毒性等水产基础理论鱼类免疫学鱼类遗传学 9 本实验课的目的 培养实验的思维 提高实验技能 锻炼动手能力 掌握无菌操作 养成规范的实验室工作习惯 为将来适应多种领域的工作打基础 10 鱼类细胞培养的基本条件 温度温度过低时细胞生长缓慢甚至不生长 利用冷冻保藏细胞可保持细胞的原有分裂分化能力 温度过高导致细胞死亡 这主要是由酶和蛋白质所需要的最适温度决定的 适宜的温度 25 温带鱼 30 热带鱼 15 寒带鱼 37 水生哺乳动物 11 2 pH过酸或过碱可导致细胞死亡 这主要与蛋白质的变性和细胞膜的结构受损有关 用NaHCO3和Hepes调节培养液的pH至7 4左右 鱼类细胞培养的基本条件 12 渗透压细胞膜调节渗透压的能力是有限的 需用平衡盐溶液配制各种试剂 常用的平衡盐溶液 PBS 磷酸盐缓冲溶液 phosphatebufferedsolution D Hanks 鱼类细胞培养的基本条件 13 营养物细胞培养基 培养基中含有细胞增殖和生长所需要的各种物质 常用培养基 MEM M199 L 15等动物细胞离体培养常常需要血清 血清提供生长必需因子 如激素 微量元素 矿物质和脂肪 小牛血清 胎牛血清 鱼类细胞培养的基本条件 14 支持物大多数动物细胞有贴壁生长的习惯 离体培养常用玻璃或塑料培养瓶等作为支持物 气体交换CO2培养箱 调节CO2的比例为5 去离子水 三次蒸馏水 鱼类细胞培养的基本条件 15 无菌条件体外细胞培养仅仅是对所需的细胞进行培养 但环境中 如空气 有各种其他微生物 必须对所需细胞进行无杂菌的隔离培养 无菌条件是细胞离体培养最基本的条件 鱼类细胞培养的基本条件 超净工作台 16 实验室仪器设备 实验室条件 干燥 紫外灯仪器设备 高压灭菌锅 用于高压灭菌干燥箱 用于干燥超净工作台 用于无菌操作玻璃三蒸水器 用于制三蒸馏水恒温生化培养箱 用于恒温培养细胞倒置生物显微镜 用于观察细胞生长液氮罐 用于细胞长期保存 17 考核方法 实验报告 论文格式 一 目的与意义二 材料与方法三 实验结果四 讨论 问题 经验 体会 要求 多查阅参考文献 实验中胆大心细 18 修读要求 1 无菌操作 严格规范操作 2 实验是连续性的 需要每天来观察和处理细胞 3 每天来做实验的时间与老师和研究生协商 各组时间要相对集中和固定 19 实验一 二思考题 培养基过滤后需要加哪些物质 为什么 为什么胰蛋白酶和培养基要过滤灭菌 不能高压灭菌 生长培养基的pH值应为多少 呈什么颜色 为什么 为什么要培养基中需加入L 谷氨酰胺 为什么复苏细胞时 要迅速解冻 20 实验五染色体制备 每一物种的细胞一般都具有一定数目 形状和大小的染色体 在秋水仙素的作用下可使分裂细胞阻断在中期 此时染色体形态最典型 然后通过低渗 固定 染色等步骤 便可在显微镜下呈现出其形态 21 一 准备细胞接种细胞 T75cm2瓶子1个培养24h换10mL新鲜medium和0 1mL秋水仙素 1 g L 培养13 15h消化细胞 1000rpm离心 5分钟 收集沉淀细胞加2mLPBS混匀细胞将细胞悬液移到T75cm2的培养瓶内 操作步骤 22 慢慢加10mL双蒸水 4 室温孵育10min慢慢加10mL现配的GAA固定液 冰醋酸 甲醇 1 3 室温放置10min移到一个离心管 1000rpm离心 10min弃去上清 留约2mL加3mL新鲜固定液 轻轻混匀细胞1000rpm离心 5min弃去上清 留约0 5mL 23 加0 5mL新鲜固定液 轻轻混匀细胞 然后加4mL新鲜固定液 轻轻混匀孵育5分钟1000rpm离心 5分钟弃去4 8mL上清 仅留0 2mL加1 1 5mL新鲜固定液 轻轻混匀细胞沉淀二 清洁玻片6 8个干净的玻片 浸泡在95 乙醇里烘干浸泡在冰水里至少30min 24 三 准备玻片和染色用滴管吸取来自于步骤1 21的细胞悬液0 2mL滴在湿玻片上火焰上拖动 固定2 3次放在预热的切片烘干机上 15min 蒸发液体 把装有1NHCl的染色缸 浸入60 水浴中加热 把玻片插入培育10min倾去HCl溶液用双蒸水清洗玻片2次空气干燥 25 将玻片浸入装有Giemsa溶液的染色缸中 现稀释的1 25 孵育15min用双蒸水冲洗玻片2 3次 除去残液空气干燥显微镜下观察计数 26 实验六细胞冻存 细胞冻存是细胞保存的主要方法之一 利用冻存技术将细胞置于 196 液氮中低温保存 可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来 这样在需要的时候再复苏细胞用于实验 适度地保存一定量的细胞 可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种 起到了细胞保种的作用 可以利用细胞冻存的形式来购买 寄赠 交换和运送某些细胞 27 冻存原理 细胞冻存时向培养基中加入保护剂 终浓度5 15 的二甲基亚砜 DMSO 可使溶液冰点降低 加之在缓慢冻结条件下 细胞内水分透出 减少了冰晶形成 从而避免细胞损伤 采用 慢冻快融 的方法能较好地保证细胞存活 标准冷冻速度开始为 1 2 min 当温度低于 25 时可加速 到 80 之后可直接投入液氮内 196 28 操作步骤 冻存2个75cm2培养瓶里的细胞 取6 8个1 5mL的冻存管 如果每个冻存管需要装1mL的细胞悬浮液 需要配6 8mL的冻存液 在离心管中依次加入 DMSO0 6mL 生长培养基1 8mL FBS0 6mL轻吹打混匀 立即放入冰里 另在收集消化好的细胞的离心管里加入培养液3mL 轻轻吹打使细胞均匀悬浮 29 吸取细胞悬液 轻轻加