人教2003课标版高中生物选修1专题5课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段共26张PPT副本.ppt

课题背景PCR技术是一种体外迅速扩增DNA片段的技术 它能以极少量的DNA为模板 在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝 广泛用于遗传疾病的诊断 刑侦破案 古生物学 基因克隆和DNA序列测定 DNA多聚酶链式反应扩增DNA片断 课题2 一 知识回顾 1 DNA的基本单位 脱氧核苷酸 脱氧核糖核酸 五碳糖 磷酸基团 羟基 3 端 5 端 5 端 含磷酸基团 3 端 含羟基 3 端 5 端 2 脱氧核苷酸链的形成 3 DNA分子的双螺旋结构 DNA分子是由的脱氧核苷酸长链盘旋而成的规则结构 与交替连结 排列在外侧 构成基本骨架 排列在链的内侧 两条链上的碱基通过连结起来 形成碱基对 碱基对的组成有特定的规律 即腺嘌呤一定与配对 一定同胞嘧啶配对 双螺旋 两条反向平行 脱氧核糖 磷酸 碱基 氢键 胸腺嘧啶 鸟嘌呤 生物体内DNA分子复制的条件 解旋酶 打开DNA双链 DNA母链 提供DNA复制的模板 4种脱氧核苷酸 合成子链的原料 DNA聚合酶 引物 使DNA聚合酶能够从引物的3 端开始连接脱氧核苷酸 催化合成DNA子链 DNA聚合酶的特性 DNA聚合酶不能从头开始合成DNA 而只能从3 端延伸DNA链 因此 DNA复制需要引物 小资料 引物是一小段DNA或RNA 它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对 用于PCR的引物长度通常为20 30个核苷酸 DNA的复制方向 3 5 5 3 因此 DNA的合成方向总是从子链的5 端向3 端延伸 一 PCR技术的概念 是一种体外迅速扩增DNA片段的技术 它能以极少量的DNA为模板 在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝 二 PCR技术的应用 遗传疾病的诊断 刑侦破案 古生物学 基因克隆和DNA序列测定 三 基础知识 解旋酶 打开DNA双链 DNA母链 模板 4种脱氧核苷酸 合成子链原料 DNA聚合酶 催化子链合成 引物 RNA 使DNA聚合酶能从引物3 端开始连接脱氧核苷酸 自主阅读P59 并思考 体外扩增DNA 需要怎样环境 变性 80 100 Taq聚合酶 耐高温 20 30个核苷酸构成DNA DNA母链 4种脱氧核苷酸 缓冲溶液 控制温度 体内复制DNA 体外扩增DNA 1 DNA分子的热变性原理 DNA双链 单链 变性 加热80 100 复性 缓慢冷却 变性的目的 复性的目的 解开双链 有利于引物与两条单链结合 在80 100 的温度范围内 DNA的双螺旋结构将解体 双链分开 这个过程称为变性 三 PCR原理 PCR技术总结 利用DNA分子的热变性原理 通过控制温度来控制双链的解旋与结合 从而完成体外DNA分子的扩增 四种脱氧核苷酸 耐热的DNA聚合酶 引物 DNA模板 缓冲溶液和控制温度的温控设备 子链的5 端向3 端延伸 具有特异 敏感 产率高 快速 简便 重复性好 易自动化等突出 原理 条件 方向 特点 变性95oC 四 PCR的反应过程 5 引物1 5 引物2 5 5 模板DNA 经n次循环 复制 后 DNA的含量理论上可以扩大到倍 2n 每次循环分为 PCR的反应过程总结 变性 复性 延伸 DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列 使这段固定长度的序列呈指数扩增 从第二轮循环开始 上一次循环的产物也作为模板参与反应 并且由引物 延伸而成的DNA单链会与引物 结合 进行DNA的延伸 PCR的反应结果 模拟PCR扩增DNA 二 PCR反应的实验操作 1 PCR仪 一 设备及用具 2 微量离心管 一种薄壁塑料管 总容积为0 5ml 3 微量移液器 用于定量转移PCR配方中的液体 其上的一次性吸液枪头用一次更换一次 能够自动调控温度的仪器 二 PCR的操作步骤 1 按配方将所需试剂摆放在实验桌上 准备 2 用微量移液器按配方在微量离心管中依次加入各组分 移液 3 盖严离心管口的盖子 用手指轻轻弹击管壁 混合 4 将微量离心管放在离心机上离心约10s 离心 5 将离心管放入PCR仪上 设置好PCR仪的循环程序 反应 一 理论上DNA扩增数目的计算 1 一条DNA 复制n次 DNA为 2 a条DNA 复制n次 DNA为 三 结果分析与评价 2n ax2n 例根据下列PCR反应系统模式图回答问题 1 PCR反应需要在一定的 溶液中进行 除了调控温度外 溶液中还需要提供哪些物质 2 如以14N标记的脱氧核苷酸为原料 1个用15N标记的DNA分子 经过PCR仪5次循环后 将产生 个DNA分子 其中含14N标记的DNA分子占全部DNA分子总数的 在研究15N标记的一个DNA分子中发现 腺嘌呤占35 则该DNA分子的一条链上 鸟嘌呤的最大值可占此链碱基数的 3 分别以不同生物DNA样品为模板合成的新DNA之间存在差异 造成差异的原因主要是 PCR扩增得到的DNA序列长度是固定的 原因是 4 某个DNA分子的碱基中共含腺嘌呤200个 利用PCR技术循环数次后 消耗周围环境中腺嘌呤脱氧核苷酸3000个 则循环次数为 次 解析 PCR反应需要在一定的缓冲溶液中进行 除了调控温度外 溶液中还需要提供DNA模板 分别与2条模板链相结合的2种引物 4种脱氧核苷酸 耐热的DNA聚合酶 5次循环后 将产生25个DNA分子 即32个DNA分子 由于DNA分子以半保留方式复制 所以每个DNA分子都含有14N标记的链 故含14N标记的DNA分子占全部DNA分子总数的100 DNA分子中35 是腺嘌呤 则鸟嘌呤的最大值可占 此链碱基数的1 35 2 30 DNA的差异性表现在脱氧核苷酸的数目 比例和排列顺序的不同 DNA聚合酶只能从引物的3 端开始延伸 所以特异性地复制处于两个引物之间的DNA片段 设该DNA分子循环了n次 消耗环境中的A为200 2n 1 即200 2n 1 3000 得出n 4 答案 1 缓冲DNA模板 分别与2条模板链相结合的2种引物 4种脱氧核苷酸 耐热的DNA聚合酶 2 32100 30 3 脱氧核苷酸的数目 比例 和排列顺序的不同模板链的长度彼此一致 且DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的D