RT-qPCR(实时荧光定量PCR).ppt

实时荧光定量PCR技术RealTimeQuantitativePCR 南开大学医学院lfnn Logo RT qPCR原理 Contents 1 RT qPCR步骤 2 SYBR实验步骤 3 Logo RT qPCR原理 1 定义 在PCR反应体系中加入荧光基团 利用荧光信号累积实时监测整个PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化 最后通过通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析的方法 1 荧光原理 SYBRGreen2 定量原理 1 介绍三个概念 扩增曲线 荧光阈值 Ct值 2 定量原理 绝对定量 标准曲线 相对定量 2 Ct 3 融解曲线 非特异性荧光标记 1 SYBRGreen结合于双链DNA小沟之间 只有和双链DNA结合后才发荧光 在变性过程中无荧光 在复性及延伸过程中发出荧光 RT qPCR原理 荧光原理 特异性荧光标记 1 TaqMan水解型杂交探针 5 端标记有报告基团R 3 端标记有荧光淬灭基团Q 探针完整 R所发射的荧光能量被Q基团吸收 无荧光 Taq酶有5 3 外切核酸酶活性 可水解探针R与Q分开 发出荧光 2 MolecularBeacon分子信标 标记荧光的发夹探针 环与目标序列互补 茎由互补配对序列组成 变性过程 产生非特异性荧光 延伸过程 不产生荧光 退火过程 产生特异性荧光 检测荧光信号 3 Amplisensor双链信号引物 进行半巢式扩增 随着PCR循环的重复进行 信号引物的双链结构被破坏 其中一条链参与到产物的合成中 荧光消失 产物量与荧光成反比 Logo RT qPCR原理 定量原理 1 扩增曲线图 横坐标 扩增循环数 Cycle 纵坐标 荧光强度每个循环进行一次荧光信号的收集 Ct值的定义 PCR扩增过程中 扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数 Ct值极具重现性 分析定量时多取15 35较好 荧光信号阈值 threshold 前15个循环信号作为荧光本底信号 baseline 即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值 荧光域值的缺省设置是3 15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 Logo RT qPCR原理 定量原理 1 理想的PCR反应 X X0 2n非理想的PCR反应 X X0 1 Ex nn 扩增反应的循环次数X 第n次循环后的产物量X0 初始模板量Ex 扩增效率 logX0 log 1 Ex Ct logXLog浓度与循环数呈线性关系 根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量 1 绝对定量 Logo RT qPCR原理 绝对定量 1 模板DNA量越多 荧光达到域值的循环数越少 即Ct值越小Log浓度与循环数呈线性关系 通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线 根据样品Ct值 就可以计算出样品中所含的模板量 1 绝对定量 Logo RT qPCR原理 绝对定量 1 R2为相关系数 R2 0 99时 认为两数值之间相关性好 E为扩增效率 一般认为在90 110 之间数据可用 Logo RT qPCR原理 相对定量 1 2 相对定量 结果表示病人的目的基因的表达是对照组目的基因表达的多少倍 RT qPCR原理 融解曲线 Tm值 DNA解链一半时的温度 将温度与荧光强度的变化求导 dI dT 融解曲线为单一峰 无非特异性荧光 定量准确 溶解峰反映反应中扩增到的产物的量 前面杂峰较多时可能原因为样品未混匀 RT qPCR步骤 SYBRGreen法 1 准备物品 检测样本 内参 引物 荧光染料 八连管 移液枪 Realplex软件2 将样本等稍许离心3 加样 可将所有共同物质加入同一管中 混匀后分散入其他管中 反应体系 ddH2O10 L染料8 L引物上下游各0 5 L样本1 L4 将八连管标记后离心至无壁挂液体5 将其置入Realplex仪中 设置程序 95 15s95 15s57 30s74 30s45循环 END后右键设置 insert meltingcurve 后绿色运行6 反应结束后将数据导出 分析数据 反应体系的建立及优化 SYBRGreen使用浓度 太高抑制Taq酶活性 太低 荧光信号太弱 不易检测Primer 引物的特异性高 否则扩增有杂带 定量不准MgCl2 多聚酶的激活剂