RT-PCR反转录原理及方法.ppt

RT PCR原理及方法 09 10 15 背景 基因的表达 不同细胞或组织表达不同的基因 目的 通过反转录 reversetranscription RT 和聚合酶链反应 polymerasechainreaction PCR 的方法 检测目的基因在特定组织或细胞中 mRNA水平的表达丰度 原理及方法 原理及方法 步骤1 提取总RNA TRIzol法抽提总RNA1 细胞1 107或组织100mg 加1mlTRIzol 细胞用1ml加样器吹至液体澄清且无细胞团块匀浆要彻底 后转至EP管 颠倒混匀10下 室温5分钟 2 氯仿1 5体积 0 2ml 颠倒混匀10下 室温5分钟 3 4 离心12000g 15分钟 4 转上层水相 约400 l 于另一1 5mlEP管中 加等体积异丙醇 约400 l 混匀室温10分钟 5 4 离心12000g 10分钟 6 弃上清 加冰预冷的75 乙醇 用DEPC水配 1ml 7 4 离心7500g 5分钟 8 弃上清 空气干燥5 10分钟 不能完全干燥 溶于DEPC水中至20 l 可在55 60 水中 10分钟助溶 9 紫外分光光度计测总RNA浓度 步骤2 反转录 RT 逆转录反应 1 试剂浓度体积终浓度RNA23 l 11 5 l Oligo dT 150 05 g l4 l 2 l 0 005 g l混匀 离心 70 5min 2 立即冰水浴 稍离心试剂浓度体积终浓度M MLVBuffer5 8 l 4 l 1 dNTP10mM2 l 1 l 0 5mMRNasin40U l1 l 0 5 l 20 M MLV200U l2 l 1 l 200U总体积40 l 20 l 混匀 离心 42 60 90min 3 95 10min 破坏MLV 4 保存 步骤3 聚合酶链反应 PCR PCR反应 反应体系 总体积20 l 50 l 试剂浓度体积终浓度TaqBuffer10 2 l 5 l 1 dNTP10mM0 2 l 0 5 l 200uM上游引物10pmol l0 3 l 1 l 10pmol下游引物10pmol l0 3 l 1 l 10pmolcDNA模板 1 10 l Taq酶2 5U l0 3 l 1 l 2 5U lDEPC水20 l 4 3 l混匀反应条件 95 5分预变性94 30秒变性X 40秒退火72 30秒延伸72 7分终末延伸28 36循环 4 保温 步骤4 琼脂糖凝胶电泳 加1 10 lPCR产物与上样缓冲液 1 2 5 l 混匀 加样 电泳 所需材料及试剂 一 实验器具与材料 1 移液枪 1ml 200 l 20 l 10 l 2 l2 吸头 1ml 200 l 20 l3 匀浆管 5ml4 吸头台 放置1ml吸头的一个 放置20 l吸头的一个5 EP管 1 5ml 0 2ml 100 l6 试剂瓶 2个60ml的棕色试剂瓶 广口 带盖 1个125ml的白色试剂瓶 放无水乙醇 7 量筒 50ml 250ml 500ml8 容量瓶 250ml 500ml 1000ml9 试管架 5ml 1 5ml 20 l10 盐水瓶 250ml 500ml各2个备用 一个装无水乙醇 另一个装DEPC水11 铝制饭盒 4个12 塑料小饭盒 1个13 大瓷缸 2个14 锡泊纸 一卷15 卷纸 2卷16 三角烧瓶 带盖 稍大 所需材料及试剂 二 实验器具的处理与准备1 塑料制品 包括枪头 EP管 匀浆管等 先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中 将塑料制品逐个浸泡其中 其中小枪头需要吸管打入DEPC水 过夜 然后高压 再烤干备用 实验前将枪头等放入吸头台 再高压一次2 玻璃制品 泡酸过夜 冲洗干净 蒙锡纸烤干备用 DEPC水泡 洗净后先泡1 DEPC过夜 再高压 3 匀浆器 包括剪刀 镊子 先洗净后 再高温干烤 所需材料及试剂 三 试剂配制 1 DEPC水 吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1 DEPC水 放在1000ml容量瓶中静置4小时备用 2 75 乙醇 用无水乙醇 DEPC水配 然后放 20 保存 其中DEPC水需先高压 3 异丙醇 放入棕色瓶中4 氯仿 放入棕色瓶中5 琼脂糖 所需材料及试剂 四 几种缓冲液的配制 1 电泳缓冲液 Tris54g硼酸27 5g0 5MEDTA20ml pH8 0蒸溜水1000ml5 TBE 贮存液 再将5 TBE稀释10倍成0 5TBE就可以在电泳时使用 即工作液浓度 如取50ml贮存液 450ml水 500ml工作缓冲液2 上样缓冲液 0 25 溴酚蓝0 25 二甲苯青FF30 甘油6 缓冲液 4 保存 所需材料及试剂 五 琼脂糖凝胶的配制 1 1 0 1 0g琼脂糖 100ml电泳缓冲液 微波炉中火30秒至沸腾 熔化的琼脂物冷却至60 时加入10mg ml溴化乙锭 GoldenView 5 l 充分混匀 将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中 在室温下放置30 45min后进行电泳 2 1 5 同上 将琼脂糖的量改为1 5g 分辨率要求高时使用 所需材料及试剂 六 需购置的Rt PCR材料 Taq酶 含MgCl2Buffer 200udNTP 1支oligo dT 18 1ODpromegaM MLV 1支promega Buffer RNasin 1支 20 DEPC5gTrizol100ml 1瓶Invitrogen 4 Marker 10 g0 2 g mlTIANGEN 所需材料及试剂 七 引物合成1 actin 正义 5 CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC 3 反义 5 TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT 3 2 par 4 正义 5 GGGACCTCGGAACTCAAC 3 反义 5 TGTATCTGCCTGGGACTG 3 3 退火温度计算2 A T 4 G C 正反义平均数 再上下波动度 4 或 5 4 引物各合成5OD 每OD一瓶分装好5 引物稀释 加DEPC水量为 l nmol OD 管上所标OD数 100是为10pmol l浓度的引物溶液 所需材料及试剂 八 PCR产物电泳先将1 10 l左右PCR产